本發(fā)明屬于黑鯛鑒別領(lǐng)域，特別涉及一種鑒別黑鯛及黑鯛真鯛反交子代的方法。
背景技術(shù)：
：黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)又稱黑棘鯛，具有肉質(zhì)細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性好、抗病能力強(qiáng)的特點(diǎn)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于其生長(zhǎng)速度較慢，在整個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)一般要經(jīng)歷兩次越冬，養(yǎng)殖成本居高不下，限制了黑鯛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來(lái)，江蘇省海洋水產(chǎn)研究所通過(guò)與真鯛雜交的方式對(duì)其進(jìn)行遺傳改良，獲得了兩種性狀優(yōu)良的正交(真鯛(♀)×黑鯛(♂))和反交(黑鯛(♀)×真鯛(♂))子代，具有較好的養(yǎng)殖前景。正交子代的形態(tài)結(jié)合了雙親的特點(diǎn)，體型與真鯛一致，顏色和花紋則更接近于黑鯛，從外觀上比較容易與親本區(qū)分開來(lái)；反交子代在外觀上與黑鯛則幾乎完全一致，基于形態(tài)參數(shù)對(duì)二者進(jìn)行鑒別的方法在實(shí)際操作中也存在著一定誤差，這為養(yǎng)殖和育種管理工作帶來(lái)不便。經(jīng)過(guò)兩年的養(yǎng)殖，反交子代已經(jīng)性成熟，并有可能成為一種新的重要育種材料，這就為反交子代與黑鯛的鑒別提出了更高的要求，而分子方法則是目前最為可靠的鑒別手段。采用分子方法進(jìn)行鑒別的第一步通常是鑒別對(duì)象基因組DNA的提取，目前最常用的DNA提取方式是酚/氯仿抽提法，該方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且提取試劑多具毒性。而試劑盒提取的成本則較高，不適合大量鑒別操作。物種的分子鑒別一般對(duì)DNA的要求不高，且所提DNA通常僅使用一次即被丟棄，因此，一種簡(jiǎn)便、快速、低成本的DNA提取方式將為鑒別工作提供極大便利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鑒別黑鯛及黑鯛真鯛反交子代的方法，該方法鑒別準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速、價(jià)格低廉、對(duì)儀器設(shè)備要求低，適合大規(guī)模鑒別操作，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種鑒別黑鯛及黑鯛真鯛反交子代的方法，包括：(1)提取黑鯛及黑鯛真鯛反交子代樣品的基因組DNA；(2)采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，引物序列為：5’-GCTGAACTGAGGTGGCTGAT-3'；5’-AGCTTGAGCAGGACTGAACC-3'；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后拍照記錄比對(duì)電泳結(jié)果，黑鯛真鯛反交子代在215bp處有一條特異性條帶，黑鯛在215bp處無(wú)特異性條帶。所述步驟(1)中的樣品為新鮮鰭條樣品或無(wú)水乙醇保存樣品。所述步驟(1)中的提取采用組成為1％TritonX-100和pH＝8.0、100mMTris-HCl的提取緩沖液。所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增體系為：1.5μL10×PCRbuffer，0.5μLdNTP，1.0μLMg2+，1.5μLDNA提取液，上下游引物各0.5μL，0.2μLTaqDNA聚合酶，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。所述步驟(3)中凝膠電泳為2％瓊脂糖凝膠電泳或8％聚丙烯酰胺凝膠電泳。本發(fā)明是基于分子生物學(xué)技術(shù)原理建立的鑒別方法。該方法無(wú)需依賴專業(yè)的分類學(xué)背景，也不要求具有長(zhǎng)期從事魚類鑒別的豐富經(jīng)驗(yàn)；無(wú)需高級(jí)的熒光定量等實(shí)施操作儀器，只需要簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)儀器就可以進(jìn)行操作，具有準(zhǔn)確快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。有益效果(1)本發(fā)明克服了形態(tài)學(xué)特征無(wú)法準(zhǔn)確鑒別黑鯛及黑鯛(♀)×真鯛(♂)雜交子代的不足，在遺傳育種工作中具有重要意義；(2)本發(fā)明根據(jù)微衛(wèi)星引物對(duì)DNA模板要求相對(duì)較低的特點(diǎn)，采用了一種可快速提取基因組DNA的簡(jiǎn)易方法，大大提高了鑒別效率；(3)本發(fā)明鑒別準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速、價(jià)格低廉、對(duì)儀器設(shè)備要求低，適合大規(guī)模鑒別操作，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1為真鯛、黑鯛及正、反交子代的外觀對(duì)比圖；圖2為黑鯛及反交子代的電泳圖片；其中，M為50bpDNAladder，1-8為黑鯛，9-16為反交子代，反交子代在215bp附近有一條清晰的特異性鑒別條帶。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(1)取20μg黑鯛及黑鯛(♀)×真鯛(♂)雜交子代鰭條樣品于1.5mL離心管中，用玻璃研磨棒將樣品在管壁充分研磨；加入200μL提取緩沖液(1％TritonX-100和100mMTris-Hcl(pH＝8.0))，震蕩1min充分混勻；恒溫水浴鍋65℃放置30min，期間間或混勻；取出樣品，冷卻，靜置5min，上清即為DNA提取液；(2)采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，引物序列為：5’-GCTGAACTGAGGTGGCTGAT-3'；5’-AGCTTGAGCAGGACTGAACC-3'；PCR擴(kuò)增體系為：1.5μL10×PCRbuffer，0.5μLdNTP(10mmol/L)，1.0μLMg2+(25mmol/L)，1.5μLDNA提取液，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，0.2μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，52℃退火45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳顯色后拍照記錄比對(duì)電泳結(jié)果，黑鯛真鯛反交子代在215bp附近有一條清晰的特異性鑒別條帶，黑鯛在215bp處無(wú)特異性條帶，如圖2所示。以某黑鯛及黑鯛真鯛反交子代養(yǎng)殖池塘為例，任取30條魚分別采用上述方法以及人工形態(tài)學(xué)觀察鑒別，結(jié)果如下表：黑鯛黑鯛真鯛反交子代準(zhǔn)確率標(biāo)準(zhǔn)1812/本實(shí)施例1812100％形態(tài)參數(shù)鑒別151583.3％由此可見，本發(fā)明相較于形態(tài)參數(shù)鑒別法可以保證100％的鑒別準(zhǔn)確率，判斷快速，具有良好的實(shí)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3