本發(fā)明涉及一種可實現(xiàn)谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白鑒定及絕對定量的檢測試劑盒及測定方法，也就是可實現(xiàn)GLAST蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒及測定方法，屬于檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate-aspartate transporter，GLAST)主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，對清除突觸間隙中的谷氨酸，終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞發(fā)揮主要作用，以保護(hù)神經(jīng)元不受谷氨酸的興奮性毒性影響。谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白分子量為49.6kDa，含543個氨基酸。國內(nèi)外檢測谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和蛋白印跡法(western blot)。ELISA法有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但有易污染、背景值高的缺點(diǎn)；western blot法為蛋白半定量方法，并且檢測時間較長，這些方法常使檢測靈敏度降低，不適合痕/微量谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白檢測試劑盒，給出一種采用本試劑盒可以克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的定性鑒別和絕對定量的方法。該試劑盒給出了檢測谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對含谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白樣品進(jìn)行酶解反應(yīng)的反應(yīng)試劑?？蓪?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和/或酶解反應(yīng)產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中進(jìn)行谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白鑒定及含量測定。本發(fā)明提供了一種專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡便，可用于樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白鑒定及含量測定的一種檢測試劑盒及檢測方法。

技術(shù)方案：

一種可實現(xiàn)GLAST蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒，其特征在于：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段，肽段序列為：

選擇方式如下：

(1)、所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段單獨(dú)使用或者與其他特征肽段配成多種混合特征肽段使用；

(2)、內(nèi)標(biāo)肽段可單獨(dú)使用，也可與其他特征肽段配成兩種或多種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用；

(3)、所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)單獨(dú)使用，或與另外一種單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時使用；

(4)、內(nèi)標(biāo)肽段與其他內(nèi)標(biāo)肽段混合使用。

該試劑盒還包括反應(yīng)試劑：

反應(yīng)試劑，由以下成分組成

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)肽段是特征肽段中任一、二或多個氨基酸上的C、H、O、N被同位素標(biāo)記后的肽段，其中，一個氨基酸上的C、H、O、N四個元素可同時被標(biāo)記，或任意1～3個元素被標(biāo)記。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑。

所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

所述反應(yīng)試劑配成單劑。

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是特征肽段，是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成多混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

②用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段，是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

④標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是單劑、或是雙劑或多劑，根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

利用上述的可實現(xiàn)GLAST蛋白鑒定及絕對定量的試劑盒所實施的谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白含量測定方法，其特征在于：該方法步驟如下：

(1)將待測樣品加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)；

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中含內(nèi)標(biāo)肽段的最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測，檢測后通過母離子和子離子的質(zhì)荷比(m/z)及特征肽段的保留時間(t_R)進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測算出谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的絕對含量；

溫度控制在25～60℃范圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，渦旋時間控制在2～10min，室溫控制在18-22℃范圍；

胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步驟(2)為：將特征肽段和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中含內(nèi)標(biāo)肽段的最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z和t_R進(jìn)行定性，色譜峰峰面積變化測算出谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的含量。

有益效果：本發(fā)明具有的有益效果為：本發(fā)明提供的檢測試劑盒和檢測方法能對樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的定性和絕對定量，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(由特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段組成)和反應(yīng)試劑；采用(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，這是一類采用高效液相色譜分離，三重四級桿質(zhì)譜檢測母離子和子離子m/z的設(shè)備，能快速、精確、靈敏的對腦組織中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白進(jìn)行定性鑒別和絕對定量。該方法具有操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

目前，尚未開發(fā)出測定谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白含量的特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段和反應(yīng)試劑的試劑盒。本發(fā)明成功的彌補(bǔ)了生物檢測領(lǐng)域的不足，能準(zhǔn)確地對谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白進(jìn)行定性鑒別及絕對定量，具有特異性強(qiáng)、操作簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為特征肽段1的二級質(zhì)譜圖(m/z＝822.9)

圖2為特征肽段1的二級質(zhì)譜圖(m/z＝338.1)

具體實施方式

通過以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實施例。

本發(fā)明包括谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白檢測試劑盒和含量測定方法兩部分。

谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白檢測試劑盒由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反應(yīng)試劑兩部分組成：

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是特征肽段，可以是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成多混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

②用以實現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段，可以是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，以下簡稱“內(nèi)標(biāo)物質(zhì)”，更有利于谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的定性和定量檢測?？梢允菃我粌?nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成多混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

④用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是單劑、也可以是雙劑或多劑，可根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

2)反應(yīng)試劑，用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的反應(yīng)試劑是單劑，包括：

本發(fā)明測定谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白含量的步驟如下：

(1)將樣品制成的組織勻漿液(或含內(nèi)標(biāo)肽段)，離心，取上清液，加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和最終產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測算出樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的含量。

通常步驟(1)溫育溫度控制在25～60℃范圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100，渦旋時間控制在2～10min。

所述步驟(2)將特征肽段(一種或兩種)和最終產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)(一種或兩種)和最終產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，通過色譜峰峰面積變化，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測算出樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的含量。

實施例1：

樣品：小鼠大腦組織

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一內(nèi)標(biāo)肽段I：

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

(1)樣品的制備：取小鼠大腦組織50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段I，混勻，離心。取上清液，加100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，55℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入80mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入10.0mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，45℃溫育振蕩(1000rmp)6h，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液400μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物。

(2)將混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終產(chǎn)物(含單一內(nèi)標(biāo)肽段I)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，特征肽段1采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，特征肽段2作為佐證肽段可采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。特征肽段1和2的檢出限均為3ng，回收率為90.5％～96.7％(n＝6)。

實施例2：

樣品：小鼠海馬組織

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II：

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

1)樣品的制備：取小鼠海馬組織50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段II，混勻，離心。取上清液，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(1200rmp)4min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液200μL，60℃溫育振蕩(1500rmp)45min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入2.0mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，60℃振蕩(1500rmp)溫育60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液600μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I和II與單一內(nèi)標(biāo)肽段II混合后，與最終酶解產(chǎn)物(含單一內(nèi)標(biāo)肽段II)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，特征肽段2采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，特征肽段1作為佐證肽段可采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。特征肽段1和2的檢出限均為3ng，回收率為93.9％～98.0％(n＝6)。

實施例3：

樣品：小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

1)樣品的制備：取小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞100mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)3min，加入200mmol/L二硫蘇糖醇溶液150μL，65℃溫育振蕩(1200rmp)35min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液350μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)40min，加入6mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃溫育振蕩(1500rmp)12h，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液100μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I、II和最終產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，采用外標(biāo)法定量。特征肽段1和2檢出限為2ng，回收率為93.7％～97.4％(n＝6)。

實施例4：

樣品：小鼠大腦皮層

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II：

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

1)樣品的制備：取大鼠大腦皮層50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段II，混勻，離心，取上清液，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液850μL，渦旋(800rmp)9min，加入200mmol/L二硫蘇糖醇溶液200μL，60℃溫育振蕩(2000rmp)100min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(2500rmp)20min，加入10mg/ml胰蛋白酶溶液180μL，60℃振蕩(1500rmp)溫育30min，放置至室溫后，加入15％甲酸水溶液300μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II和最終產(chǎn)物(含單一內(nèi)標(biāo)肽段II)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，采用內(nèi)標(biāo)法定量。檢出限為3ng，回收率為91.1～98.7％(n＝6)。

實施例5：

樣品：小鼠脊髓

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

1)樣品的制備：取小鼠脊髓50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入雙混合內(nèi)標(biāo)肽段，混勻，離心，取上清液，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液800μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)45min，放置至室溫后，加入120mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，25℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，50℃溫育振蕩(1800rmp)3.5h，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液400μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物。

2)將混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III和最終產(chǎn)物(含雙混合內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，采用特征肽段1和2采用內(nèi)標(biāo)法定量。特征肽段1檢出限為3ng，特征肽段2檢出限為3ng，回收率為90.7％～96.9％(n＝6)。

實施例6：

樣品：小鼠視網(wǎng)膜

混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段1 IVQVTAADAFLDLIR

特征肽段2 VQSLTK

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 VQSLTK

1)樣品的制備：取小鼠視網(wǎng)膜50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內(nèi)標(biāo)肽段II，混勻，離心，取上清液，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液200μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)50min，放置至室溫后，加入120mmol/L碘代乙酰胺溶液250μL，35℃溫育振蕩(1000rmp)60min，加入10mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，50℃溫育振蕩(1800rmp)5h，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液600μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物。

2)將混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II和最終產(chǎn)物(含單一內(nèi)標(biāo)肽段II)分別注入(超)高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀中檢測，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，特征肽段2采用內(nèi)標(biāo)法定量，特征肽段1作為佐證肽段可采用外標(biāo)法定量。特征肽段1和2的檢出限為3ng，回收率為92.7％～98.1％(n＝6)。

以上實施例中：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段單獨(dú)使用或與其他特征肽段配成兩種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用，具體實施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，單獨(dú)使用或與另外一種特征肽段或混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時使用，具體實施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑，具體實施方式不再一一贅述。

所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

總之，上述替換的實施例在這里不做贅述。

總之，實驗證明，采用本發(fā)明的檢測試劑盒完全可以對樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白進(jìn)行鑒定，并得出所需的絕對含量測定結(jié)果，并且靈敏度高、特異性好、精密度高、不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。

本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測方法具有專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于樣品中谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白含量測定。

蛋白序列

谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白

MTKSNGEEPRMGGRMERLQQGVRKRTLLAKKKVQSLTKEDVKSYLFRNAFVLLTVTAVIVGTILGFALRPYKMSYREVKYFSFPGELLMRMLQMLVLPLIISSLVTGMAALDSKASGKMGMRAVVYYMTTTIIAVVIGIIIVIIIHPGKGTKENMYREGKIVQVTAADAFLDLIRNMFPPNLVEACFKQFKTSYEKRSFKVPIQSNETLLGAVINNVSEAMETLTRIREEMVPVPGSVNGVNALGLVVFSMCFGFVIGNMKEQGQALREFFDSLNEAIMRLVAVIMWYAPLGILFLIAGKIVEMEDMGVIGGQLAMYTVTVIVGLLIHAVIVLPLLYFLVTRKNPWVFIGGLLQALITALGTSSSSATLPITFKCLEENNGVDKRITRFVLPVGATINMDGTALYEALAAIFIAQVNNFDLNFGQIITISITATAASIGAAGIPQAGLVTMVIVLTSVGLPTDDITLIIAVDWFLDRLRTTTNVLGDSLGAGIVEHLSRHELKNRDVEMGNSVIEENEMKKPYQLIAQDNEPEKPVADSETKM

谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白

MTKSNGEEPRMGGRMERLQQGVRKRTLLAKKKVQSLTKEDVKSYLFRNAFVLLTVTAVIVGTILGFALRPYKMSYREVKYFSFPGELLMRMLQMLVLPLIISSLVTGMAALDSKASGKMGMRAVVYYMTTTIIAVVIGIIIVIIIHPGKGTKENMYREGKIVQVTAADAFLDLIRNMFPPNLVEACFKQFKTSYEKRSFKVPIQSNETLLGAVINNVSEAMETLTRIREEMVPVPGSVNGVNALGLVVFSMCFGFVIGNMKEQGQALREFFDSLNEAIMRLVAVIMWYAPLGILFLIAGKIVEMEDMGVIGGQLAMYTVTVIVGLLIHAVIVLPLLYFLVTRKNPWVFIGGLLQALITALGTSSSSATLPITFKCLEENNGVDKRITRFVLPVGATINMDGTALYEALAAIFIAQVNNFDLNFGQIITISITATAASIGAAGIPQAGLVTMVIVLTSVGLPTDDITLIIAVDWFLDRLRTTTNVLGDSLGAGIVEHLSRHELKNRDVEMGNSVIEENEMKKPYQLIAQDNEPEKPVADSETKM