本發(fā)明涉及一種艾滋病病毒多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及檢測方法。

(二)

背景技術(shù)：

艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的，自1981年首次報(bào)道以來，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的重大傳染病之一。截止2012年全球共有3530萬(3220萬～3880萬)人感染艾滋病病毒。2012年約230萬人新發(fā)感染艾滋病病毒，約160萬人死于與艾滋病相關(guān)疾病。在中國2015年檢測發(fā)現(xiàn)的艾滋病感染者超過11萬例，截止2015年底全國報(bào)告現(xiàn)存活病例超過57萬。近年來艾滋病感染者人數(shù)依然保持較快增加，艾滋病防治形勢依然嚴(yán)峻。

檢測發(fā)現(xiàn)是控制艾滋病蔓延的重要手段，建立快速、敏感、特異的艾滋病病毒檢測方法是十分必要的。近年熒光PCR技術(shù)在傳染病病原體檢測方面得到廣泛的應(yīng)用，它利用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對DNA的高效擴(kuò)增并結(jié)合探針技術(shù)的高特異性，克服了常規(guī)血清學(xué)和普通PCR方法的諸多不足，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。多重?zé)晒釶CR技術(shù)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)多任務(wù)檢測，更具省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種艾滋病病毒HIV多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及檢測方法，克服了常規(guī)血清學(xué)和普通PCR方法的諸多不足，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種艾滋病病毒HIV多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)試劑、標(biāo)簽引物Tag、LTR基因特異性引物和探針、GAG基因特異性引物和探針、RNase P內(nèi)控靶基因引物和探針：

標(biāo)簽引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'；

LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’；

LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’；

LTR熒光探針：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；

GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’；

GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’；

GAG熒光探針：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’；

RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’；

RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’；

RNase P熒光探針：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'；

其中，F(xiàn)AM、HEX和CY5為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)，LTR和GAG是所檢測的HIV特異性靶基因，RNase P是人類核糖核酸酶P基因(管家基因)作為內(nèi)控靶基因。

本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性加尾引物和探針的設(shè)計(jì)，試劑盒內(nèi)的其它組分為本領(lǐng)域常規(guī)用于PCR試劑，如dNTP mix、MgCl₂、buffer、Taq酶等，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)常識進(jìn)行選擇，可自行配制，也可選用常見商品化產(chǎn)品。本發(fā)明所述PCR反應(yīng)試劑包括：1×Ex Taq PCR Buffer，Mg²⁺，dNTP，Ex Taq和DNA模板。

本發(fā)明還提供一種所述艾滋病病毒多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的檢測方法，具體所述方法為：

(1)提取待測樣品DNA：所述樣品DNA提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。

(2)以待測樣品DNA為模板，加入PCR反應(yīng)試劑、標(biāo)簽引物Tag、LTR基因特異性引物和探針、GAG基因特異性引物和探針、RNase P內(nèi)控靶基因引物和探針構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增反應(yīng)；

(3)熒光PCR檢測以Ct值﹤50并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽性判定原則；其中Ct值<40且擴(kuò)增曲線呈S型可直接判定為陽性；Ct值在40～50之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到S型擴(kuò)增曲線方則判定為陽性；如果沒有擴(kuò)增曲線或無Ct值產(chǎn)生則判定為陰性。

所述多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(檢測FAM、HEX和CY5熒光)，共50個(gè)循環(huán)。

所述PCR反應(yīng)體系為25μl，各成分終濃度為：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上游引物、0.04μmol/L LTR下游引物、0.04μmol/L GAG上游引物、0.04μmol/L GAG下游引物，0.01μmol/L RNaseP上游引物、0.01μmol/L RNaseP下游引物，0.4μmol/L標(biāo)簽引物Tag，0.16μmol/L LTR熒光探針，0.40μmol/L GAG熒光探針，0.32μmol/L RNase P熒光探針，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明試劑盒對艾滋病病病毒HIV前病毒DNA核酸的檢測簡便快速，具有高度的特異性和靈敏度，檢出限可達(dá)20拷貝/反應(yīng)；設(shè)計(jì)了內(nèi)控基因的檢測有利于監(jiān)測PCR體系的正常運(yùn)行，雙色熒光探針設(shè)計(jì)能同時(shí)對HIV病毒的LTR基因和GAG基因進(jìn)行檢測避免漏檢。針對多重PCR體系，特別設(shè)計(jì)同源加尾的序列，有利于顯著抑制引物二聚體產(chǎn)生而提高檢測靈敏度；該方法可直接從全血或外周血淋巴細(xì)胞富積液樣本中檢測HIV病毒核酸，從核酸提取到完成檢測少于3.5小時(shí)，有利于HIV感染診斷尤其是HIV窗口期患者、HIV抗體不確定者、嬰兒感染早期診斷等。

(四)附圖說明

圖1多重?zé)晒釶CR原理圖，A為本發(fā)明所述多重?zé)晒釶CR檢測流程圖：加尾的特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)片段，標(biāo)簽引物進(jìn)一步擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物，特異性探針與目標(biāo)片段結(jié)合產(chǎn)生熒光信號；B為加尾引物抑制引物二聚體產(chǎn)生的原理：加尾引物雖可形成二聚體，但其可形成“鍋柄”狀結(jié)構(gòu)抑制下一步引物二聚體的進(jìn)一步生成。

圖2為多重?zé)晒釶CR檢測LTR基因的靈敏度結(jié)果(FAM信號)。

圖3為多重?zé)晒釶CR檢測GAG基因的靈敏度結(jié)果(HEX信號)。

圖4為多重?zé)晒釶CR檢測HIV陽性感染者的典型結(jié)果。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1

1材料與方法

1.1臨床標(biāo)本：

HIV感染者全血樣本來自浙江省疾病預(yù)防控制中心所建立的艾滋病陽性樣本庫。

1.2引物與探針

從美國GenBank下載不同亞型的HIV參考株基因序列，用生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性比較，基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，序列為：

標(biāo)簽引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'

LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’

LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’

LTR熒光探針：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；

GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’

GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’

GAG熒光探針：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’

RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’

RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’

RNase P熒光探針：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'

引物和探針委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.3熒光PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化：

選用大連Takara公司的EX Taq酶及配套的dNTP、10×PCR buffer等組分，按說明書操作配置反應(yīng)體系。針對熒光PCR反應(yīng)體系主要對包括MgCl₂濃度、各引物和探針的濃度、Taq酶用量等進(jìn)行優(yōu)化，針對反應(yīng)程序主要對退火溫度和時(shí)間、循環(huán)數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化。

結(jié)果判斷：熒光PCR檢測以Ct值﹤50并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽性判定原則；其中Ct值<40且擴(kuò)增曲線呈S型可直接判定為陽性；Ct值在40～50之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)均能得到S型擴(kuò)增曲線方則判定為陽性；如果沒有擴(kuò)增曲線或無Ct值產(chǎn)生則判定為陰性。

1.4熒光PCR特異性試驗(yàn)

用11例已知健康人的血樣和98例已知HIV感染者血樣，經(jīng)提取DNA核酸后進(jìn)行檢測，以考察所建立新方法的特異性。由于HIV具有高度變異性，產(chǎn)生了許多具有獨(dú)特基因序列特征的組、亞型和流行重組型(Circulating Recombinant Forms，CRFs)。為了考察本方法對于不同型別HIV的檢測能力，用已定型的HIV核酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括56例CRF01_AE，13例CRF07_BC，11例CRF08_BC，15例B亞型，2例C亞型和1例G亞型?？疾斓囊讯ㄐ偷腍IV核酸涵蓋絕大多數(shù)浙江省已檢測發(fā)現(xiàn)的HIV毒株類型。

1.5熒光PCR敏感性試驗(yàn)

利用pTG19-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒作為檢測模板，并經(jīng)計(jì)算準(zhǔn)確定量其拷貝數(shù)。分別在反應(yīng)體系(同1.3)中加入對應(yīng)拷貝數(shù)的檢測模板1×10⁷cps(copies，拷貝數(shù))、1×10⁶cps、1×10⁵cps、1×10⁴cps、1×10³cps、500cps、100cps、50cps、10cps和1cps，以此考察(檢測體系和程序采用1.3最終優(yōu)化后的結(jié)果)檢測體系的靈敏度。

根據(jù)檢測需要在每個(gè)反應(yīng)體系(同1.3，是在前面靈敏度的基礎(chǔ)進(jìn)一步考察精確的靈敏度(10-100cps/反應(yīng)))加入10cps、20cps、40cps、50cps、60cps、80cps和100cps檢測模板進(jìn)一步考察(檢測體系和程序采用1.3最終優(yōu)化后的結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最終檢測靈敏度是20cps/反應(yīng))精確的靈敏度。所有的靈敏度實(shí)驗(yàn)均設(shè)置重復(fù)管以考察檢測體系的重復(fù)性。

2結(jié)果

2.1熒光PCR反應(yīng)體系及條件

通過對熒光PCR反應(yīng)體系及程序的系列優(yōu)化，最后構(gòu)建的多重?zé)晒釶CR體系為25μl，各成分終濃度為：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上下游引物和GAG上下游引物，0.01μmol/L RNaseP上下游引物，0.4μmol/L標(biāo)簽引物，0.16μmol/L LTR探針，0.40μmol/L GAG探針，0.32μmol/L RNase P探針，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。用ABI 7500 FAST熒光PCR儀按下列參數(shù)進(jìn)行：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(檢測熒光FAM、HEX和CY5)，50個(gè)循環(huán)。

2.2特異性試驗(yàn)

用98例已知HIV感染者(涵蓋不同亞型)和11例已知健康人全血樣本進(jìn)行檢測結(jié)果顯示98例已知HIV感染者檢測為陽性，11例已知健康人檢測為陰性，說明本方法能準(zhǔn)確區(qū)分HIV感染者和健康人，而且能檢測不同亞型的HIV核酸，未出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。

2.3敏感性試驗(yàn)

通過對1cps～1×10⁷cps的梯度濃度的質(zhì)粒模板考查，結(jié)果本方法的檢測靈敏度為10-50cps/反應(yīng)，進(jìn)一步細(xì)化的質(zhì)粒模板梯度(10cps～100cps)檢測下限為20cps/反應(yīng)，典型結(jié)果如圖2和圖3。

2.4臨床樣本的檢測

對HIV感染者的臨床全血樣本提取核酸后進(jìn)行檢測，結(jié)果能得到S型擴(kuò)增曲線，典型結(jié)果見圖3。