本發(fā)明屬于藥用植物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世緯苣苔Tengia scopulorum Chun，又名黔苣苔，中國貴州特有珍稀瀕危藥用植物。當(dāng)年鄧世緯先生與助手楊昌漢、徐方才、黃孜文四人為了采集這批植物野外染病，相繼殉職，付出了生命的代價。如今原模式產(chǎn)地（貴定平伐）種群疑似已經(jīng)消亡。就生物多樣性而言，瀕危物種是優(yōu)先保護對象。并且世緯苣苔對于苦苣苔科系統(tǒng)分類和進化發(fā)育的研究具有非常重要的科學(xué)價值與意義，是不可替代的寶貴材料。同時受資源量限制，世緯苣苔的藥用研究尚屬空白。保護及進一步的科學(xué)研究，面臨的首要問題都是原植物的鑒定。而傳統(tǒng)的植物形態(tài)鑒定必須要等到花期，具有較大的時間限制，對操作人員的鑒別能力有較高的要求。同時由于樣本量和相關(guān)研究較少，現(xiàn)有文獻也未公開有用于世緯苣苔的DNA鑒定識別條形碼序列。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有世緯苣苔的物種鑒定存在鑒別時間段限制以及鑒別難度較大的技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用，本鑒定方法從分子水平分析分析世緯苣苔的遺傳物質(zhì)，進而能夠快速準(zhǔn)確的鑒定植物世緯苣苔，為世緯苣苔的保護和藥用價值研究奠定基礎(chǔ)。

一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：獲取植物組織樣本并提取樣本DNA；

S2：采用ITS引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序；

和/或采用trnL-F引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物，電泳檢測分離出PCR擴增產(chǎn)物后，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序；

S3：將多次測序得到的序列通過DNAMAN軟件進行比對，剪去兩端不一致的不可信序列，得到植物組織樣本的ITS序列和trnL-F序列，將ITS序列與SEQ ID NO.13所示的序列進行比對，將trnL-F序列與SEQ ID NO.14所示的序列進行比對，以鑒定該植物組織樣本是否為世緯苣苔。

進一步的，在步驟S1中，所述植物組織樣本為帶有葉綠體的葉片組織樣本，并采用硅膠對所述植物組織樣本進行干燥。

進一步的，步驟S1包括：取0.5-2cm3的硅膠干燥葉片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷凍后用磨碎機碾磨30s，加入800μL65℃預(yù)熱過的CTAB溶液，再加入0.5%濃度的β-巰基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液為包括體積比為24：1的氯仿和異戊醇，搖勻10min；然后10℃，12000rpm,離心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，離心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，4℃，12000rpm,離心7min；取上清，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管；加入等量-20℃的異丙醇，-20℃下靜置1-2h，使DNA沉淀出來；靜置后，4℃，12000rpm,離心10min，棄上清；加入300μL 75%乙醇，洗滌兩次，每次4℃，12000rpm，離心10min；自然風(fēng)干30min左右，加60μL的DDH₂O溶解DNA30min左右，得到樣本DNA；用凝膠電泳檢測總DNA。

進一步的，步驟S2中，PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，ITS上游引物或trnL-F上游引物 2 μL，ITS下游引物或trnL-F下游引物 2μL；

所述dNTP的濃度為2.5 mmol/L，所述ITS上游引物、trnL-F上游引物、ITS下游引物、trnL-F下游引物的濃度均為2 mmol/L。

進一步的，步驟S2中，PCR擴增的反應(yīng)過程包括：94℃預(yù)變性4min后進入循環(huán)，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)32次，72℃延伸10min。

進一步的，步驟S3中還包括：將得到的ITS序列和trnL-F序列輸入植物遺傳序列數(shù)據(jù)庫進行比對，確定近緣物種。

如上所述的SEQ ID NO.13序列在世緯苣苔鑒定中的應(yīng)用。

如上所述的SEQ ID NO.14序列在世緯苣苔鑒定中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明提供的世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法，是本發(fā)明人通過不同引物PCR擴增試驗后發(fā)現(xiàn)，采用ITS引物和trnL-F引物進行PCR擴增后得到的ITS序列和trnL-F序列具有與其他種類植物較大的區(qū)別特征，即ITS序列和trnL-F序列與其他物種的遺傳序列具有較大的區(qū)分度，將其應(yīng)用于世緯苣苔的物種鑒定，與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定相比，本DNA序列鑒定方法受植物生長期限制小，鑒定所需的植物組織材料極少，格外適用于珍稀瀕危植物的鑒定；另一方面本方法能夠降低鑒定鑒定過程的不穩(wěn)定因素，同時因為序列的量化特征而減少了人為主觀的介入，使得世緯苣苔的鑒定過程更加快速準(zhǔn)確，為世緯苣苔的保護與研究提供了可靠依據(jù)。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

本實施例采用的材料是貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授在貴陽市發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個世緯苣苔居群的隨機采樣樣本，憑證標(biāo)本存放于中科院植物研究所王印政研究組，標(biāo)本編號LMT-2012-016。選取居群不同位置點多個植株的新鮮葉片各1片，立即用硅膠干燥封存。

取世緯苣苔硅膠干燥的葉片，采用改良后的CTAB法提取總DNA。

提取總DNA操作為：取0.5-2cm3的硅膠干燥葉片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷凍后用磨碎機碾磨30s，加入800μL65℃預(yù)熱過的CTAB溶液（十六烷基三甲基溴化銨溶液），再加入0.5%濃度的β-巰基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液為包括體積比為24：1的氯仿和異戊醇，搖勻10min；然后10℃，12000rpm,離心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，離心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，搖勻，4℃，12000rpm,離心7min；取上清，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管。加入等量-20℃的異丙醇，-20℃下靜置1-2h，使DNA沉淀出來；靜置后，4℃，12000rpm,離心10min，棄上清；加入300μL 75%乙醇，洗滌兩次，每次4℃，12000rpm，離心10min；自然風(fēng)干30min左右，加60μL的DDH₂O（雙蒸水）溶解DNA30min左右，得到樣本DNA；用凝膠電泳檢測總DNA（取2μL母液，用6× Loading buffer）。

采用ITS引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，ITS上游引物（2 mM）2 μL，ITS下游引物（2 mM） 2μL。

PCR擴增的反應(yīng)過程包括：94℃預(yù)變性4min后進入循環(huán)，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)32次，72℃延伸10min,得到PCR擴增產(chǎn)物。

用1%瓊脂糖的凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后，對PCR擴增產(chǎn)物送華大基因做雙向測序。

用DNAMAN將3次測得序列進行比對，剪去兩端不一致的不可信序列，得到SEQ ID NO.13序列，長617個堿基。

將得到的SEQ ID NO.13序列輸入“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，顯示最接近的物種顯示為Tengia scopulorum [Petrocodon scopulorus]，序列相似性99.2%。

將得到的SEQ ID NO.14序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，最接近的物種顯示為Tengia scopulorum，序列相似性99%。

實施例2

本實施例包括如實施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實施例中采用trnL-F引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL， trnL-F上游引物（2 mM）2 μL，trnL-F下游引物（2 mM） 2μL。

最終得到SEQ ID NO.14序列，長838個堿基。

將得到的SEQ ID NO.14序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，在以“ident”為優(yōu)先排序條件下，最接近的物種顯示為Tengia scopulorum，序列相似性99%。

對比例1

本對比例包括如實施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實施例中采用rbcL引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述rbcL引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.5所示）和rbcL下游引物（如SEQ ID NO.6所示）。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，rbcL上游引物（2 mM）2 μL，rbcL下游引物（2 mM） 2μL。。

得到SEQ ID NO.15序列，長636個堿基。

將SEQ ID NO.15序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，最接近的物種顯示為Primulina liboensis，序列相似性99%。

對比例2

本對比例包括如實施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實施例中采用matK引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述matK引物包括rbcL上游引物（如SEQ ID NO.7所示）和matK下游引物（如SEQ ID NO.8所示）。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，matK上游引物（2 mM）2 μL，matK下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.16序列，長847個堿基（比對后末端做了近200個堿基剪除后的長度）。

將SEQ ID NO.16序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，最接近的物種顯示為Petrocodon coriaceifolius，序列相似性99%。

對比例3

本對比例包括如實施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實施例中采用atpI-H引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述matK引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.9所示）和atpI-H下游引物（如SEQ ID NO.10所示）。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，atpI-H上游引物（2 mM）2 μL，atpI-H下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.17序列，長867個堿基（比對后前端做了約70個堿基剪除后的長度）。

將SEQ ID NO.17序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，最接近的物種顯示為Petrocosmea iodioides，序列相似性98%。

對比例4

本對比例包括如實施例1中的大部分技術(shù)特征，其不同之處在于：

本實施例中采用rps16引物對樣本DNA進行PCR擴增，所述rps16引物包括atpI-H上游引物（如SEQ ID NO.11所示）和rps16下游引物（如SEQ ID NO.12所示）。

PCR擴增的反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH₂O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，樣本DNA 1 μL，rps16上游引物（2 mM）2 μL，rps16下游引物（2 mM） 2μL。

得到SEQ ID NO.18序列，長760個堿基

將SEQ ID NO.18序列輸入NCBI的BLAST網(wǎng)頁的數(shù)據(jù)庫中進行物種鑒定，最接近的物種顯示為Primulina dryas，序列相似性98%。

結(jié)果分析

實施例1-2、對比例1-4中所采用的ITS引物、trnL-F引物、rbcL引物、matK引物、atpI-H引物和rps16引物均為現(xiàn)有引物，根據(jù)鑒定效果分析，確定世緯苣苔的DNA鑒定識別條形碼為核DNA的ITS序列（SEQ ID NO.13序列）和葉綠體DNA的trnL-F序列（SEQ ID NO.14序列）。

DNA片段應(yīng)用于植物鑒定直接而有效，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于數(shù)據(jù)的預(yù)先存儲。就像形態(tài)鑒定依據(jù)的植物志，DNA鑒定所需的植物DNA數(shù)據(jù)庫的預(yù)儲存及鑒定效果評價至關(guān)重要。對比例序列，如世緯苣苔rbcL、matK、atpI-H、rps16，缺少預(yù)先儲存的絕對近緣DNA數(shù)據(jù)，所以無法應(yīng)用于鑒定。另一方面，有些片段對具體物種的區(qū)分度過低，也無法應(yīng)用于鑒定；如世緯苣苔的matK序列，與其序列相似性99%的物種序列目前已達20多個，難以區(qū)分；rbcL、atpI-H、rps16序列也在植物DNA數(shù)據(jù)庫找到序列相似性較高的其他物種，區(qū)分度不夠。

DNA鑒定比之形態(tài)鑒定的優(yōu)勢主要有：受植物生長期限制極小，鑒定所需采取的材料極少，同時因為序列的量化特征而減少了人為主觀的介入。其中對生長期與材料的極小要求特征，格外適用于珍稀瀕危植物的鑒定。

單一序列片段對廣泛物種鑒定的區(qū)分度有限，需要更可靠的多序列組合鑒定條形碼，來達到準(zhǔn)確鑒定的目的。故本研究確定的ITS和trnL-F序列條形碼相互結(jié)合能達到對珍稀瀕危藥用植物世緯苣苔的快速準(zhǔn)確鑒定，為世緯苣苔的保護與研究提供了可靠依據(jù)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

<110> 劉, 明濤

<120> 一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法及核苷酸序列的應(yīng)用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

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tcctccgctt attgatatgc 20

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gaaggacacg atccgytgtg gat 23

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catgttcaaa cgtgcttgcg ttcgcgatgg tggatgcttc ttgcgtccaa catcacgacc 60

tcgaccccaa gcggcgcaag tctcttgggc gtaccaacct ctcggcgcgg aaagcgccaa 120

ggaaaagcat accgaacgcc tctccatcct ggtgctgttc gcggtaccca ggacgtgacg 180

aggagcgtct attgagtata gatataacga ctctcggcaa cggatatctc ggctctcgca 240

tcgatgaaga acgtagcgaa atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat 300

cgagtctttg aacgcaagtt gcgtccgaag ccatcaggct gagggcacgt ctgtctgggc 360

gtcacgcgtc tcgtcgcccc ctcccacatc ttcttccccc actcgagggt gccgggagat 420

gatggcgcac gaaggagggg cggatattgg cctcccgttg tccttgtgta gcggctggca 480

caaataacat accgtgtcga aggaagtcac acgatacgtg gtggttggat tcctcaactt 540

gcgagctgtc gtgtaggact gcatcgagcc acgggcacga cccaatggcg aaaggtcgcc 600

ctcgatcgcg accccag 617

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gtgaagactt tcaaattcag agaaaccctg gaattaataa aaatgggcaa tcctgagcca 60

aatcctgttt tctcaaaaca agggttcaga gagcgaaaaa gaggataggt gcagagactc 120

aatgggagct gttctaacaa atggagttga ccgcgttggt agaaaaattg aaacttcaga 180

aaggatgaag gataaacgta tctattgaat actattgatg attaataatg gcccgaatct 240

gtatctgggt ttttgtatat gaaaaataga agaattggtg tgaattgatt tcacattgat 300

aaaagaatcg aatatttatt aatcaaatca ttcactccat agtccgatag atctcttaaa 360

gaacttatta ttcggacgag aataaagata gagtcccgtt ctacatgtca ataccggcaa 420

caatgaaact tatagtaaaa ggaaaatccg tcgactttaa aaatcgtgag ggttcaagtc 480

cctctatccc caaaaaaatc atataattga ctcccaaaat atttatccta tccgctttgt 540

tcgttaacgg ttcaaaattc ctttatcttt ctaattcttt tacaaatgtc tttggtcgta 600

aatgactttc tcttctcaca tgtgatatag aatatacatt caaagaatcc ttattagaat 660

aataatagca ttacacatac tgatacttac aaagtcgtct ttttaaagat ccaagagatt 720

agagacttgg agaaaacttt gtaattttcc cttgtccctt ataattgaca tagaccccag 780

tcccataata aaatgaggat gggatgctac attgggaatg gtcgggatag ctcagctg 838

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gagtacaaat tgacttatta tactcctgaa tatgaaacta aagatactga tatcttggca 60

gcattccgag taactcctca acctggagtt ccgcctgaag aagcaggggc ggcggtagct 120

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tgttatgtag cttacccttt agaccttttt gaagaaggtt ctgttactaa tatgtttact 300

tccattgtag gcaatgtatt tggattcaaa gcccttcgtg ctctacgtct ggaagatctg 360

cgaatcccta ctgcttatat taaaactttc caaggcccgc ctcatgggat ccaagttgaa 420

agagataaat tgaacaagta tggtcgtccc ctgttgggat gtactattaa accaaaactg 480

ggcttatctg ctaaaaacta cggtagagcg gtttatgaat gtcttcgcgg cggacttgat 540

tttaccaaag atgacgagaa cgtgaactcc cagccattta tgcgttggag agatcgtttc 600

ttattttgtg ccgaagccct ttataaagca caggct 636

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<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

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tccagtttac tgattgtgaa acggttaatt actcgaatgt atcaacagaa ttatttgatt 60

atttctccta atgattctaa tcaaaattcc tttttgggac gcaacaataa tttctattct 120

caaatcatat cagaggggtt gggatttatt gtggaaattc cattttctct acgattaata 180

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gcctattctt tgcatttatt acgattcttt ctcaacgagc attgtaattg gaatagtttt 420

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ttatataatt cttatgtatg tgaatacgaa tccattttcg tctttctacg taaccaatct 540

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atagaacgtc ttgtgaacgt ctttgttaag gttaactatt ttcagacgaa cttatggttg 660

gtgaaggaat cttgcatgca ttatgttagg tatcaaagaa aatccatttt ggcttcaaaa 720

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ctaagattcc ccttttcgtc cacttaatat catatcgtat ttttattcaa ggaatattta 60

ctatatatta tattggtccg ccaatcttct taattcatca aatcataatt tcaataagat 120

atatgtttac gacgtgtgag taaataaaaa accggagaac ctattctact ttacagttca 180

ttttattcaa caattgacca aaagaaaata ttttattaat aaataaaata ataaattgca 240

tgaacttaga tcaatcaaat aatgatattt ctatccaata atgggcctta atcaatttca 300

atttaatttg cccatttaga ttagattgta ttcggttgga atggtaataa cgaaaacgga 360

aggaagaaaa aaaatttaca aaacaaaaat gggattccta aaaaaataga tagattctcg 420

aatctgattg aatttaatgg tttacgttat ggaagaaaca cgtgtatatg tgatattaga 480

tattgactag ttatatatga actaaagata tatttaattt ctcctactac tgtagggggg 540

ttctaacaga agtcctttcg tctcgtttcg actgtgactt gcctgaataa agagatgaaa 600

tcaagaaaag ctgaaagaat tgtgaaataa cagtttggaa ccaagaaatg taaaaacgag 660

aattctatgg attcgcgaag actctgtgga tagaaacgaa aaaggatata tcgaagtagt 720

tctgataatt caataatatt attactgaaa ttcgaagttc ttagttactt cgactagatt 780

aatcctatcg atcgaataat taagtcataa ttcattggtt gattgtatca ttaaccattt 840

ctttttgttg gtacgaggaa cttatca 867

<210> 18

<211> 760

<212> DNA

<213> 世緯苣苔（Tengia scopulorum Chun）

<400> 18

tgaagatgct cttgtctcga catcgtttgt tctgttacac ctgaatcctt tgtttttttg 60

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