專利名稱:一種檢測mthfr基因化療藥物相關(guān)snp位點的引物組及方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及檢測基因化療相關(guān)SNP位點引物組及方法,特別是一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組及方法。
背景技術(shù):
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每500 1000個堿基對中就有I個,估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異,這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起,也可由堿基的插入或缺失所致。一般而言,SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。SNP成為第三代遺傳標(biāo)志,人體許多表型差異、對疾病、毒物的易感性與耐受性,疾病臨床表現(xiàn)的多樣性(clinicalphenotype diversity),以及對藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydorfolatereductase, MTHFR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶,可將5,10- 二甲基四氫葉酸(5,10-MTHF)轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸(5-MTHF)。5,10-MTHF是胸苷酸合成的重要原料之一,參與DNA的合成與修復(fù);而5-MTHF是體內(nèi)主要的甲基供體,參與DNA甲基化過程。MTHFR對于DNA的合成、活化及修復(fù)有著重要的調(diào)控作用。合成該酶基因中的SNP位點——677位點和1298位點的多態(tài)性會影響到酶活性,進而影響葉酸正常代謝,導(dǎo)致一系列的反應(yīng)。所以檢測MTHFR基因677位點和1298位點的多態(tài)性可作為化療藥物治療療效和毒副作用的良好預(yù)測指標(biāo)。MTHFR基因的多 態(tài)性影響到5_氟尿嘧啶(5_fIuorouracil,5-FU)的化療效果。5-氟尿嘧啶為嘧啶類似物,屬于抗代謝藥的一種,對消化道癌及其他實體瘤有良好療效。進入體內(nèi)后,它需經(jīng)過酶轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸而具有抗腫瘤活性。5-氟尿嘧啶能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷核,干擾DNA合成和修復(fù)。對RNA的合成也有一定的抑制作用。研究表明,MTHFR酶活性降低將造成體內(nèi)5,10-MTHF的濃度升高,5-MTHF水平隨之下降,進而提高5-氟尿嘧啶抗腫瘤療效。MTHFR基因的677位T/T基因型攜帶者化療有效率顯著高于T/C和C/C基因型攜帶者,1298位A/A基因型攜帶者化療有效率也明顯優(yōu)于于A/C和C/C基因型攜帶者。MTHFR基因的多態(tài)性也與氨甲喋呤(methotrexate,MTX)藥物的毒副作用存在相關(guān)性。氨甲喋呤是葉酸拮抗劑,能抑制MTHFR作用,在多種腫瘤疾病,如急性淋巴細胞白血病,惡性淋巴瘤、頭頸部癌、乳腺癌、惡性葡萄胎、絨毛膜上皮癌等的化療中發(fā)揮重要作用。但在治療過程中,患者常出現(xiàn)不良反應(yīng),包括胃腸道反應(yīng)、骨髓移植和肝功能損害等。研究發(fā)現(xiàn),MTHFR基因的677位T/T基因型攜帶者對氨甲喋呤治療的毒性反應(yīng)比C/C的基因型攜帶者嚴重。
不同人群對于同樣藥物的代謝和效應(yīng)存在著個體化差異,這樣的差異是由人的不同基因型所決定的。對于腫瘤患者人群,采用一致的化療治療手段可能導(dǎo)致藥物療效和副作用在不同個體上差異很大。因此,如果先檢測個體的基因型,再根據(jù)檢測結(jié)果制定相應(yīng)的個體化用藥治療方法,能夠提高療效,減輕毒副作用和患者負擔(dān)。這也是當(dāng)代疾病治療的發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于,提供一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組及方法,可測定MTHFR基因677位點和1298位點的基因型,進而為評估化療藥物5-氟尿嘧啶和氨甲喋呤對于受檢者的療效和毒副作用的依據(jù),可用于個體化用藥指導(dǎo)。一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組,包括第一引物組和第二引物組,第一引物組的的正向引物為SEQ ID NO: 3所示序列,反向引物為SEQ ID NO:4所示序列;第二組引物的正向引物為SEQ ID N0:5所示序列,反向引物為SEQ ID N0:6所示序列。檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的方法,包括:(I)采集待檢測血液樣本,提取基因組DNA ;(2)對待檢測樣本DNA中的MTHFR基因677位點擴增,所用PCR引物為上述引物組的第一組引物;(3)對待檢測樣本DNA中的MTHFR基因1298位點擴增,所用PCR引物為上述引物組的第二組引物;(4)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行測序,分析測序結(jié)果,確定677位點和1298位點基因型。更進一步的,上述 PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序前進行正向測序反應(yīng)擴增、純化后變性,在正向測序擴增反應(yīng)時,MTHFR基因677位點正向引物(MTHFR-677F)為SEQ ID NO:3所示序列,MTHFR基因1298位點正向引物(MTHFR-1298F)為SEQ ID NO:5所示序列。本發(fā)明相關(guān)引物特性如下:本發(fā)明中用于擴增MTHFR基因677位點的PCR引物,其中正向引物MTHFR-677F的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外顯子上游約35bp處;反向引物MTHFR-677R的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外顯子下游約18bp處。正反向引物大小分別為19bp,18bp,并能完全擴增MTHFR基因677位點所在區(qū)域。SEQIDNO:1給出了 MTHFR基因第4外顯子的基因序列,677位點位于該外顯子第79bp處。本發(fā)明中用于擴增MTHFR基因1298位點的PCR引物,其中正向引物MTHFR-1298F的3’末端位于如序列SEQ ID N0:2所示的MTHFR基因第7外顯子上游約17bp處;反向引物MTHFR-1298R的3’末端位于如序列SEQ ID NO: 2所示的MTHFR基因第7外顯子下游約155bp處。正反向引物大小分別為18bp,19bp,并能完全擴增MTHFR基因1298位點所在區(qū)域。SEQ ID NO: 2給出了 MTHFR基因第7外顯子的基因序列,1298位點位于該外顯子第120bp 處。本發(fā)明的特點在于,包括:(i)本發(fā)明的技術(shù)方法是一種體外檢測方法,對人體無害;(ii)本發(fā)明通過測序技術(shù)檢測樣本MTHFR基因677位點和1298位點的基因型,對擬使用化療藥物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人進行個體化用藥指導(dǎo),可提高療效,降低毒副作用。
圖1本發(fā)明引物序列設(shè)計示意圖。圖2檢測所設(shè)計的引物組特異性的實驗電泳圖。如圖所示,泳道A1、B1、C1、D1分別為4個DNA模板的MTHFR基因677位點經(jīng)特異擴增后電泳結(jié)果;泳道A2、B2、C2、D2分別為4個DNA模板的MTHFR基因1298位點經(jīng)特異擴增后電泳結(jié)果;泳道El為MTHFR基因677位點空白對照PCR擴增后電泳結(jié)果;泳道E2為MTHFR基因1298位點空白對照PCR擴增后電泳結(jié)果;Marker代表TAKARA DLl, 000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3樣本MTHFR基因677位點和1298位點PCR擴增后的電泳圖。如圖所示,泳道I為樣本DNA的MTHFR基因677位點PCR擴增后電泳結(jié)果;泳道2為樣本DNA的MTHFR基因1298位點PCR擴增后電泳結(jié)果;泳道3為MTHFR基因677位點空白對照PCR擴增后電泳結(jié)果;泳道4為MTHFR基因1298位點空白對照PCR擴增后電泳結(jié)果;Marker代表TAKARADLl, 000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4樣本DNA的MTHFR基因677位點PCR擴增后進行直接測序的測序結(jié)果。由圖可知,677位點的基因型為T/T。圖5樣本DNA的MTHFR基因1298位點PCR擴增后進行直接測序的測序結(jié)果。由圖可知,1298位點的基因型為A/A。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例應(yīng)僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中的未注明具體條件的實驗條件和方法,通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用的方法,例如奧斯伯等主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南(第五版)》所述的條件 ,或按照制造廠商建議的步驟和條件。實驗例I引物設(shè)計一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組,參見圖1設(shè)計引物,得到如下 4 個特異性引物 MTHFR-677F、MTHFR-677R、MTHFR-1298F 和 MTHFR-1298R:
弓I物名稱_序歹Li_序歹Li表中的序歹Li號
MTHFR-677F 5’ -tcgccttgaacaggtggag-3’SEQ ID NO: 3
MTHFR-677R 5’ -ggtggagggagcttatgg-3’SEQ ID NO:4
MTHFR-1298F 5’ -gagtgtgccctgacctct-3’SEQ ID NO: 5
MTHFR-1298R 5’ -tccctaagcccttccaggt-3’SEQ ID NO:6弓I物按照序列表中的序列也可用常規(guī)方法合成。 實施例2弓I物特異性檢測將合成的MTHFR-677F、MTHFR-677R、MTHFR-1298F 和 MTHFR-1298R 兩對引物組分別用 4 個 DNA 模板進行 PCR 反應(yīng)(10 μ L 體系,5 μ M 引物各 0.5 μ L,IOXPCRbufferl μ L, IOmMdNTP0.4 μ L, 5U/ μ L LATaq 酶 0.2 μ L,ddH206.4 μ L,模板 I μ L), PCR 產(chǎn)物通過 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的特異性。引物特異性檢測結(jié)果參見圖2。PCR產(chǎn)物條帶單一且明晰可辨,表明該兩對引物組能夠用于后續(xù)的檢測分析。
試驗例3采集待檢測血液樣本,提取基因組DNA,其示例性步驟為:采用上海飛捷生物技術(shù)有限公司DNA fast500小量基因組DNA極速抽提試劑盒(Catalogn0.220023)提取血液樣本中的基因組DNA,其示例性步驟為:1.取一無菌的1.5mL離心管,做好標(biāo)記,加入800yL的紅細胞裂解液,再加入400 μ L的血液樣本;2.上下顛倒混勻,并靜置約5min使紅細胞充分裂解;3.將離心管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速6500rpm,離心Imin ;4.離心完成后,倒掉離心管中的上清,留下沉淀,再加入800 μ L的紅細胞裂解液,上下顛倒混勻;5.將離心管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速6500rpm,離心Imin ;6.離心完成后,用移液器吸取離心管中的上清,盡量吸取干凈,留下沉淀,再加入500 μ L的紅細胞裂解液,上下顛倒混勻;7.將離心管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速6500rpm,離心Imin ;8.離心完成后,用移液器吸取離心管中的上清,盡量吸取干凈,然后用移液器將管底的白細胞沉淀吹散; 9.向離心管中加入500 μ L DA2溶液,上下顛倒混勻;10.將離心管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速6500rpm,離心Imin ;11.取一吸附柱套入收集管中,做好標(biāo)記。上一步離心完成后,將離心管內(nèi)的液體全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中;12.將吸附柱和收集管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速12000rpm,離心Imin ;13.離心完成后,倒掉收集管內(nèi)的廢液,再向吸附柱中加入350μ L Wash Buffer溶液。將吸附柱重新套入收集管中;14.將吸附柱和收集管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速12000rpm,離心Imin ;15.重復(fù)步驟13和14 一次;16.離心完成后,倒掉收集管內(nèi)的廢液,將吸附柱重新套入收集管中;17.將吸附柱和收集管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速14000rpm,離心3min,甩干吸附柱中殘留的液體;18.將吸附柱轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL離心管中,再向吸附柱中加入50yL EluteBuffer,靜置 2min ;19.將吸附柱和離心管置于離心機內(nèi),轉(zhuǎn)速14000rpm,離心3min。離心完成后,離心管內(nèi)即收集到基因組DNA溶液;20.使用NanoDrop2000分光光度計對所提取的DNA進行定量。實驗例4MTHFR基因677位點和1298位點的PCR擴增1、在已標(biāo)記的PCR管中,按照如下要求配置擴增MTHFR基因677位點的PCR反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組,包括第一引物組和第二引物組,第一引物組的的正向引物為SEQ ID N0:3所示序列,反向引物為SEQ ID NO: 4所示序列;第二組引物的正向引物為SEQ ID N0:5所示序列,反向引物為SEQ ID N0:6所示序列。
2.一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的方法,包括: (1)采集待檢測血液樣本,提取基因組DNA; (2)對待檢測樣本DNA中的MTHFR基因677位點擴增,所用PCR弓丨物為權(quán)利要求1引物組的第一組引物; (3)對待檢測樣本DNA中的MTHFR基因1298位點擴增,所用PCR引物為權(quán)利要求1引物的第二組引物; (4)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行測序,分析測序結(jié)果,確定677位點和1298位點基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的方法,其特征在于:上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序前進行正向測序反應(yīng)擴增、純化后變性,在正向測序擴增反應(yīng)時,MTHFR基因677位點正向引物(MTHFR-677F)為SEQ ID NO:3所示序列,MTHFR基因1298位點正向引物(MTHFR-1298F) 為SEQ ID NO:5所示序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測MTHFR基因化療藥物相關(guān)SNP位點的引物組及其方法。其中引物組包括第一引物組和第二引物組,第一引物組的的正向引物為SEQ ID NO:3所示序列,反向引物為SEQ ID NO:4所示序列;第二組引物的正向引物為SEQ ID NO:5所示序列,反向引物為SEQ ID NO:6所示序列。這本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的技術(shù)方法是一種體外檢測方法,對人體無害;本發(fā)明通過測序技術(shù)檢測樣本MTHFR基因677位點和1298位點的基因型,對擬使用化療藥物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人進行個體化用藥指導(dǎo),可提高療效,降低毒副作用。
文檔編號C12N15/11GK103224980SQ20131002598
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者陳然, 郝瑋, 孫黎, 李小青, 周蕊, 梁超, 韓韜, 陳忠, 方國偉, 涂贊兵, 黃士昂 申請人:武漢康圣達醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司