本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種檢測星狀病毒的試劑盒和寡核苷酸，更確切的說，是一種檢測星狀病毒的反轉錄—微滴式數字聚合酶鏈式反應(droplet digital reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-ddPCR))快速定量檢測試劑盒。

背景技術：

Appleton等于1975年在胃腸炎患者的糞便中首次發(fā)現星狀病毒(Human Astrovirus,HAstV)，各國每年都會不同程度地出現星狀病毒感染暴發(fā)情況。星狀病毒屬無衣殼的單股正鏈RNA病毒，直徑28～35nm，具有5～6個小角，使整個病毒粒子呈星狀結構。病毒基因長6.8kb，包括一個5’非編碼區(qū)(5’non-coding region,NCR)，三個開放讀碼框架(open reading frams,ORFs)ORF1a、ORF1b和ORF2，80個核苷酸的3’非編碼區(qū)和一個大約30個核苷酸的多聚腺苷酸尾)。星狀病毒可劃分為8個血清型HAstV-1～HAstV-8。目前，星狀病毒已被認為是引起嬰幼兒、老年人及免疫力低下者急性病毒性腸炎的重要病原之一。

雖然食源性病毒是嚴格的細胞內寄生物，在食品中不能繁殖，但食品中微量的食源性病毒就會引起疾病。而可能存在食源性病毒污染的食品樣品中，其病毒滴度通常處于比較低的水平。因此需要一種針對食源性病毒精確定量檢測方法，實現對食源性病毒的有效監(jiān)控。目前，星狀病毒的定量檢測方法主要包括以聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)基礎的實時熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,RT-qPCR)和反轉錄－環(huán)介導恒溫核酸擴增(Realtime reverse transcription lood-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)法。這兩種方法需要經過仔細校準的標準曲線和穩(wěn)定的星狀病毒標準物質，而且每次檢測都需建立標準曲線，因此結果分析中潛在主觀因素的存在，造成了多次檢測間結果的差異和不同實驗室間結果的多樣性，影響星狀病毒定量檢測的標準化和規(guī)范化。

近年來發(fā)展起來的數字PCR(Digital PCR，dPCR)技術是一種全新的核酸定量檢測方法。目前，數字PCR包括：微反應室/孔板數字PCR(Chamber Digital PCR,cdPCR)、微流體數字PCR(Microfluidic Digital PCR，mdPCR)(大規(guī)模集成微流控芯片)和微滴式數字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)三種dPCR系統(tǒng)。目前，國內外均未見利用RT-ddPCR進行星狀病毒定量檢測的相關報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測星狀病毒的RT-ddPCR引物和探針。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種操作簡單、結果準確的星狀病毒RT-ddPCR定量檢測試劑盒。

為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

本發(fā)明通過分析星狀病毒的基因組構成，選取其保守片段ORF2，設計出特異性引物和探針，所述用于檢測星狀病毒的引物和探針的序列見表1。其中，探針5’標記FAM，3’標記BHQ。

表1RT-ddPCR引物探針序列

本發(fā)明還提供一種精確定量檢測星狀病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測星狀病毒的引物和探針。進一步地，該試劑盒還包括完成RT-ddPCR反應所需材料和試劑，例如星狀病毒陽性對照RNA、one-step RT-ddPCR supermix、醋酸酶、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和鋁箔熱封膜等，上述材料和試劑優(yōu)選為單獨包裝。

本發(fā)明還提供了一種星狀病毒精準定量的檢測方法，即RT-ddPCR方法，其包括以下內容：

1.提取待測樣品RNA，可以使用現有技術中已知的提取方法或商業(yè)化試劑盒進行提取；

2.配制RT-ddPCR反應體系，其中，所述反應體系包括序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的引物和探針。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，RT-ddPCR反應體系如表2所示；

表2星狀病毒ddPCR反應體系

3.將步驟2.配制的RT-ddPCR反應體系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成儀中生成微滴；

4.進行擴增反應，反應條件見表3；

表3星狀病毒RT-ddPCR反應條件

注：升降溫速度應≤2.5℃/s

5.結果判定。

將擴增后的96孔板置于微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft軟件進行結果讀取和分析。含有擴增產物的陽性微滴與不含擴增產物的陰性微滴會呈現出熒光信號強度的差異，以陰性微滴簇熒光幅度的最高點為界來設定閾值線。按照泊松分布原理計算獲得RT-ddPCR反應體系內星狀病毒目的片段含量，進而通過RNA模板加樣量(2μL)和提取的RNA模板體積數，按以下公式計算獲得樣品中星狀病毒的精準定量。

本發(fā)明的優(yōu)點是：1)對核酸分子的絕對定量避免了由PCR擴增效率差異所導致的偏差；2)無需依賴有證標準物質或其他標準品；3)具有更高的精確度、靈敏性和重復性，易于標準化；4)更適合低拷貝數的核酸檢測；5)由于RT-ddPCR是終點檢測，對抑制劑的耐受度更高，因此可降低由基質類型所導致的檢測偏差。

下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

附圖說明

圖1不同退火溫度條件下星狀病毒目的片段RT-ddPCR檢測結果。

圖2 RT-ddPCR試劑盒檢測星狀病毒特異性分析結果。

圖3 RT-ddPCR試劑盒檢測星狀病毒靈敏度分析結果。

圖4 RT-ddPCR試劑盒檢測星狀病毒重復性分析結果。

具體實施方式

實施例1RT-ddPCR引物、探針設計

為實現對星狀病毒的特異性檢測和絕對定量分析，我們選取星狀病毒開放閱讀框2(Open Reading Frame,ORF2)編碼caspid protein的靶序列，通過NCBI在線工具進行序列分析和比對，利用Prime Express軟件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)設計出10余對引物和探針組合，經過篩選最終獲得特異性強、適用于RT-ddPCR引物/探針組合各1套，序列見表1。其中探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ。引物/探針均由北京六合通經貿有限公司合成。

實施例2檢測方法的建立

(1)RNA提?。豪蒙虡I(yè)化試劑盒進行提取；或者利用傳統(tǒng)Trizol法提取RNA，具體操作如下：①在100μL樣品中加入1mL Trizol，震蕩30s后，室溫放置5min；②加入250μL氯仿，劇烈震蕩30s，室溫放置5min；4℃，12000g，離心5min；③將上清液轉入新離心管中，加入500μL的異丙醇劇烈震蕩混勻30s，室溫放置5min；④4℃，5000g，離心5min；⑤小心移去上清，沉淀用1mL 70％乙醇清洗后12000g，4℃，離心5min(盡可能吸走上清，離心管置于超凈臺上將沉淀吹干)；⑥加入50μL無RNase水溶解RNA(為了使病毒RNA更好的溶解，置60℃加熱10min)。提取的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)按照表2配制20μL的RT-ddPCR反應體系

(3)微滴生成

將20μL的ddPCR反應體系和65μL微滴生成油分別加入到8孔微滴生成卡中，置于微滴生成儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中生成微滴。

(4)擴增反應

將生成的油包水的微滴(40μL)緩慢轉移至96孔板中，封膜后置于PCR儀(Veriti Thermal cycler,Applied BioSystems,Foster City,CA)上進行擴增反應，擴增條件如表3所示。

(5)結果判定

將擴增后的96孔板置于微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft軟件進行結果讀取和分析。含有擴增產物的陽性微滴與不含擴增產物的陰性微滴會呈現出熒光信號強度的差異，可以陰性微滴簇熒光幅度的最高點為界來設定閾值線。按照泊松分布原理計算獲得RT-ddPCR反應體系內星狀病毒目的片段含量，進而通過RNA模板加樣量(2μL)和提取的RNA模板體積數，按以下公式計算獲得樣品中星狀病毒的精準定量。

本發(fā)明還對RT-ddPCR檢測條件進行了優(yōu)化，例如退火溫度，取提取的星狀病毒RNA作為模板，分別在50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的退火溫度下進行擴增反應，比較不同條件下RT-ddPCR的檢測結果。由圖1可見，50℃條件下星狀病毒目的基因片段的擴增效率偏低，陽性微滴和陰性微滴分界不明顯；55℃和60℃條件下目的基因片段擴增效率較高，可出現比較明顯的陽性微滴簇，且60℃條件下擴增的熒光信號略高于55℃，因此，將60℃作為最佳最火溫度。

實施例3試劑盒組成

1.試劑盒的組成(保存于-20℃)

(1)實施例1設計的用于檢測星狀病毒的引物和探針SEQ ID No.1-3，由北京六合通經貿有限公司合成；

(2)one-step RT-ddPCR supermix、25mM醋酸鎂：購自美國BioRad公司，貨號186-3021；

(3)微滴生成油：購自美國BioRad公司，貨號186-3030；

(4)微滴生成卡：購自美國BioRad公司，貨號186-4007；

(5)鋁箔熱封膜：購自美國BioRad公司，貨號181-4000；

(6)Twin Tec Semi-Skirted 96孔板：購自德國Eppendorf公司，貨號0030128605；

(7)陰性對照：DEPC水；購自上海生工，貨號：D1005；

(8)陽性對照：星狀病毒RNA標準物質；

(9)DEPC水：購自上海生工，貨號：D1005。

2.星狀病毒RNA標準物質制備

以星狀病毒RNA為模板，利用引物SEQ ID No.1-2，擴增出約63bp的特異性片斷，稱之為Ast(包含RT-ddPCR擴增靶基因)；構建重組質粒pcDNAⅡ-Ast(pcDNAⅡ載體購自Invitrogen公司)，于上海生工公司進行序列測定，并將測序結果與GenBank中星狀病毒的基因序列進行同源性分析，其同源性達95％以上。提取并純化質粒DNA，用Promega公司的Ribo MAX^TM Large Scale RNAProduction system-T7試劑盒(貨號：P1300)進行體外轉錄(按試劑盒操作說明書進行)，體外轉錄產物用DNase消化，去除其中的DNA。利用RNeasy MiniElute Cleanup kit(購自QIAGEN公司，貨號74204)進一步純化RNA。純化的RNA于上海生工公司進行序列測定，并將測序結果與GenBank中星狀病毒的基因序列進行同源性分析，其同源性達95％以上。將cRNA分裝，保存于-80℃。對制備的星狀病毒RNA標準物質進行均勻性、穩(wěn)定性檢驗，均符合相關要求；采用多家實驗室定值方法對RNA進行定值研究，最終制備的星狀病毒RNA標準物質濃度為：5.52×10⁶copies/μl。-80℃保存，作為試劑盒的陽性對照。

實施例4檢測方法特異性和靈敏度評價

1.檢測特異性分析

(1)材料：輪狀病毒、星狀病毒、甲肝病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA均由中國疾病預防控制中心病毒病所提供。

(2)方法：使用本發(fā)明所述試劑盒，對常見的腹瀉病毒包括輪狀病毒、星狀病毒、甲肝病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA進行RT-ddPCR擴增檢測，觀察該試劑盒有無非特異性反應的發(fā)生。

(3)結果：輪狀病毒、星狀病毒、甲肝病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA經PCR儀(Veriti Thermal cycler,Applied BioSystems,Foster City,CA)擴增后，采用微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)檢測，利用QuantaSoft軟件進行結果讀取和分析。結果表明，只有星狀病毒出現特異性擴增，其余病毒經RT-ddPCR檢測均呈陰性，證明該方法具有良好的特異性。結果見圖2。

2.檢測靈敏度分析

(1)方法：將前面制備的星狀病毒檢測RNA標準物質進行10倍梯度稀釋至5.52拷貝/μL，各取2μL，利用實施例3所述的試劑盒進行RT-ddPCR檢測，通過分析本發(fā)明所述試劑盒所能檢測到的最低限，反應體系見表2。

(2)結果：發(fā)現利用本發(fā)明所述試劑盒，可檢測到5.52拷貝/μL的星狀病毒RNA標準物質。結果見圖3?？梢姳驹噭┖袡z測星狀病毒可達到5.52拷貝/μL，大大提高了星狀病毒相關檢測方法的靈敏度，不依賴標準品，可實現絕對定量，結果直觀可靠。

實施例5檢測方法準確性和重復性評價

1.檢測準確性評價

準確性(truness)是指一組測試結果的平均值與可接受的參考值之間的一致性程度。按照歐盟與Codex的標準，準確度的判定標準是在整個檢測動態(tài)范圍內，測定值應在參考值±25％范圍內。

(1)方法：利用前面制備的星狀病毒RNA標準物質(5.52×10⁶copies/μl)稀釋至5.52×10³copies/μl、5.52×10²copies/μl、5.52×10¹copies/μl和5.52copies/μl，表示為樣品U1-U4(表4)

各樣品分別進行RT-ddPCR檢測，每個樣品設7個重復，同時設置1個空白對照(以去DEPC水代替模板RNA)。

(2)結果：星狀病毒RNA的RT-ddPCR測定值均同預計值非常接近，其標準偏差均＜15％(表4)，小于25％的判定標準，說明該方法具有非常好的準確性。

表4星狀病毒RT-ddPCR檢測的準確性

2.檢測重復性分析

(1)方法：利用前面制備的星狀病毒RNA標準物質(5.52×10⁶copies/μl)稀釋至5.52×10³copies/μl，進行RT-ddPCR檢測，設9個重復，同時設置1個空白對照(以去DEPC水代替模板RNA)。

(2)結果：由圖4可見，對特定濃度的星狀病毒RNA陽性對照的測定變異系數CV小于25％，證明該方法用于星狀病毒定量檢測時具有良好的重復性。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。