專利名稱：ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因的方法。
背景技術(shù)：
肌肉生成抑制素(MSTN)屬于TGF-P超家族，是骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，其活性的喪失或降低，會(huì)造成動(dòng)物肌肉的過度發(fā)育，而形成“雙肌”(double muscle).自然界中有多種動(dòng)物都有這種雙肌現(xiàn)象，包括豬、狗、牛，甚至人也有這種性狀出現(xiàn)。在自然選育的牲畜中，比利時(shí)藍(lán)牛(Belgian Blue)和皮埃蒙特牛(piedmontese)是典型的雙肌動(dòng)物。二者都是由MSTN基因發(fā)生突變造成的，前者為MSTN序列第三個(gè)外顯子中缺失了 Ilbp核苷酸，造成MSTN閱讀框發(fā)生突變，產(chǎn)生的MSTN蛋白不能夠發(fā)揮其生物活性；后者則在第一個(gè)外顯子和第三個(gè)外顯子中都發(fā)生了突變，其突變類型為堿基替換，使翻譯出的MSTN蛋白中一個(gè)亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，一個(gè)半胱氨酸突變?yōu)槔野彼?，最終造成了 MSTN蛋白失活(Kambadur, Sharma等，1997)。MSTN基因的發(fā)現(xiàn)為生物育種工作提供了新的思路。1997年McPherron等人獲得了 MSTN基因敲除的小鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)同齡的該小鼠比野生型小鼠在體重上增加30%,而且在成年鼠中，該表型不受年齡和性別的影響(McPherron, Lawler等，1997)。目前，國內(nèi)肉牛品種中缺乏這種“雙肌”的品種，如果能夠獲得這種MSTN突變型的肉牛品種，則能夠提高我國的肉牛品質(zhì)，增加肉牛飼養(yǎng)的收益。通過常規(guī)育種方式能夠獲得MSTN突變型肉牛，但是該技術(shù)選育速度慢，性狀遺傳不穩(wěn)定。基因打靶技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種對細(xì)胞遺傳信息進(jìn)行修飾、修改，或者將外源基因?qū)氲霓D(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得基因打靶的細(xì)胞后，再通過體細(xì)胞核移植技術(shù)和胚胎移植技術(shù)，可以最終獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。這種`方法能夠在一到兩個(gè)代次內(nèi)獲得具有穩(wěn)定遺傳性狀的個(gè)體，大大提高了動(dòng)物改良和選育的速度。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)效率約10_7，效率較低，并且需要經(jīng)過多種手段的篩選，最終得到的細(xì)胞代次高，細(xì)胞狀態(tài)差。近年來，研究者將特異性識(shí)別DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)(Zinc finger)與非特異性切割DNA鏈的核酸酶相結(jié)合,開發(fā)出了能夠?qū)蚪M的某一特異性位點(diǎn)識(shí)別并切割的鋅指核酶(Zinc finger nuclease)。由鋅指核酶介導(dǎo)的基因剪切具有較高的效率，能夠達(dá)到10_2的水平，并且鋅指核酶介導(dǎo)的同源重組效率高于傳統(tǒng)的打靶技術(shù)。目前，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物、線蟲、魚、鳥類，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因修飾和轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)研究中。而在針對牛MSTN基因的敲除和打靶上尚未有報(bào)道。魚油里的長鏈不飽和脂肪酸《-3已經(jīng)被證實(shí)有益于人類健康。動(dòng)物肉類產(chǎn)品中包含有少量的食物(谷物)來源的《_3和大量的《 _6，高含量的《-6是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈硬化、癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎以及抑郁癥發(fā)生的主要原因之一。家畜體內(nèi)由于缺少脂肪酸去飽和酶基因而不能將《_6轉(zhuǎn)化成《_3，而低等動(dòng)物線蟲中具有行使這種轉(zhuǎn)化功能的fat-1基因。將線蟲fat-1基因經(jīng)人源化修飾后的hfat-1基因，轉(zhuǎn)入小鼠和豬，結(jié)果轉(zhuǎn)基因小鼠和豬的肌肉里，《_3與《-6的比率可以提高至5倍。最近，有報(bào)道稱成功培育了 fat-1轉(zhuǎn)基因奶牛，但fat-1轉(zhuǎn)基因肉牛的研究上未見報(bào)道。利用鋅指核酶敲除肉牛MSTN基因，同時(shí)在鋅指核酶切割位點(diǎn)定點(diǎn)整合hfat-1基因的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因(如hfat-1基因)的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因的方法，其是根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計(jì)ZFNs特異位點(diǎn)表達(dá)載體，并根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞；其中，設(shè)計(jì)特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。前述的方法，ZFNs作用的DNA序列優(yōu)選位于牛MSTN基因的第2外顯子和/或第3外顯子上。前述的方法，ZFNs作用的 DNA 序列為:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。前述的方法，所述打靶載體含有根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。 前述的方法 ，所述外源基因?yàn)橹舅崛ワ柡兔竑at-1基因，或fat-1基因經(jīng)過人源化修飾后的基因(hfat-1基因)。前述方法包括如下步驟:方案1:I)構(gòu)建bZFN-1和bZFN-2表達(dá)載體，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示；2)根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-1,其堿基序列如SEQ ID NO: 5所示；3)將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，通過PCR產(chǎn)物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞；和/或方案I1:I)構(gòu)建bZFN-3和bZFN-4表達(dá)載體，它們的堿基序列分別如SEQ ID N0:3和SEQID NO:4 所示；2)根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-2,其堿基序列如SEQ ID N0:6所示；3)將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，通過PCR產(chǎn)物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞。本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法獲得的牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞。本發(fā)明還提供上述方法在生產(chǎn)牛MSTN基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的克隆牛中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種制備牛MSTN基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的?？寺∨咛サ姆椒?，其以上述牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得?？寺∨咛ァ１景l(fā)明還提供一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將通過上述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。具體地，本發(fā)明是從GenBank中獲得MSTN全長DNA序列，針對第二外顯子設(shè)計(jì)兩套鋅指核酶載體，分別命名為bMK-1和bMK-1I，其中bMK-1包括bZFN_l、bZFN_2兩個(gè)質(zhì)粒，bMK-1I包括bZFN-3和bZFN-4兩個(gè)質(zhì)粒(由Sigma-Aldrich公司完成)，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法，將兩套鋅指核酶載體分別導(dǎo)入不同的牛胎兒成纖維細(xì)胞中，再挑取單細(xì)胞建立多個(gè)單細(xì)胞株，將同一細(xì)胞株分為兩部分，分別傳代和凍存，對傳代的細(xì)胞株提取基因組，使用跨作用位點(diǎn)的PCR檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，最終得到在鋅指核酶作用位點(diǎn)發(fā)生突變細(xì)胞株。從牛成纖維細(xì)胞獲得基因組DNA，根據(jù)GenBank中報(bào)道的MSTN全長序列，分別設(shè)計(jì)針對鋅指核酶作用位點(diǎn)的同源臂引物，通過PCR擴(kuò)增出同源臂，通過連接克隆載體并進(jìn)行限制酶切和測序鑒定為正確序列后，采用酶切和連接的方法將5’同源臂和3’同源臂分別連接到基礎(chǔ)載體pCAGG-hfat-1-BGHpA的預(yù)期位置，最后通過限制酶酶切鑒定同源臂的正確性，最終獲得針對bMK-1作用位點(diǎn)的打靶載體pflrk-1和針對bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體pflrk-2 (構(gòu)建過程參見圖1和圖2)。MSTN基因的編碼序列在進(jìn)化中高度保守，整個(gè)基因包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中第二個(gè)外顯子是編碼MSTN蛋白的主要區(qū)域。牛的MSTN基因位于2號(hào)染色體的近著絲粒距離TGLA44 (微衛(wèi)星標(biāo)記，ms) 3.1cM位置，包括6628個(gè)堿基，3個(gè)外顯子分別位于1-506,2335-2708和4741-6628位置。設(shè)計(jì)的`兩套鋅指核酶載體bMK_I和bMK-1I包含針對牛MSTN第二外顯子序列的CMV啟動(dòng)子ZFN基因和卡那霉素抗性基因(KanD。bMK_I的作用位點(diǎn)為 CTCATCAAACCCATGAaagacggTACAAGGTATACTGG，位于 SEQ ID NO:7 所示的牛 MSTN 基因 2487-2524bp，bMK-1I 的作用位點(diǎn)為 ITCCCAGAACcaggaGAAGATGGACTGGTA位于 SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2682-271 lbp，小寫字母部分為鋅指核酶的切割位置，大寫字母部分為鋅指識(shí)別位點(diǎn)。兩個(gè)作用位點(diǎn)都位于MSTN基因的第二外顯子內(nèi)?；A(chǔ)載體pCAGG-hfat-1-BGHpA包括CAGG啟動(dòng)子下的人源化fat_l基因和PGK啟動(dòng)子下的新霉素抗性基因(Nec/)，以及新霉素抗性表達(dá)框架兩側(cè)的LoxP位點(diǎn)。其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。本發(fā)明提供的打靶載體pflrk-1是針對bMK-1作用位點(diǎn)的打靶載體，在CAGG啟動(dòng)子上游包含長885bp的5’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的1603-2487，在Neolr表達(dá)框架下游包含長823bp的3’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2520_3342bp。同源臂序列位于bMK-1作用位點(diǎn)兩側(cè)，且不包含bZFN-1和bZFN-2的鋅指識(shí)別位點(diǎn)。其全序列如SEQ ID NO:5所示。當(dāng)pflrk-1與bMK_I共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，bMK_I在識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生剪切，經(jīng)同源重組作用，基因組以Pflrk-1為模板，將外源基因靶向整合到目的區(qū)域。上述pflrk-1載體的同源臂引物，包括5’同源臂和3’同源臂的上游引物和下游引物兩組。具體序列如下(5' -3'):
5’ 同源臂上游引物:LH-1U:ACGCGTATCCTGGAATAGATTTGCCTTACT5’ 同源臂下游引物:LH-1D:ACGCGTGGATTTGCACAAACACTGTCGC3’ 同源臂上游引物:RH-1U:GCTAGCATCCGATCTCTGAAACTTGAC3’ 同源臂下游引物:RH-1D:GCTAGCTTTTAATTTTACCAGGGGTAATT本發(fā)明提供的打靶載體pflrk-2是針對bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體，在CAGG啟動(dòng)子上游包含長885bp的5’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因1799_2682bp，在Neolr表達(dá)框架下游包含長826bp的3’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2707-3532bp。同源臂序列位于bMK-1I作用位點(diǎn)兩側(cè)，并且不包含bZFN_3和bZFN_4的鋅指識(shí)別位點(diǎn)。其全序列如SEQ ID N0:6所示。當(dāng)pflrk-2與bMK-1I共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，bMK-1I在識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生剪切，經(jīng)同源重組作用，基因組以pflrk-2為模板，將外源基因靶向整合到目的區(qū)域。上述pflrk-2載體的同源臂引物，包括5’同源臂和3’同源臂的上游引物和下游引物兩組。具體序列如下(5' -3'):5’ 同源臂上游引物:LH-2U:ACGCGTTGTCCCAGCGTCCTAACATAACA5’ 同源臂下游引物:LH-2D:ACGCGTCAGCAAGATCATGGCCATTCTC3’ 同源臂上游引物:RH-2U:GCTAGCGTGATTACTGAAAATAACATGC3 ’ 同源臂下游引物:RH-2D:GCTAGCGAAGAGTGAGTAGCTCTAAAC本發(fā)明提供的MSTN基因敲除方法包括以下步驟:1、牛成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)；2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將bMK-1和bMK-1I分別轉(zhuǎn)染到步驟I中培養(yǎng)的牛成纖維細(xì)胞中；3、利用直徑約IOiim的口吸管，從步驟2中轉(zhuǎn)染的牛成纖維細(xì)胞中挑取細(xì)胞單克隆并傳代培養(yǎng)，提取基因組；4、利用PCR方法對步驟3中的基因組進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過測序的方法鑒定得到陽性敲除細(xì)胞；5、對步驟4中獲取的陽性敲除細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)一步利用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體后進(jìn)行測序和比對分析，最終獲得突變的詳細(xì)信息。其中，步驟4中使用的PCR引物為(5' -3'):突變檢測上游引物:61:GATTGATATGGAGGTGTTCGTT突變檢測下游引物:62:ACTAGAATCCACTGTGAAGACTPCR反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供的針對bMK-1作用位點(diǎn)的打祀載體pflrk-1的主要構(gòu)建步驟如下:A、提取牛成纖維細(xì)胞基因組DNA ;B、利用引物L(fēng)H-1U和LH-1D，從步驟A中的基因組DNA中克隆MSTN的5’同源臂，利用引物RH-1U和RH-1D從步驟A中的基因組DNA中克隆MSTN的3’同源臂；C、將同源臂連接到克隆載 體中，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析和測序分析鑒定；D、將鑒定正確的同源臂連接到基礎(chǔ)載體中，構(gòu)建得到針對bMK-1作用位點(diǎn)的打靶載體 pflrk-1。其中，步驟B中采用PCR方法擴(kuò)增5’同源臂的反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；3’同源臂的反應(yīng)條件為:5°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供的針對bMK-1I用位點(diǎn)的打祀載體pflrk-2的主要構(gòu)建步驟與pflrk-1相似，其中步驟B中的引物為LH-2U和LH-2D克隆MSTN的5 ’同源臂，利用引物RH-2U和RH-2D克隆MSTN的3’同源臂；連入骨架載體后，構(gòu)建得到針對bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體pflrk-2，其中5’同源臂的反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；3’同源臂的反應(yīng)條件為:5°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。G418 (Geneticin selective antibiotic418)是一種抗生素類藥物，當(dāng) Neor 基因進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞獲得抗性，而在G418培養(yǎng)基中可以生長，而未獲得抗性的細(xì)胞則在G418培養(yǎng)基中死亡。G418這一特性已在轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除等方面廣泛應(yīng)用。本發(fā)明提供的基因敲除方法，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將bMK-1和bMK-1I分別導(dǎo)入到牛胎兒成纖維細(xì)胞中，進(jìn)入細(xì)胞后的載體分別表達(dá)鋅指核酶，鋅指核酶由特異性識(shí)別DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)域和非特異性的DNA剪切結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成，鋅指核酶能夠在細(xì)胞中特異性識(shí)別靶向位點(diǎn)，并在該位點(diǎn)將DNA剪切，形成雙鏈斷裂，并啟動(dòng)DNA的自我修復(fù)機(jī)制。DNA可以通過兩種不同的途徑修復(fù)，第一種為同源重組，損傷的DNA可以以等位基因?yàn)槟０?，修?fù)DNA損傷，這種修復(fù)方式產(chǎn)生的DNA與原來的沒有區(qū)別，不會(huì)發(fā)生突變；另一種為非同源性末端修復(fù)，損傷的DNA不以其他等位基因?yàn)槟０?，隨機(jī)對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，這種修復(fù)方式會(huì)產(chǎn)生DNA的堿基缺失或插入突變，最終造成基因的突變。bMK-1和bMK-1I分別針對MSTN基因的第二外顯子的不同序列，能夠在其針對位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，引起DNA的修復(fù)，而產(chǎn)生突變。對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用口吸管挑取單細(xì)胞，分別接種在96孔板中， 經(jīng)過傳代和提取基因組，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序分析，最終得到發(fā)生突變的細(xì)胞系。本發(fā)明還提供一種基因打靶的方法，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，分別將bMK-1和pflrk-1、bMK-1I和pflrk-2共同導(dǎo)入到牛胎兒成纖維細(xì)胞中，鋅指核酶在靶向位點(diǎn)對DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，基因組在進(jìn)行同源修復(fù)時(shí)，以打靶載體為模板將外源基因整合至向位點(diǎn)。外源基因帶有Nec/，使細(xì)胞在含有G418的培養(yǎng)液中存活，在經(jīng)過G418的篩選后，挑取細(xì)胞單克隆，經(jīng)過PCR檢測和測序的方法，得到打靶的細(xì)胞系。同時(shí)整合了外源基因的細(xì)胞，其MSTN基因因?yàn)橥庠椿虻牟迦耄荒苷_表達(dá)MSTN蛋白，同時(shí)達(dá)到敲除MSTN基因的目的。本發(fā)明進(jìn)一步提供鋅指核酶介導(dǎo)的基因敲除和基因打靶在培育肉用牛品種的應(yīng)用。本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果:(一)與常規(guī)同源重組方法相比，本發(fā)明的鋅指核酶介導(dǎo)的基因敲除效率顯著提聞。(二)可實(shí)現(xiàn)不同外源基因在同一位點(diǎn)的定點(diǎn)插入。(三)可用于不同牛種的MSTN基因敲除。(四)在遺傳育種過程中不會(huì)引入抗性基因，保證育種安全。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中pflrk-1載體構(gòu)建流程圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中pflrk-2載體構(gòu)建流程圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中ZFN介導(dǎo)的基因打靶過程示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中MSTN基因同源臂pMD19-T_LA_l和pMD19T_LA_2載體酶切圖；其中，Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ladder (Transgen公司)；M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)200bp ladder (Takara公司);1_3為來自3個(gè)不同菌落的pMD19-T_LA_2質(zhì)粒的酶切結(jié)果，其中1、2泳道產(chǎn)生大小為213bp和3363bp的片段，3泳道產(chǎn)生大小為737bp和2839bp的片段；4_6為來自3個(gè)不同菌落的PMD19-T-LA-1質(zhì)粒的酶切結(jié)果，其中4、6泳道產(chǎn)生大小為542pb和3035bp的片段，5泳道產(chǎn)生大小為409pb和3168bp的片段；7_9為來自3個(gè)不同菌落的PMD19-T-RA-2質(zhì)粒的酶切結(jié)果，其中7、9泳道產(chǎn)生大小為608bp和2910bp片段，8泳道產(chǎn)生大小為297bp和3221bp片段；10_12為來自3個(gè)不同菌落的pMD19_T-RA_l質(zhì)粒的酶切結(jié)果，其中10泳道產(chǎn)生大小為418bp和3097bp片段，11泳道產(chǎn)生大小為484bp和3031bp片段，12泳道在小片段處產(chǎn)生了兩個(gè)片段，大小分別為484bp和418bp (可能由菌落不單一引起)。圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中中間載體pf 1-1、pf 1-2酶切鑒定圖；其中，Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) A-HindIII digest (Takara 公司)；M2 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)入 _EcoT14I digest(Takara公司)；M3為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)200bp ladder (Takara公司)；1-2為來自2個(gè)不同菌落的Pfl-1質(zhì)粒酶切結(jié)果，產(chǎn)生大小為4692bp、2263bp、1277bp和682bp的片段，為同源臂正向連接結(jié)果；3-5為來自3個(gè)不同菌落的pfl-2質(zhì)粒酶切結(jié)果，其中3泳道產(chǎn)生大小為5020bp、1934bp、1277bp和682bp片段，為同源臂反向連接結(jié)果，4和5泳道產(chǎn)生大小為4496bp、2458bp、1277bp 和 682bp 片段，圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中打靶載體pflrk-1、pflrk-2酶切圖；其中，Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Trans5K DNA Marker(TransGen 公司);M2 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)入-HindIII digest(Takara公司);1_3為來自3個(gè)不同菌落的pflrk-1質(zhì)粒酶切結(jié)果,其中I為一條酶切條帶，說明質(zhì)粒不正確，2和3產(chǎn)生大小為1788bp和7943bp的酶切片段；4_6為來自3個(gè)不同菌落的pflrk-2質(zhì)粒酶切結(jié)果，都產(chǎn)生大小為3661bp、2263bp、1851bp、1277bp、628bp的片段。圖7為本發(fā)明實(shí)施例8中打靶載體pflrk-l、pflrk_2酶切圖；其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)入-HindIII digest (Takara公司)；1為pflrk-1質(zhì)粒；2為pflrk-2質(zhì)粒；3為線性化的pflrk-1質(zhì)粒，產(chǎn)物大小為9731bp ；4為線性化的pflrk-2質(zhì)粒，產(chǎn)物大小為9734bp。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1 ZFN表達(dá)載體的構(gòu)建從GenBank中獲得MSTN全長DNA序列， 針對第二外顯子設(shè)計(jì)兩套鋅指核酶載體，分別命名為bMK-1和bMK-1 I，其中bMK-1包括bZFN_l、bZFN_2兩個(gè)質(zhì)粒，bMK_I I包括bZFN_3和bZFN-4兩個(gè)質(zhì)粒(由Sigma-Aldrich公司完成)，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法，將兩套鋅指核酶載體分別導(dǎo)入不同的牛胎兒成纖維細(xì)胞中，再挑取單細(xì)胞建立多個(gè)單細(xì)胞株，將同一細(xì)胞株分為兩部分，分別傳代和凍存，對傳代的細(xì)胞株提取基因組，使用跨作用位點(diǎn)的PCR檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，最終得到在鋅指核酶作用位點(diǎn)發(fā)生突變細(xì)胞株。從牛成纖維細(xì)胞獲得基因組DNA，根據(jù)GenBank中報(bào)道的MSTN全長序列，分別設(shè)計(jì)針對鋅指核酶作用位點(diǎn)的同源臂引物，通過PCR擴(kuò)增出同源臂，通過連接克隆載體并進(jìn)行限制酶切和測序鑒定為正確序列后，采用酶切和連接的方法將5’同源臂和3’同源臂分別連接到基礎(chǔ)載體pCAGG-hfat-1-BGHpA的預(yù)期位置，最后通過限制酶酶切鑒定同源臂的正確性，最終獲得針對bMK-1作用位點(diǎn)的打靶載體pflrk-1和針對bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體pflrk-2 (構(gòu)建過程見圖1和圖2)。MSTN基因的編碼序列在進(jìn)化中高度保守，整個(gè)基因包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中第二個(gè)外顯子是編碼MSTN蛋白的主要區(qū)域。牛的MSTN基因位于2號(hào)染色體的近著絲粒距離TGLA44 (微衛(wèi)星標(biāo)記，ms) 3.1cM位置，包括6628個(gè)堿基，3個(gè)外顯子分別位于1-506,2335-2708和4741-6628位置。設(shè)計(jì)的兩套鋅指核酶載體bMK_I和bMK-1I包含針對牛MSTN第二外顯子序列的CMV啟動(dòng)子ZFN基因和卡那霉素抗性基因(KanD。bMK_I的作用位點(diǎn)為 CTCATCAAACCCATGAaagacggTACAAGGTATACTGG，位于 SEQ ID NO:7 所示的牛 MSTN 基因 2487-2524bp，bMK-1I 的作用位點(diǎn)為 ITCCCAGAACcaggaGAAGATGGACTGGTA位于 SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2682-271 lbp，小寫字母部分為鋅指核酶的切割位置，大寫字母部分為鋅指識(shí)別位點(diǎn)。兩個(gè)作用位點(diǎn)都位于MSTN基因的第二外顯子內(nèi)?；A(chǔ)載體pCAGG-hfat-1-BGHpA包括CAGG啟動(dòng)子下的人源化fat_l基因和PGK啟動(dòng)子下的新霉 素抗性基因(Nec/)，以及新霉素抗性表達(dá)框架兩側(cè)的LoxP位點(diǎn)。其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。本發(fā)明提供的打靶載體pflrk-1是針對bMK-1作用位點(diǎn)的打靶載體，在CAGG啟動(dòng)子上游包含長885bp的5’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的1603-2487，在Neolr表達(dá)框架下游包含長823bp的3’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2520_3342bp。同源臂序列位于bMK-1作用位點(diǎn)兩側(cè)，且不包含bZFN-1和bZFN-2的鋅指識(shí)別位點(diǎn)。其全序列如SEQ ID NO:5所示。當(dāng)pflrk-1與bMK_I共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，bMK_I在識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生剪切，經(jīng)同源重組作用，基因組以Pflrk-1為模板，將外源基因靶向整合到目的區(qū)域。本發(fā)明提供的打靶載體pflrk-2是針對bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體，在CAGG啟動(dòng)子上游包含長885bp的5’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因1799_2682bp，在Neolr表達(dá)框架下游包含長826bp的3’同源臂，位于SEQ ID NO:7所示的牛MSTN基因2707-3532bp。同源臂序列位于bMK-1I作用位點(diǎn)兩側(cè)，并且不包含bZFN_3和bZFN_4的鋅指識(shí)別位點(diǎn)。其全序列如SEQ ID NO:6所示。當(dāng)pflrk-2與bMK-1I共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，bMK-1I在識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生剪切，經(jīng)同源重組作用，基因組以pflrk-2為模板，將外源基因靶向整合到目的區(qū)域。ZFN介導(dǎo)的基因打靶過程示意圖如圖3所示。實(shí)施例2牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的提取將培養(yǎng)于IOOmm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化后，離心收集，采用Wizard Genomic DNAPurification Kit試劑盒(Promega公司),按照提取細(xì)胞基因組的方法,進(jìn)行?；蚪MDNA提取，最后用IOOii L超純水回溶DNA。利用紫外分光光度計(jì)檢測提取DNA的濃度和純度，用于后續(xù)工作。實(shí)施例3 MSTN 基因同源臂 pMD19-T_LA_l 和 pMD19T_LA_2、pMD19_T-RA_l 和PMD19T-RA-2 的構(gòu)建
根據(jù)模板序列GenBank 中 Accession N0.NC_007300.5,分別設(shè)計(jì)針對bMK-1位點(diǎn)打靶載體的5’同源臂(位于SEQ ID NO:1的1609-248lbp)的上游引物 LH-1U (ACGCGTATCCTGGAATAGATTTGCCTTACT)和下游引物 LH-1D(ACGCGTGGATTTGCACAAACACTGTCGC):針對bMK-1 位點(diǎn)打靶載體的 3’ 同源臂(位于 SEQ ID NO:7 的 2526-3336bp)的上游引物 RH-1U (GCTAGCATCCGATCTCTGAAACTTGAC)和下游引物 RH-1D(GCTAGCTTTTAATTTTACCAGGGGTAATT):針對 bMK-1I 位點(diǎn)打靶載體的 5’ 同源臂(位于 SEQ IDNO:7 的 1805-2676bp )的上游引物 LH-2U (ACGCGTTGTCCCAGCGTCCTAACATAACA)和下游引物L(fēng)H-2D (ACGCGTCAGCAAGATCATGGCCATTCTC):針對 bMK_I 位點(diǎn)打靶載體的 3’ 同源臂(位于 SEQID NO:7 的 2713-3526bp)的上游引物 RH-2U (GCTAGCGTGATTACTGAAAATAACATGC)和下游引物RH-2D (GCTAGCGAAGAGTGAGTAGCTCTAAAC):下劃線部分為酶切位點(diǎn)。以上述牛基因組DNA為模板，分別進(jìn)行PCR合成同源臂。PCR反應(yīng)體系(20ii L):上、下游引物各I U L，模板lyL，10X反應(yīng)2 ii L，
2.5mMdNTPs 1.6u L, EX-Taq 0.2 u L, ddH20 13.2 y L。針對bMK-1位點(diǎn)打靶載體的5’同源臂PCR反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；3’同源臂的反應(yīng)條件為:5°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。針對bMK-1I位點(diǎn)打靶載體的5’同源臂PCR反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；3’同源臂的反應(yīng)條件為:5°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物分別連接到pMD 19-T載體(Takara公司)上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a，分別挑取陽性連接菌落進(jìn)行擴(kuò)培和質(zhì)粒提取，最終獲得pMD19_T-LA_l和pMD19T-LA-2、pMD19-T-RA-l 和 pMD19T_RA_2 四種同源臂質(zhì)粒。實(shí)施例4同源臂的酶切鑒定和測序分析分別提取四種同源臂質(zhì)粒各I U L，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，四種同源臂質(zhì)粒中都有兩個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，一個(gè)位于PMD19-T載體的多克隆位點(diǎn)中，另外一個(gè)位于同源臂內(nèi)部，可以初步檢測PCR獲得的同源臂的正確性(圖4)。酶切體系均為IOyL:同源臂質(zhì)粒Iu L，10 X Bufferl iiL，內(nèi)切酶0.5 iiL，ddH207.5 u L0將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序分析，并與GenBank中的牛MSTN基因序列比對，最終確定同源臂序列的正確性。實(shí)施例5 5’同源臂連入基礎(chǔ)載體將測序正確的同源臂質(zhì)粒pMD19-T-LA-l和pMD19_T-LA_2，以及基礎(chǔ)載體pCAGG-hfat-1-BGHpA分別用限制性內(nèi)切酶MluI進(jìn)行酶切，酶切體系如前，分別回收PMD19-T-LA-1的879bp片段和pMD19_T-LA_2的879bp片段，以及骨架載體的線性化片段，然后將 PMD19-T-LA-1 和 pMD19-T-LA-2 分別與 pCAGG-hfat-l-BGHpA 按照摩爾比 2:1 的比例在16°C條件下，經(jīng)T4DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli，提取質(zhì)粒分別命名為pfl_l和pfl-2。利用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切鑒定連接的方向和正確性(圖5)，并最終確定5’同源臂正確連入基礎(chǔ)載體。實(shí)施例6 3’同源臂連入基礎(chǔ)載體將測序正確的pMD19-T-RA-l和pMD19T_RA_2，以及中間載體pfl_l和pfl_2分別用限制性內(nèi)切酶NheI進(jìn)行酶切，酶切體系如前，分別回收PMD19-T-RA-1的817bp片段和pMD19-T-RA-2的820bp片段，以及中間載體pfl_l和pfl_2的線性化片段，然后將PMD19-T-RA-1與中間載體pfl-1，pMD19-T-RA-2與中間載體pfl_2分別按照摩爾比2:1的比例在16°C條件下，經(jīng)T4DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli，提取質(zhì)粒分別命名為pflrk-1和pflrk-2。分別利用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切鑒定連接的方向和正確性(圖
6)，并最終確定3’同源臂正確連入載體。最終成功獲得分別針對于bMK-1和bMK-1I作用位點(diǎn)的打靶載體。實(shí)施例7 MSTN基因敲除將魯西黃牛胎兒成纖維細(xì)胞分別傳代至24孔板的多個(gè)孔中，密度為6X104個(gè)/孔，38.5°C，5%C02條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后用于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。首先將800ng質(zhì)粒 DNA (bZFN-1400ng+bZFN-2400ng 或 bZFN-3400ng+bZFN_4400ng)用 Opt1-MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen, Cat.31985)稀釋至 100 U L,再加入 2 u L 的脂質(zhì)體 LTX (Invitrogen,Cat.15338)輕輕混勻后，室溫靜置30分鐘。將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)液換為Opt1-MEM，然后把脂質(zhì)體LTX-DNA混合物均勻滴加在細(xì)胞培養(yǎng)孔中。于38.5°C，5%C02條件下孵育4_6個(gè)小時(shí)，再將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為DMEM+10%FBS培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞消化重懸于PBS中，于體視顯微鏡下用自制口吸管吸取單個(gè)細(xì)胞，分別接種于含200 u L培養(yǎng)液/孔的96孔板中培養(yǎng)，并于第3天、第5天和第8天對培養(yǎng)板換液。在第10天時(shí)將培養(yǎng)板中生長的細(xì)胞單克隆傳代至24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天后，將細(xì)胞單克隆一部分凍存，另一部分提取基因組進(jìn)行鑒定。以牛MSTN基因組序列為模板，設(shè)計(jì)基因敲除檢測PCR引物，利用PCR法和DNA測序檢測細(xì)胞基因組突變。PCR引物為(5' -3'):突變檢測上游引物:61:GATTGATATGGAG`GTGTTCGTT突變檢測下游引物:62:ACTAGAATCCACTGTGAAGACTPCR反應(yīng)條件為:95°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，如果在鋅指核酶作用位點(diǎn)處產(chǎn)生兩個(gè)擴(kuò)增信號(hào)，則在測序圖譜中產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象，可以確定為發(fā)生基因突變。進(jìn)一步使用該引物擴(kuò)增，并將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物連入PMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli，挑取10個(gè)細(xì)菌菌落，并闊培進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與野生型MSTN基因組進(jìn)行比對，最終可以確定突變體的突變類型。進(jìn)而將突變體細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的供體，進(jìn)行牛體細(xì)胞克隆及胚胎移植，獲得MSTN基因敲除動(dòng)物。實(shí)施例8 pflrk-1、pflrk-2 基因打靶用限制性內(nèi)切酶BstBI于65 °C酶切打靶載體pflrk-1和pflrk_25小時(shí)，將其線性化處理(圖7)，取牛胎兒成纖維細(xì)胞，分別與組合I (bMKI+pfIrk-1)和組合2(bMKII+pflrk-2)混勻，電擊轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染條件:細(xì)胞密度1.5X IO5個(gè)/mL，體積150 yL，質(zhì)粒含量2.5 ii g，其中鋅指核酶質(zhì)粒各I ii g，打靶載體I y g，在4mm電極杯中，以500V電壓4ms電擊時(shí)間，電擊2次)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至6孔板的一個(gè)孔中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)加入G418進(jìn)行藥物篩選，篩選第7天后，將細(xì)胞消化重懸于PBS中，于體視顯微鏡下用自制口吸管吸取單個(gè)細(xì)胞，分別接種于含200 u L培養(yǎng)液/孔的96孔板中培養(yǎng)，并于第3、5和8天對培養(yǎng)板換液。在第10天時(shí)將培養(yǎng)板中生長的細(xì)胞單克隆傳代至24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天后，將細(xì)胞單克隆一部分凍存，另一部分提取基因組進(jìn)行鑒定。
以基因組染色體定點(diǎn)整合序列為模板，設(shè)計(jì)跨越5’同源臂序列的PCR引物，利用PCR法和DNA測序檢測同源重組事件。PCR擴(kuò)增使用的引物如下(5' -3'):RATKU: CGATGCCTGCTTGCCGAATARATKD:AGGAAGGTAGAGGGATGAAGATAGTGGPCR反應(yīng)條件為:95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán)。當(dāng)檢測的序列同時(shí)包含MSTN基因5’同源臂上游序列、5’同源臂序列以及hfat-1基因時(shí)，則能夠擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)過測序檢測正確后，則認(rèn)為該細(xì)胞是中靶細(xì)胞，外源基因hfat-1成功整合到靶向位點(diǎn)。將該細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的供體，進(jìn)行牛體細(xì)胞克隆及胚胎移植，最終獲得MSTN基因敲除，并整合表達(dá)hfat-1基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些`修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.FNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因的方法，其特征在于，其是根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計(jì)ZFNs特異位點(diǎn)表達(dá)載體，并根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞；其中，設(shè)計(jì)特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列位于牛MSTN基因的第2外顯子和/或第3外顯子上。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列為:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述打靶載體含有根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。
5.據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述外源基因?yàn)橹舅崛ワ柡兔竑at-1基因，或fat-1基因經(jīng)過人源化修飾后的基因。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 方案1: 1)構(gòu)建bZFN-1和bZFN-2表達(dá)載體，它們的堿基序列分別如SEQID NO:1和SEQ IDN0:2所示； 2)根據(jù)ZFNs 作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-1，其堿基序列如SEQ ID N0:5所示； 3)將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中,通過PCR產(chǎn)物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞；和/或 方案II: 1)構(gòu)建bZFN-3和bZFN-4表達(dá)載體，它們的堿基序列分別如SEQID NO:3 SEQ IDNO:4所示； 2)根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-2，其堿基序列如SEQ ID NO:6所示； 3)將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中,通過PCR產(chǎn)物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞。
7.據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法獲得的牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞。
8.利要求1-6任一項(xiàng)所述方法在生產(chǎn)牛MSTN基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的克隆牛中的應(yīng)用。
9.種制備牛MSTN基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的牛克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求7所述牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得牛克隆胚胎。
10.種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將權(quán)利要求9所述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合外源基因的方法，根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計(jì)ZFNs特異位點(diǎn)表達(dá)載體，并根據(jù)ZFNs作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達(dá)載體和打靶載體共同轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因的細(xì)胞；其中，設(shè)計(jì)特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。本發(fā)明構(gòu)建的鋅指核酶介導(dǎo)的打靶載體為牛MSTN基因敲除和外源基因的定點(diǎn)插入提供了一種簡便快速的途徑，對“雙肌”肉牛新品種的遺傳育種具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/877GK103088046SQ201310026258
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李榮鳳, 李雪玲, 趙宇航, 云亭, 梁浩 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)