1.一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,包括以下步驟:
S1:獲取植物組織樣本并提取樣本DNA;
S2:采用ITS引物對樣本DNA進行PCR擴增,所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物,電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后,對PCR擴增產(chǎn)物進行測序;
和/或采用trnL-F引物對樣本DNA進行PCR擴增,所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物,電泳檢測分離出PCR擴增產(chǎn)物后,對PCR擴增產(chǎn)物進行測序;
S3:將多次測序得到的序列通過DNAMAN軟件進行比對,剪去兩端不一致的不可信序列,得到植物組織樣本的ITS序列和trnL-F序列,將ITS序列與SEQ ID NO.13所示的序列進行比對,將trnL-F序列與SEQ ID NO.14所示的序列進行比對,以鑒定該植物組織樣本是否為世緯苣苔。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,在步驟S1中,所述植物組織樣本為帶有葉綠體的葉片組織樣本,并采用硅膠對所述植物組織樣本進行干燥。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,步驟S1包括:取0.5-2cm3的硅膠干燥葉片置于2mL的EP管中,放入小磁珠,液氮冷凍后用磨碎機碾磨30s,加入800μL65℃預熱過的CTAB溶液,再加入0.5%濃度的β-巰基乙醇10μL,65℃水浴2h;加入800μL的CI溶液,所述CI溶液為包括體積比為24:1的氯仿和異戊醇,搖勻10min;然后10℃,12000rpm,離心10min;取上清至2mL的EP管中,加CI溶液,搖勻,離心;取上清至1.5mL的EP管中,加CI溶液,搖勻,4℃,12000rpm,離心7min;取上清,轉至1.5mL的EP管;加入等量-20℃的異丙醇,-20℃下靜置1-2h,使DNA沉淀出來;靜置后,4℃,12000rpm,離心10min,棄上清;加入300μL 75%乙醇,洗滌兩次,每次4℃,12000rpm,離心10min;自然風干30min左右,加60μL的DDH2O溶解DNA30min左右,得到樣本DNA;用凝膠電泳檢測總DNA。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,步驟S2中,PCR擴增的反應體系包括:10×Buffer 2 μL,dNTP 1.6 μL,DDH2O 11.3 μL,Taq酶 0.1 μL,樣本DNA 1 μL,ITS上游引物或trnL-F上游引物 2 μL,ITS下游引物或trnL-F下游引物 2μL;
所述dNTP的濃度為2.5 mmol/L,所述ITS上游引物、trnL-F上游引物、ITS下游引物、trnL-F下游引物的濃度均為2 mmol/L。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,步驟S2中,PCR擴增的反應過程包括:94℃預變性4min后進入循環(huán),94℃變性45s,54℃退火45s,72℃延伸45s,循環(huán)32次,72℃延伸10min。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種世緯苣苔的核苷酸序列鑒定方法,其特征在于,步驟S3中還包括:將得到的ITS序列和trnL-F序列輸入植物遺傳序列數(shù)據(jù)庫進行比對,確定近緣物種。
7.根據(jù)權利要求1-6中任意一項所述的SEQ ID NO.13序列在世緯苣苔鑒定中的應用。
8.根據(jù)權利要求1-6中任意一項所述的SEQ ID NO.14序列在世緯苣苔鑒定中的應用。