專利名稱：與大口黑鱸孵化率相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種與大口黑鱸孵化率相關(guān)的分子標(biāo)記及其在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大口黑S盧{Microp terus salmoides ),俗名加州S盧,原產(chǎn)于美國(guó)密西西比河流域，屬?gòu)V溫性魚類，具有生長(zhǎng)快、病害少、耐低溫、肉質(zhì)鮮美和容易起捕等特點(diǎn)，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一。目前我國(guó)養(yǎng)殖的大口黑鱸是由野生引進(jìn)種家養(yǎng)馴化而成的，且養(yǎng)殖20多年來，由于不注重親本留種需遵守的操作規(guī)程，缺乏定向人工選育，致使大口黑鱸種質(zhì)的質(zhì)量急劇下降，主要表現(xiàn)在餌料轉(zhuǎn)化率低、個(gè)體生長(zhǎng)緩慢、苗種孵化率低等，大口黑鱸苗種的質(zhì)量直接關(guān)系到大口黑鱸養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，在一定程度上影響大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。魚苗孵化率高低是直接影響育苗場(chǎng)魚苗產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。提高魚苗的孵化率在一定程度上降低孵化生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。大口黑鱸魚卵的孵化率受繁殖親魚質(zhì)量及外部環(huán)境條件等多種因素影響，其中提高大口黑鱸繁殖親本的質(zhì)量來提高大口黑鱸魚苗孵化率是可控的重要方法之一。普通生產(chǎn)上提高魚苗孵化率往往是通過挑選個(gè)體大、身體健壯的成魚作為繁殖用親本，在專池中進(jìn)行強(qiáng)化培育，采用投喂優(yōu)質(zhì)飼料，適時(shí)換水等手段促進(jìn)親魚成熟，這種傳統(tǒng)方法僅從表型上去判斷親本的質(zhì)量往往達(dá)不到理想的結(jié)果，無法從分子水平上剔除具有基因缺陷的親本，從根本上來保障親本的質(zhì)量。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記因其具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)日益成為遺傳育種研究中首選的遺傳標(biāo)記。若將這些遺傳標(biāo)記與生產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)在一起，即可實(shí)現(xiàn)從DNA水平上進(jìn)行選擇育種，克服了傳統(tǒng)方法受人為因素影響大的不足，提高了選擇的準(zhǔn)確性。但是，現(xiàn)在仍未發(fā)現(xiàn)與大 口黑鱸孵化相關(guān)的分子標(biāo)記，影響了大口黑鱸高孵化率親本的篩選效果。促生長(zhǎng)激素釋放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)是由下丘腦分泌的一種胰高血糖素超家族多肽激素，其主要生物學(xué)功能是刺激垂體細(xì)胞合成、分泌生長(zhǎng)激素。此外，其在胚胎期對(duì)細(xì)胞增殖分化，腦垂體形成等也有重要作用(Mayo et al.，1985 ;Mayo et al., 2000 ；Billestrup et al.,1986)。研究表明，GHRH及其受體的自然缺失或異常會(huì)導(dǎo)致諸如侏儒癥，巨人癥之類的現(xiàn)象(Desai et al.,2005 ；Sanno et al.，1997);通過外源適度增加GHRH的含量能夠促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)(Zhang et al.，2008)。由于GHRH與動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀具有緊密的聯(lián)系，使之成為理想的分子標(biāo)記育種候選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與大口黑鱸孵化率相關(guān)的分子標(biāo)記及其在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A，其位于大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列上的第97 162bp0所述大口黑鱸GHRH基因1啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示，其第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A的序列如SEQ ID N0:2所示。大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A作為分子標(biāo)記在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應(yīng)用。一種輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的方法，包括檢測(cè)大口黑鱸樣品的基因組DNA，篩選含有隱性缺失致死基因片段A的純合體即可。具體包括如下步驟:
1)根據(jù)權(quán)利要求1所述基因片段A的5’和3’側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)并合成引物；
2)利用步驟I)的引物對(duì)大口黑鱸樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果篩選親本:基因組DNA中含有基因片段A的純合體即為高孵化率大口黑鱸親本。作為其中一個(gè)優(yōu)選方案，上述方法所用引物的序列如下所示:
Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID NO:3)
P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)
當(dāng)PCR產(chǎn)物為316bp的單一條帶時(shí)，該樣品為含有基因片段A的純合體，當(dāng)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)316bp和250bp兩種DNA條帶時(shí)，該樣品為含有基因片段A的雜合體。一種用于輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物，是根據(jù)大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:1)第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A (SEQID N0:2)的5’和3’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)并合成，其特征在于，當(dāng)大口黑鱸樣品基因型為含有基因片段A的純合體時(shí)，該引物的PCR產(chǎn)物為單一條帶；當(dāng)樣品基因型為雜合體時(shí)，則該引物的PCR產(chǎn)物有兩條帶，其中一條比另一條長(zhǎng)66bp。作為其中一個(gè)優(yōu)選方案，所述引物的序列如下所示:
Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID N0:3)；
P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)。一種用于輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的試劑盒，其含有上述用于輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明篩選得到了位于大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列上的66bp隱性致死缺失基因片段。將GHRH啟動(dòng)子具這66bp序列的基因型命名為A，將缺失突變的GHRH啟動(dòng)子基因型命名為B。根據(jù)大口黑鱸GHRH啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增及凝膠電泳技術(shù)鑒定親本的基因型，將生產(chǎn)中AB基因型大口黑鱸親本去除，保留AA基因型大口黑鱸親本，以提高大口黑鱸卵的相對(duì)孵化率。本方法克服了傳統(tǒng)方法受人為因素影響大的不利因素，提高了親本選擇的準(zhǔn)確性，且具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，便于廣泛推廣使用。


圖1為大口黑鱸促生長(zhǎng)激素釋放激素基因啟動(dòng)子序列標(biāo)示圖(下劃線為檢測(cè)引物設(shè)計(jì)區(qū)域，加框?yàn)锽基因型缺失的序列)；圖2為GHRH基因在不同基因型個(gè)體中的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1插入/缺失位點(diǎn)的篩查 1、實(shí)驗(yàn)魚
2008年11月，從廣東省佛山市南海區(qū)九江鎮(zhèn)大口黑鱸養(yǎng)殖基地隨機(jī)采集樣本170尾用于基因突變位點(diǎn)篩選及生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析。每尾大口黑鱸均測(cè)量體重，體長(zhǎng)和體高等生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，同時(shí)尾靜脈活體取血，抗凝劑(Ara)與血液體積比為6:1，用Blood & Cell CultureDNA Kit (Clontech)提取 DNA。2、GHRH啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增
將大口黑S盧促生長(zhǎng)激素釋放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào):HQ640678)與目前已知的魚類GHRH基因全序列比較，設(shè)計(jì)引物Pl 和 P2 (表 I),用于擴(kuò)增 GHRH 的啟動(dòng)子。按照 GenomeWalker Universal Kit (Clontech)試劑盒的操作，以本實(shí)驗(yàn)室保存的大口黑鱸基因組DNA酶切連接文庫(kù)為模板(Li et al.，2008, Cloning and characterization of largemouth bass (Micropterus salmoides)myostatin encoding gene and its promoter),使用試劑盒提供的引物API與Pl引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，94°C，3 min，一個(gè)循環(huán)；94°C，30 s ；67°C,3 min，5 個(gè)循環(huán)；94°C，30 s ；63°C,30 s ；72°C,3 min，27個(gè)循環(huán)；72°C，5 min。取該P(yáng)CR產(chǎn)物稀釋100倍后利用AP2和P2進(jìn)行巢式擴(kuò)增，程序同上。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化，克隆后送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所得GHRH啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示。
權(quán)利要求
1.大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A，其位于大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列上的第97 162bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因片段A，其特征在于，所述大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示，其第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A的序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的基因片段A作為分子標(biāo)記在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應(yīng)用。
4.一種輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的方法，包括檢測(cè)大口黑鱸樣品的基因組DNA，篩選含有權(quán)利要求1所述隱性缺失致死基因片段A的純合體即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)根據(jù)權(quán)利要求1所述基因片段A的5’和3’側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)并合成引物； 2)利用步驟I)的引物對(duì)大口黑鱸樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增； 3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果篩選親本:基因組DNA中含有基因片段A的純合體即為高孵化率大口黑鱸親本。
6.根據(jù)權(quán)利要求 5所述的方法，其特征在于，所用引物的序列如下所示:Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID NO:3)P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4) 當(dāng)PCR產(chǎn)物為316bp的單一條帶時(shí)，該樣品為含有基因片段A的純合體，當(dāng)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)316bp和250bp兩種DNA條帶時(shí)，該樣品為含有基因片段A的雜合體。
7.一種用于輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物，是根據(jù)大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:1)第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A (SEQ IDN0:2)的5’和3’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)并合成，其特征在于，當(dāng)大口黑鱸樣品基因型為含有基因片段A的純合體時(shí)，該引物的PCR產(chǎn)物為單一條帶；當(dāng)樣品基因型為雜合體時(shí)，則該引物的PCR產(chǎn)物有兩條帶，其中一條比另一條長(zhǎng)66bp。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCR引物，其特征在于，所述引物的序列如下所示:Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID N0:3)；P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)。
9.一種用于輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的試劑盒，其包括權(quán)利要求7或8所述的PCR引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了與大口黑鱸孵化率相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述與大口黑鱸孵化率相關(guān)的分子標(biāo)記位于大口黑鱸GHRH基因啟動(dòng)子序列上的第97～163bp。將GHRH啟動(dòng)子具這66bp序列的基因型命名為A，將缺失突變的GHRH啟動(dòng)子基因型命名為B。根據(jù)大口黑鱸GHRH啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，利用分子克隆方法鑒定親本的基因型，將生產(chǎn)中AB基因型大口黑鱸親本去除，保留AA基因型大口黑鱸親本，以提高親本的相對(duì)孵化率。本方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有目的性強(qiáng)，作用效果直接的優(yōu)點(diǎn)。且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、檢測(cè)成本低，便于廣泛推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103183SQ20131002607
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者李勝杰, 白俊杰, 韓林強(qiáng), 馬冬梅, 葉星, 樊佳佳, 姜鵬, 全迎春, 于凌云 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所