本發(fā)明屬于香港牡蠣的微衛(wèi)星分子標(biāo)記領(lǐng)域，特別涉及一種香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物和篩選方法。

背景技術(shù)：

香港牡蠣Crassostrea hongkongensis又稱白蠔，隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、珍珠貝目(Pterioidae)，牡蠣科(Ostridae)、巨蠣屬(Crassostrea)。主要分布于中國廣西、廣東和海南沿海河口附近。由于其個(gè)體大、肉體肥、口味鮮美等優(yōu)點(diǎn)，在市場(chǎng)價(jià)值方面遠(yuǎn)高于其它牡蠣類，因此在廣東汕頭、汕尾、惠州、珠海、鎮(zhèn)海灣、陽江、湛江、廣西北海、欽州灣等地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重問題：自1992年起廣東沿海香港牡蠣就開始出現(xiàn)周期性大規(guī)模死亡現(xiàn)象；另外香港牡蠣的養(yǎng)殖周期長，冬、春季節(jié)的死亡率比較高。近年來在香港牡蠣種苗繁育及養(yǎng)成過程中出現(xiàn)的問題，提示了實(shí)現(xiàn)牡蠣良種化是促進(jìn)我國香港牡蠣養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)性發(fā)展的關(guān)鍵因素。另外，香港牡蠣的養(yǎng)殖一般采用半人工采集野生苗為主的方法，存在養(yǎng)殖成活率低、破壞野生資源等問題。為了保護(hù)香港牡蠣的野生種質(zhì)資源，增加人工養(yǎng)殖效率，對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)資源分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳育種等相關(guān)工作已經(jīng)非常迫切。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性信息高、共顯性、符合孟德爾分離規(guī)律、易于PCR擴(kuò)增、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于海洋貝類的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因定位和遺傳育種等領(lǐng)域。但目前在香港牡蠣中開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記主要是兩堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記且數(shù)量不多(Xia等，Conservation Genetics 2009,10:1829-1832；Li等，Conservation Genetics resources 2010,2:93-96；Xiao等，Conservation Genetics resources 2011,3:413-415；Li等，Indian Academy of Sciences 2011,90:e58-e61；Zhao等，Genes Genomics 2015,37:615-620)，而針對(duì)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選工作還未見報(bào)道。

三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記在應(yīng)用和操作上具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。人們?cè)趯?duì)水稻基因組中微衛(wèi)星DNA序列的分析中，得出在蛋白質(zhì)編碼區(qū)有較多三堿基重復(fù)微衛(wèi)星DNA序列的結(jié)論(Temnykh et al，2001)，因此三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記在基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面更有優(yōu)勢(shì)。另外現(xiàn)階段的微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用中，在測(cè)序儀上進(jìn)行大批量地、精確地基因分型越來越普遍，也越來越重要，而兩堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記在毛細(xì)管測(cè)序膠上很容易出現(xiàn)影子帶、雜帶，影響了基因分型的準(zhǔn)確性，而三重復(fù)重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記卻可以減少這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，增加了它的應(yīng)用前景和范圍。因此需要針對(duì)香港牡蠣建立高效的三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)技術(shù)并篩選更多三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記用于良種選育相關(guān)的遺傳分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能夠高效大量篩選更多香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方法。

本發(fā)明的香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：提取香港牡蠣的基因組DNA，然后構(gòu)建香港牡蠣微衛(wèi)星(CAT)₁₂富集文庫，再PCR篩選微衛(wèi)星序列陽性克隆，然后測(cè)序，篩選獲得香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記。

優(yōu)選，具體步驟為：

提取香港牡蠣的基因組DNA，然后用限制性核酸內(nèi)切酶Mse I酶切基因組，回收400-900bp的酶切產(chǎn)物，再將此酶切產(chǎn)物與寡核苷酸鏈A和B連接，以連接產(chǎn)物作為模板，用寡核苷酸鏈A作為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，回收400bp以上的片段，得到純化產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(CAT)₁₂雜交，將雜交液加入到平衡好的磁珠中進(jìn)行吸附，洗脫以去除非目的片段，然后變性收集含有微衛(wèi)星核心的片段，得到富集產(chǎn)物，以富集產(chǎn)物作為模板，以寡核苷酸鏈A作為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，回收400bp以上的片段，得到第二次PCR純化產(chǎn)物，將第二次PCR純化產(chǎn)物與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，然后以感受態(tài)細(xì)胞作為模板，以SP6、T7和(CAT)₈為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，出現(xiàn)兩條或兩條以上的為含有微衛(wèi)星核心的陽性克隆，再對(duì)陽性克隆轉(zhuǎn)入的第二次PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序得到微衛(wèi)星序列，再對(duì)微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，以香港牡蠣牡蠣基因組DNA作為模板，以微衛(wèi)星引物作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，篩選能擴(kuò)增出穩(wěn)定目的條帶的微衛(wèi)星引物作為備選引物，然后再分別以若干個(gè)香港牡蠣的基因組DNA作為模板，以備選引物作為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，篩選具有豐富多態(tài)性的PCR產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的備選引物，該備選引物即為香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星引物；

所述的寡核苷酸鏈A的核苷酸序列為：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；

所述的寡核苷酸鏈B的核苷酸序列為：5’-TACTCAGGACTCAT-3’。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物，其特征在于，其包括6個(gè)位點(diǎn)的三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物，具體為：

針對(duì)Ch614位點(diǎn)的引物：5’-TCCCAACTTACACCAGCA-3’(SEQ ID No.1)和5’-GAAACCAAATCTACCACGAC-3’(SEQ ID No.2)；

針對(duì)Ch617位點(diǎn)的引物：5’-TTAGACGCCCGACCCTTT-3’(SEQ ID No.3)和5’-AATCCGCCAGTGTCATCC-3’(SEQ ID No.4)；

針對(duì)Ch623位點(diǎn)的引物：5’-CAAAGTGCCAACCCGTAA-3’(SEQ ID No.5)和5’-ACCATCAATCTCACCACCAC-3’(SEQ ID No.6)；

針對(duì)Ch627位點(diǎn)的引物：5’-ACTAGAAGTGCAGCAACA-3’(SEQ ID No.7)和5’-AAAATCAGGAGTGCTTGC-3’(SEQ ID No.8)；

針對(duì)Ch733位點(diǎn)的引物：5’-TGAGTTCTGCATCTTCTCA-3’(SEQ ID No.9)和5’-CATACATTATCTGCTGTCG-3’(SEQ ID No.10)；

針對(duì)Ch737位點(diǎn)的引物：5’-ACAAACCCTCAAACAACG-3’(SEQ ID No.11)和5’-ACTTCTCACGGGTCAACA-3’(SEQ ID No.12)。

采用本發(fā)明的篩選方法，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記，從而為其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子標(biāo)記輔助育種提供有效工具。

本發(fā)明的香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的多態(tài)性，并且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，可用于香港牡蠣多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

附圖說明：

圖1是Ch614位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

圖2是Ch617位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

圖3是Ch623位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

圖4是Ch627位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

圖5是Ch733位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

圖6是Ch737位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的銀染PAGE圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

1、香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建

1.1基因組DNA的提取與酶切

取70％酒精固定的香港牡蠣閉殼肌組織30mg，去離子水浸泡3次，每次15min后換水，以徹底去除肌肉中殘存的酒精。用干凈的濾紙吸除水分后放入1.5mL離心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，55℃水浴消化3～5h。加入等體積飽和酚(200μL)、氯仿/異戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70％酒精洗滌，室溫晾干后溶于100μL的超純水中，得到香港牡蠣的基因組DNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，并用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。利用限制性核酸內(nèi)切酶Mse I酶切基因組，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，膠回收試劑盒純化回收400-900bp的酶切產(chǎn)物。

1.2連接接頭

寡核苷酸鏈A(5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)和B(5’-TACTCAGGACTCAT-3’)溶液各10μl于PCR小管中混合，在95℃變性10min，然后自然冷卻。步驟1.1的酶切產(chǎn)物與雙鏈接頭(寡核苷酸鏈A和B)的連接采用T4DNA接酶，16℃過夜連接，得到連接產(chǎn)物。

1.3第一次PCR擴(kuò)增

以步驟1.2的連接產(chǎn)物為模板，寡核苷酸鏈A為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，25uL反應(yīng)體系如下：12.5uLGreen Master Mix(Promega公司)，2.5uL引物，2uL連接產(chǎn)物，加滅菌水補(bǔ)至25uL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)25次；72℃延伸10min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收400bp以上的片段并去除多余的引物、dNTP等，得到純化產(chǎn)物。

1.4磁珠富集及第二次PCR擴(kuò)增

將步驟1.3的純化產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(CAT)₁₂((CAT)₁₂是指CAT重復(fù)12次的序列)在56℃雜交4小時(shí)。將雜交液加入已平衡好的磁珠中，室溫放置30分鐘并輕輕混勻。再通過多次洗脫去除非目的片段，最后通過95℃變性5分鐘收集含有微衛(wèi)星核心的片段，得到富集產(chǎn)物。以富集產(chǎn)物為模板，寡核苷酸鏈A為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序同第一次PCR。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收400bp以上的片段，得到第二次PCR純化產(chǎn)物。

1.5連接轉(zhuǎn)化

將第二次PCR純化產(chǎn)物加入pGEM-T Easy載體(Promega公司)于4℃連接過夜。轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞。

1.6三引物法檢測(cè)陽性克隆、測(cè)序及引物設(shè)計(jì)

用SP6(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’)、T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’)和(CAT)₈((CAT)₈是指CAT重復(fù)8次的序列)為引物，以轉(zhuǎn)化了第二次PCR純化產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞的DNA作為模板，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)30次；72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，出現(xiàn)兩條或兩條以上的為含有微衛(wèi)星核心的陽性克隆，對(duì)其利用ABI3730進(jìn)行單向測(cè)序。利用Primer5.0軟件對(duì)微衛(wèi)星序列共設(shè)計(jì)了30對(duì)微衛(wèi)星引物，在一個(gè)香港牡蠣野生群體中進(jìn)行了PCR擴(kuò)增檢測(cè)，最終有15對(duì)微衛(wèi)星引物能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定目的條帶。

2、香港牡蠣多態(tài)性三堿基重復(fù)微衛(wèi)星引物的篩選和結(jié)果分析

參照1.1方法分別提取30個(gè)香港牡蠣個(gè)體的基因組DNA，以其作為模板，然后以1.6的能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定目的條帶的15對(duì)微衛(wèi)星引物作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10uL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)30次，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染法染色，UMAX掃描儀進(jìn)行掃描。共得到6個(gè)具有豐富多態(tài)性的三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記(表1，其擴(kuò)增產(chǎn)物如表1中所示的引物序列)：Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737。

Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737的PCR產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染法染色，UMAX掃描儀進(jìn)行掃描的圖如圖1-6所示，由圖1-6可知，本發(fā)明的6個(gè)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星引物在30個(gè)香港牡蠣中都出現(xiàn)了良好的多態(tài)性，并且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，可用于香港牡蠣多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。因此可以通過針對(duì)Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737位點(diǎn)的引物(表1中所示)擴(kuò)增相應(yīng)的三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)香港牡蠣的多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

從上面可以看出，采用本發(fā)明的篩選方法，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的香港牡蠣三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記，從而為其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子標(biāo)記輔助育種提供有效工具。

表1三堿基重復(fù)微衛(wèi)星引物特性表