本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別百合品種黃天霸的PCR引物對(duì)、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

OT類型百合(Lilium spp.)是以東方百合(O型)與喇叭(T型)百合為親本進(jìn)行雜交選育而成，相比較東方系列百合品種容易退化，對(duì)栽培技術(shù)要求較高等不利因素，OT類型百合具有較明顯的優(yōu)勢(shì)，如：花朵大，氣味清香，栽培期短且簡(jiǎn)便、抗逆性強(qiáng)，不易退化等。因此，近年來(lái)，OT類型百合在市場(chǎng)上占有的份額越來(lái)越大，并逐漸受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。

黃天霸(Manissa)是目前市場(chǎng)上較為流行的OT類型百合品種之一，花朵碩大，花色金黃，莖稈挺拔粗壯，具有很好的市場(chǎng)前景。木門(Conca d’or)也是OT類型百合品種，花色和外形與黃天霸極為相似，這兩個(gè)品種均來(lái)自荷蘭。由于黃天霸有較高的觀賞價(jià)值和優(yōu)良的品種特性，因此種球批發(fā)價(jià)格比木門高出12.5％，單枝花朵售價(jià)比木門高1-2元，是木門價(jià)格的120-150％。所以不少百合種植者和很多花店零售業(yè)者利用它們二者外觀相似的特點(diǎn)，用木門假冒黃天霸，欺騙廣大的消費(fèi)者。而且，僅從外觀上區(qū)分二者準(zhǔn)確性較差，不足以用于海關(guān)品種鑒定、從技術(shù)上提供法律依據(jù)等對(duì)鑒別結(jié)果精確度要求較高的領(lǐng)域。

所以，目前市場(chǎng)上需要一種從分子水平上能夠有效、方便地區(qū)分出百合品種黃天霸和木門、以及其他常見(jiàn)OT類型百合品種的方法，而此類方法在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒別百合品種黃天霸的PCR引物對(duì)、試劑盒和方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種鑒別百合品種黃天霸的PCR引物對(duì)，其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:3的核苷酸序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

一種鑒別百合品種黃天霸的特異性條帶，由該引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到；該特異性條帶，具有序列表中的SEQ ID NO:5的核苷酸序列；或具有序列表中的SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

一種鑒別百合品種黃天霸的PCR試劑盒，包括：上述PCR引物對(duì)；

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該試劑盒還包括dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和PCR緩沖液；

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該試劑盒包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：所述引物對(duì)中兩條引物各0.2-0.8mmol/L，所述dNTP 5-20μmol/L，所述氯化鎂0.1-2mmol/L，所述DNA聚合酶0.2-0.5U/μL，Tris-HCL(pH7.5-9.0)1-5 mmol/L和KCL0.6-5 mmol/L作為所述PCR緩沖液。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該試劑盒包括的組分在PCR反應(yīng)體系中，PCR預(yù)混液的體積百分比為85-95％，所述引物對(duì)中兩條引物各0.1-1.5μmol/L。

一種鑒別百合品種黃天霸的方法，包括以下步驟：

PCR反應(yīng)步驟：利用上述PCR引物對(duì)或上述PCR試劑盒，以待測(cè)植物基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

檢測(cè)步驟：將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，如所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有特異性條帶，則所述待測(cè)植物為所述百合品種黃天霸。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

變性：94-95℃2-5分鐘；擴(kuò)增：94-95℃10-50秒，54-60℃15-50秒，72℃25-50秒，共計(jì)30-35個(gè)循環(huán)；延伸：72℃4-10分鐘。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法中：

當(dāng)所述PCR引物對(duì)為：其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸堿基序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:2的核苷酸堿基序列時(shí)，所述特異性條帶具有序列表中的SEQ ID NO:5的核苷酸序列；

當(dāng)所述PCR引物對(duì)為：其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:3的核苷酸堿基序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:4的核苷酸堿基序列時(shí)，所述特異性條帶具有序列表中的SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明利用特定的PCR引物對(duì)，對(duì)待測(cè)植物的基因組進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有特異性條帶；所以可以從分子水平上鑒別出該待測(cè)產(chǎn)物是否是百合品種黃天霸，相比從外觀上鑒別更加準(zhǔn)確。

2、本發(fā)明僅需要對(duì)待測(cè)植物的基因組進(jìn)行PCR反應(yīng)并檢測(cè)即可，所以簡(jiǎn)便、高效。

3、本發(fā)明應(yīng)用范圍廣泛，特別適用于對(duì)鑒別結(jié)果準(zhǔn)確度要求較高的領(lǐng)域，如：(1)可用于協(xié)助海關(guān)進(jìn)行品種鑒定；(2)可用于為國(guó)家百合品種分子標(biāo)記檢測(cè)提供依據(jù)和方法；(3)可用于為生產(chǎn)糾紛提供檢測(cè)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1的兩種百合在不同引物中的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖2為實(shí)施例1的不同退火溫度下3個(gè)RAPD引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖3為實(shí)施例1的菌落PCR的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖4為實(shí)施例1的測(cè)序后6對(duì)引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖5為實(shí)施例2的6種常見(jiàn)百合品種PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖6為實(shí)施例3的兩種常見(jiàn)百合品種PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

第一方面，本發(fā)明提供一種鑒別百合品種黃天霸的PCR引物對(duì)。其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或其中的一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:3的核苷酸序列，另一條引物具有序列表中的SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

第二方面，本發(fā)明提供一種鑒別百合品種黃天霸的特異性條帶。該特異性條帶由上述引物對(duì)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到，具有序列表中的SEQ ID NO:5的核苷酸序列；或由上述引物對(duì)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到，具有序列表中的SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種鑒別百合品種黃天霸的PCR試劑盒。該試劑盒所包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：上述PCR引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)中兩條引物各0.2-0.8mM，還包括dNTP 5-20μmol/L、氯化鎂0.1-2mmol/L、DNA聚合酶0.2-0.5U/μL；該試劑盒還含有PCR緩沖液(該P(yáng)CR緩沖液含有在反應(yīng)體系中終濃度為1-5 mM的Tris-HCL(pH7.5-9.0)和在反應(yīng)體系中終濃度為0.6-5mM的KCL)；該P(yáng)CR緩沖液由原PCR預(yù)混液稀釋而成，該原PCR預(yù)混液的濃度一般在為該P(yáng)CR緩沖液的1.1-10倍。

在上述PCR反應(yīng)體系中，還包括終濃度為1-3.75ng/μL的模板DNA。

優(yōu)選地，上述劑盒所包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：上述PCR引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4)中兩條引物各0.6mM，還包括dNTP 10μmol/L、氯化鎂0.5mmol/L、DNA聚合酶0.25U/μL、PCR緩沖液(含有2 mM Tris-HCL(pH8.0)和1.5mM KCL)；優(yōu)選地，在上述PCR反應(yīng)體系中，還包括終濃度為1.5ng/μL的模板DNA。

示例性地，上述反應(yīng)體系中的各個(gè)組分的終濃度可以為：模板DNA1ng/μL、1.5 ng/μL、2 ng/μL、2.5 ng/μL、3 ng/μL、3.5 ng/μL、3.75 ng/μL中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，引物對(duì)中兩條引物各0.2 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.8 mM中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，氯化鎂0.1mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、2mmol/L中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，dNTP 5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，DNA聚合酶0.2U/μL、0.25U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL、0.5U/μL中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，Tris-HCL(pH7.5-9.0)1mM、2mM、3mM、4mM、5mM中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，KCL0.6mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍。

更優(yōu)選地，上述劑盒所包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：

體積百分比為40-60％的2XEasyTaq PCR SuperMix(+dye)(優(yōu)選購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，正、反向引物各0.2-0.8mM；在上述PCR反應(yīng)體系中，還包括終濃度為1-3.75ng/μL的模板DNA。

進(jìn)一步優(yōu)選地，上述劑盒所包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：

體積百分比為50％的2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，正、反向引物各0.625mM；優(yōu)選地，在上述PCR反應(yīng)體系中，還包括終濃度為1.25ng/μl的模板DNA；

例如：20μL的反應(yīng)體系包括：2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)10μL，5mM的正、反向引物各2.5μL，10ng/μl模板DNA 2.5μL，ddH₂O足量。

示例性地，上述反應(yīng)體系中的各個(gè)組分的終濃度可以為：模板DNA 1ng/μL、1.5 ng/μL、2 ng/μL、2.5 ng/μL、3 ng/μL、3.5 ng/μL、3.75 ng/μL中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，引物對(duì)中兩條引物各0.2 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.8 mM中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)的體積百分比為40％、45％、50％、55％、60％中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍。

本發(fā)明的PCR試劑盒所包括的組分，在PCR反應(yīng)體系中的終濃度還可以為：體積百分比為85-95％的PCR預(yù)混液(具體為擎科新業(yè)TSE101-金牌Mix(1.1X)的PCR預(yù)混液，購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，正、反向引物各0.1-1.5μM；在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中，還包括5-20ng/μL的模板DNA；

優(yōu)選地，該劑盒所包括的組分在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為：體積百分比為91％的PCR預(yù)混液(具體為擎科新業(yè)TSE101-金牌Mix(1.1X)的PCR預(yù)混液)，正、反向引物各0.9μM；在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中，還包括13.6ng/μL的模板DNA；

例如：11μL的反應(yīng)體系包括：體積百分比為91％的PCR預(yù)混液(具體為擎科新業(yè)TSE101-金牌Mix(1.1X)的PCR預(yù)混液)10μL，20μM的正、反向引物混合液0.5μL(其中包括正、反向引物各20μM)；在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中，還包括300ng/μL的模板DNA0.5μL。

示例性地，上述反應(yīng)體系中的各個(gè)組分的終濃度可以為：模板DNA 5ng/μL、10ng/μL、15ng/μL、20ng/μL中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，引物對(duì)中兩條引物各0.1μM、0.5μM、0.8μM、1μmM、0.2μM、1.5μM中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，PCR預(yù)混液(具體為擎科新業(yè)TSE101-金牌Mix(1.1X)的PCR預(yù)混液)的體積百分比為85％、88％、90％、92％、95％中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍。

第四方面，本發(fā)明提供一種鑒別百合品種黃天霸的方法，該方法包括以下步驟：

步驟一、PCR擴(kuò)增反應(yīng)：利用上述PCR引物對(duì)或上述PCR試劑盒，以待測(cè)植物基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

變性：94-95℃2-5分鐘(示例性地，可以為2min、3min、4 min、5 min中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍)；擴(kuò)增：94-95℃10-50秒(示例性地，可以為10s、20s、30s、35s、40s、45s、50s中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍)，54-60℃(示例性地，可以為54℃、55℃、56℃、57℃、58℃中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍)15-50秒(示例性地，可以為15s、30s、35s、40s、45s、50s中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍)，72℃25-50秒(示例性地，可以為25s、30s、35s、40s、45s、50s)中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍，共計(jì)30-35個(gè)(實(shí)例性地，可以為30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)中任意數(shù)值及任意數(shù)值之間的范圍)循環(huán)；延伸：72℃4-10分鐘；

優(yōu)選地，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

變性：95℃3分鐘；擴(kuò)增：95℃30秒，58℃30秒，72℃40秒，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃7分鐘。

或：

變性：98℃2分鐘；擴(kuò)增：98℃10秒，58℃15秒，72℃25秒，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃4分鐘。

步驟二、檢測(cè)：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，如果利用引物對(duì)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2擴(kuò)增得到了特異性條帶SEQ ID NO:5，和/或利用引物對(duì)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4擴(kuò)增得到了特異性條帶SEQ ID NO:6；，則待測(cè)植物為百合品種黃天霸。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例為鑒別百合品種黃天霸的PCR引物對(duì)的獲取方法。本實(shí)施例共選用了77個(gè)分子標(biāo)記用以在分子水平上對(duì)百合品種黃天霸和木門進(jìn)行區(qū)分，最終篩選出3個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物差異明顯、重復(fù)性良好的RAPD標(biāo)記。利用這三個(gè)標(biāo)記，在37-47℃區(qū)間內(nèi)、在三種不同品牌的PCR儀上均可以將木門和黃天霸清楚地區(qū)分開(kāi)；將其中的一對(duì)引物(BD3)的二條特異擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果共設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，其中有2對(duì)引物可以清楚地將黃天霸與其它5個(gè)常見(jiàn)OT類型百合商品種區(qū)分開(kāi)。詳述如下：

一、材料和方法：

1、材料：

OT類型百合黃天霸(Manissa)、木門(Conca d’or)、黑幕(Black out)、爆發(fā)點(diǎn)(Flashpoint)、驚艷(Shocking)、羅賓娜(robina)種球均購(gòu)自北京圃朗特園藝有限公司；這6個(gè)商品種均為荷蘭進(jìn)口。

2、方法：

2.1、百合基因組DNA提?。?/p>

摘取上述6個(gè)品種的葉片，-40℃冷凍1天以上，然后置于真空干燥儀(CoolSafe 55-4)中脫水；

再取20μg干粉狀葉片，按照CTAB法提取DNA，具體步驟如下；

ⅰ.向所述干粉狀葉片中加入CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巰基乙醇)，混勻，于65℃水浴0.5小時(shí)，得到混合物A；

ⅱ.將混合物A停止水浴，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)抽提兩次，得到上清液A；

ⅲ.向上清A中加入2/3體積異丙醇用來(lái)沉淀DNA；再用洗滌緩沖液(75％乙醇)洗滌一次，吹干，再加TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；

ⅳ.向溶液A中加入RNase A，使其終濃度達(dá)100μg/mL，再混勻37℃水浴1小時(shí)；再用等體積氯仿/異戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；

ⅴ.向取上清液B中加入1/10體積3M醋酸鈉pH7.5、2倍體積無(wú)水乙醇，得到DNA沉淀；

ⅵ.用75％乙醇洗滌DNA沉淀，風(fēng)干，加適量ddH₂O溶解DNA，得到材料基因組DNA；

用微量分光光度計(jì)以O(shè)D₂₆₀值(NanoDrop2000)測(cè)量濃度，將DNA工作液濃度調(diào)整為10ng/μL。

2.2、引物篩選：

選取了總計(jì)77個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表一)，其中引物1-60為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司RAPD引物，引物61-77分別摘自已發(fā)表文獻(xiàn)(趙祥云，1995、Yamagishi，1995、ANUSHRI，2001、左志銳，2005)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為20μL，包含有：10μL 2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)(全式金)，2.5μL 5mM引物，2.5μL模板DNA。擴(kuò)增程序：95℃變性3分鐘，擴(kuò)增反應(yīng)為95℃30秒，41℃40秒，72℃50秒，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。

表一：引物信息

上述文獻(xiàn)為：

趙祥云，1995：趙祥云，陳新露，方海，張?jiān)品肌?995。用R A PD標(biāo)記評(píng)價(jià)百合品種間遺傳關(guān)系。北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，10(2)：58-63；

左志銳，2005：左志銳，穆鼎，高俊平，劉春。2005。百合遺傳多樣性及親緣關(guān)系的RAPD分析。園藝學(xué)報(bào)，32(3)：468-472；

ANUSHRI VARSHNEY(2001)Establishment of genetic findelity of in vitro-raised Lilium bulblets thorough RAPD markers.In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37:227-231；

Yamagishi(1995TAG)：Detection of section-specific random amplified polymorphic DNA(RAPD)marker in Lilium.Theor Appl.Genet.91:830-835；

2.3、引物擴(kuò)增穩(wěn)定性測(cè)試：

2.3.1、不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響

選擇經(jīng)過(guò)上述方法2.2中所篩選到的引物進(jìn)行擴(kuò)增穩(wěn)定性測(cè)試。使用熱電Veriti梯度PCR儀，退火溫度由37℃至47℃共設(shè)置6個(gè)梯度，相鄰二個(gè)梯度間的溫度差為2℃進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同上述方法2.2中所述，其它PCR反應(yīng)條件也與上述方法2.2相同。

2.3.2、不同品牌PCR儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響

使用基因9700、伯樂(lè)C1000、熱電Veriti三家廠商的PCR儀，退火溫度為41℃，引物為引43、引49、引52，PCR反應(yīng)體系同上述方法2.2中所述，其它PCR反應(yīng)條件也與上述方法2.2相同。

2.4、RAPD特異擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆與測(cè)序

PCR反應(yīng)體系為20μL，包含有：10μL 2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)(全式金)，2.5μL 5mM引物，2.5μL模板DNA。擴(kuò)增程序：95℃變性3分鐘，擴(kuò)增反應(yīng)為95℃30秒，41℃40秒，72℃50秒，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。1.4％瓊脂糖凝膠電泳。將長(zhǎng)度約為1400bp和900bp的二條特異條帶切割回收。

按照全式金公司“pEASY-T1 Cloning Kit”試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，篩選得到陽(yáng)性克隆。分別選擇陽(yáng)性克隆委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果利用3款軟件設(shè)計(jì)了6對(duì)引物(表二)，交由生工生物工程公司進(jìn)行合成。

表二：特異引物序列信息

2.5特異引物的應(yīng)用檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為20μL，包含10μL 2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)(全式金)，2.5μL 5mM特異引物(表二)，2.5μL模板DNA。擴(kuò)增程序：95℃變性5分鐘，擴(kuò)增反應(yīng)為95℃30秒，58℃40秒，72℃50秒，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。

二、結(jié)果：

2.1、引物篩選

如圖1所示(數(shù)字表示引物序號(hào)，字母表示品種，a：黃天霸；b：木門)，經(jīng)過(guò)1次重復(fù)后，二種百合在16個(gè)引物中的擴(kuò)增圖譜有較大差異，它們是：引27、引43、引46、引49、引52、引55、引61、引63、64、引66、引68、引70-74、引77。

三次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)，引27、引61擴(kuò)增條帶弱、不穩(wěn)定，將其淘汰，引46、引55、引63、引64、引70、引71、引73擴(kuò)增條帶變化較大，有時(shí)難以將二份材料區(qū)分，因此將這7個(gè)引物也淘汰。

二種百合在在引43、引49、引52、引68、引74、引77中的差異比較顯著、穩(wěn)定。由于木門在引68、引74、引77中的擴(kuò)增條帶數(shù)目較多，因此選取引43、引49、引52進(jìn)行擴(kuò)增穩(wěn)定性試驗(yàn)。

2.2、引物擴(kuò)增穩(wěn)定性測(cè)試

使用熱電Veriti梯度PCR儀，隨著退火溫度由37℃至47℃的逐步提升，引43在品種黃天霸和木門中擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目也逐漸增加，其中在6個(gè)溫度中穩(wěn)定擴(kuò)增的是1條大約為1400bp的條帶(如圖2所示，單數(shù)泳道為“黃天霸”擴(kuò)增產(chǎn)物，偶數(shù)泳道為“木門”擴(kuò)增產(chǎn)物，最右側(cè)泳道為DNA marker；引物BD3為引43，BD9為引49，BD12為引52)。

2.3、RAPD特異擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆與測(cè)序

(1)如圖2所示，退火溫度在37-47℃之間時(shí)，引物BD3(即引43)共有4條比較穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，它們的大小分別大約為1400bp、900bp、750bp和500bp。僅選擇上述大小分別約為1400bp、900bp條帶送去測(cè)序的原因?yàn)椋焊鳁l帶兩端大約各100bp的測(cè)序結(jié)果是不可靠的，因此750bp和500bp可靠的數(shù)據(jù)分別只有550bp和300bp。要在這個(gè)區(qū)間內(nèi)選擇至少一對(duì)合適的引物，300bp可能性太低，550bp雖然有可能，但也許最終的擴(kuò)增產(chǎn)物只有100-400bp。若只有100bp，擴(kuò)增產(chǎn)物不易和引物二聚體區(qū)分。而且從DNAmarker的亮度就可以看出來(lái)，相同濃度下，片段越小，亮度越小，這一點(diǎn)在圖4中非常明顯。

(2)將長(zhǎng)度為1400bp和900bp的二條條帶回收、克隆、轉(zhuǎn)化，并隨機(jī)挑取10個(gè)菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆的檢測(cè)。如圖3所示，其中D1-D5插入的是1400bp的大片段，X1-X5插入的是900bp的小片段。

其中，代號(hào)分別為：D1、D4、X1、X3四個(gè)測(cè)序的菌落的測(cè)序結(jié)果分別為1401bp、1401bp、1463bp、954bp。由于X1測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相差較大，所以設(shè)計(jì)引物時(shí)予以忽略。D1、D4雖然符合預(yù)期，并且長(zhǎng)度均為1401bp，但有156個(gè)堿基存在差異，比例為11.13％，這說(shuō)明測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性欠佳。為此分別以D1、X3、D4的測(cè)序結(jié)果為依據(jù)，每條測(cè)序結(jié)果分別設(shè)計(jì)了2對(duì)，總共6對(duì)引物(表二)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)以D1為依據(jù)設(shè)計(jì)的引物序列同時(shí)以存在于X1中。

其中，上述D1菌落測(cè)序結(jié)果如下(SEQ ID NO:7)：共1401bp；其中引物SEQ ID NO:1、2均用方框標(biāo)記，引物及其之間的序列大小為1020bp(即為SEQ ID NO:5)，引物SEQ ID NO:3、4均用下劃線標(biāo)記，引物及其之間的序列大小為1209bp(即為SEQ ID NO:6)；用加粗斜體字標(biāo)記的表示菌落D1和D4之間相同位置上不同的堿基：

上述X1測(cè)序結(jié)果如下(SEQ ID NO:8)：共1463bp；其中引物SEQ ID NO:1、2均用方框標(biāo)記，引物及其之間的序列大小為1020bp(即為SEQ ID NO:5)，引物SEQ ID NO:3、4均用下劃線標(biāo)記，引物及其之間的序列大小為1209bp(即為SEQ ID NO:6)：

TCGAATTCGCGTGTCGCCCTTGAGCCTGCGATATGGCTATGAGGAGTTTACGGCTTGTGCATTCTCCGTCCTTGAGTGGTATGATCAGACTCTGACCACTCACAAGCAGTCTTTGTGCAGTTCTTGTGTGGAAGAGTGGAAGGATGACCTGGATAAGGAGATTACATAGCTTCAGAAGAATCATACATGAGAGTTGGTGACACTTCCAAGAGGCAAGCGGTCGATCGGGTGCAAATGGGTATTCTCGGTGAAGGACGGTGCTTCGGTTTCCAAAGGTACTAGCGCTGGTATACACTATAAGGCAATATTGGTGGCAAAAGGGTATGCACAAAGGGAGGGTAAAGACTACAATGAGGAATTTTCTCCTGCGGTCAAGCACACCTCTATCCGGGTCCTTTTGGCACTAGTTGTGCATTTTGACATGAAGCTCGAGCAAATGAATGTCAAGACCGCATTCTTGCATAGAGACTTGAAGGAGGATATTTACATGTCACAGCCCGAAGGTTATGCTGTTGCTGGGAAGGAAGATCAGGTGTGCACGCCTCAGAAATCACTGTACGGGTTGAAGCAGGCTTCAAGGCAGTGGTACAAGAGGTTTGACAATTTCATGATCGAACATGGGTATGCGAGGAGCTCTTTTGATCCCTGTATGTACAGTAGGCTGCTCGATGATGGATCCCTTGTGTGTCTCTTGCTCTATGTTGATGACATGCTGATTGCTGTGAGGAGCATGGTGGAGATTGATAAGTTGAAGTCGATGTTCAGCAGGGAGTTTGAGATGAAGGATCTAGGTTCCGTGAGGAAGATACTCGGGATGGAGATTGTCAGAGATAGAGGTGAGGGCAGACTGTCTTTGTCACAGCGGGGGTACTTAGAGAAGTTGCTTTGTCGGTTTGAAATGGATGCAGCTAAGCCGGTGTCTACTCCCCTAGCTGCACACTTCAAACTCTCGGTGATAGCATCTCCTAGCACTGACGAGGACAGGGAGTACATGGCTAGTGTTCCCTTTGATATATGCCATGGTTTGTACTCGGCCGGATATCGCACATACGGTTAGTCTCGTGTATCGGTATATGGCGAATCCGGGAAGGCAGTAATGGCAGGCAGTCAAGTGGATATTGAGATATCTTTGGGGGATGCTAAATAGGAGCATTATCTATTAGAGAGGAGCTGGTTCTGATATGGTACAGGGATACATTAACTCTGATTATGCTGGAGATCTTGATAGGTGCCGATCTACTACAAGTTTCTGTTTTACCTTGACACATGGTCCGGTGAGCTGAAAGTCTCAGTTACAGTCTATTGTTGCTCTATCCACGACGGAGGCGGAGTACATGGCTCTGACGGAGGCGATAAAGGAAACCATCTGGCTTCGGGGCTCAAGGGCGACACGCGAATTCGATATCAAGCTCAGACGAGGCAA。

(3)將上述6對(duì)引物分別以黃天霸全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖4所示，引物M1、M2的擴(kuò)增結(jié)果符合預(yù)期；引物S1、B1、B2沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，引物S2擴(kuò)增產(chǎn)物及其微弱。由于引物M1和M2能夠清楚地區(qū)分這兩個(gè)百合品種，所以選定引物M1和M2作為特異性引物對(duì)用于區(qū)分百合品種黃天霸。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例是將上述兩組特異性引物對(duì)(M1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，M2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)應(yīng)用于區(qū)分百合品種黃天霸和其他5個(gè)常見(jiàn)的OT類型百合品種，檢測(cè)其基因組中是否含有特異性條帶。

檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)植物基因組：與實(shí)施例1中2.1的方法相同；得到6種待測(cè)植物(黃天霸、木門、黑幕、爆發(fā)點(diǎn)、驚艷、羅賓娜)的基因組。

(2)PCR反應(yīng)：分別以M1和M2為引物，以上述6種待測(cè)植物的基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

該P(yáng)CR反應(yīng)體系為20μL，包含有：2X EasyTaq PCR SuperMix(+dye)(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)10μL，5mM的正、反向引物各2.5μL，10ng/μl模板DNA 2.5μL，ddH₂O足量。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

變性：94-95℃3-5分鐘；擴(kuò)增：94-95℃30-50秒，54-60℃30-50秒，72℃30-50秒，共計(jì)30-35個(gè)循環(huán)；延伸：72℃4-10分鐘。

在實(shí)施例1的“2.2、引物擴(kuò)增穩(wěn)定性測(cè)試”選定41℃是因?yàn)樽畛跏褂玫氖请S機(jī)寡核苷酸序列，退火溫度范圍是37-47℃；41℃時(shí)得到的整體帶型綜合考量最佳，而特征條帶在37-47℃之間都穩(wěn)定存在；設(shè)計(jì)、合成、采用2對(duì)特異引物后，退火溫度隨之升高，區(qū)間是54-60℃，一般采用58℃；考慮到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的差異，所以選擇的引物都是穩(wěn)定性很好的；設(shè)計(jì)的2對(duì)引物由于特異性高，所以對(duì)PCR反應(yīng)要求比較寬松，在很寬泛的條件下都可以得到穩(wěn)定的結(jié)果。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃裕?5℃3分鐘；擴(kuò)增：95℃30秒，58℃30秒，72℃40秒，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃7分鐘。

(3)電泳檢測(cè)：將該擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠，于90V恒功率電泳分離0.5h，之后紫外燈下照相觀察；

如圖5所示：A1-A6引物為M1，B1-B6引物為M2。A1、B1模板DNA為黃天霸；A2、B2模板DNA為木門；A3、B3模板DNA為爆發(fā)點(diǎn)；A4、B4模板DNA為驚艷；A5、B5模板DNA為羅賓娜；A6、B6模板DNA為黑幕)，以M1為引物時(shí)，黃天霸具有1條目標(biāo)條帶，目測(cè)大小比1Kbp略大，實(shí)際為1020bp(SEQ ID NO:5)；木門、爆發(fā)點(diǎn)、驚艷沒(méi)有任何擴(kuò)增產(chǎn)物；羅賓娜在800bp附近隱約有1條弱帶，黑幕有2條帶，一條小于1Kbp，另外一條明顯超過(guò)1200bp。以M2為引物時(shí)，黃天霸具有1條目標(biāo)條帶，目測(cè)大小約為1200bp，實(shí)際為1209bp(SEQ ID NO:6)；木門、爆發(fā)點(diǎn)、驚艷和羅賓娜沒(méi)有任何擴(kuò)增產(chǎn)物；黑幕有2條帶，一條約1100bp，一條約1700bp。

由此可見(jiàn)，由于黃天霸的擴(kuò)增產(chǎn)物中具有特異性的擴(kuò)增條帶，利用引物M1或者M(jìn)2可以明顯地、精確地將黃天霸與其它5種常見(jiàn)OT類型的百合區(qū)分開(kāi)。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例是將上述兩組特異性引物對(duì)(M1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，M2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)應(yīng)用于區(qū)分百合品種黃天霸和木門，檢測(cè)其基因組中是否含有特異性條帶。

檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)植物基因組：與實(shí)施例1中2.1的方法相同；得到2種待測(cè)植物(黃天霸、木門)的基因組。

(2)PCR反應(yīng)：分別以M1和M2為引物，以上述2種待測(cè)植物的基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

該P(yáng)CR反應(yīng)體系的總體積為11μL，其中包含“擎科新業(yè)TSE101-金牌Mix(1.1X)”PCR預(yù)混液10μL(購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，引物混合液(含正、反向引物各20μM)0.5μL，300ng/μL DNA0.5μL；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋鹤冃裕?8℃2分鐘；擴(kuò)增：98℃10秒，58℃15秒，72℃25秒，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；延伸：72℃4分鐘。

本實(shí)施例中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)顯著地縮短了PCR反應(yīng)的時(shí)間。

(3)電泳檢測(cè)：將該擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠，于90V恒功率電泳分離0.5h，之后紫外燈下照相觀察；見(jiàn)圖6：其中M1的模板DNA為木門，不含有特異性條帶；H4、H5的模板DNA為黃天霸，以M1為引物時(shí)，具有1條目測(cè)比1Kbp略大的特異性條帶，實(shí)際為1020bp(SEQ ID NO:5)，以M2為引物時(shí)，具有1條目測(cè)約為1200bp的特異性條帶，實(shí)際為1209bp(SEQ ID NO:6)。

由此可見(jiàn)，由于黃天霸的擴(kuò)增產(chǎn)物中具有特異性的擴(kuò)增條帶，利用引物M1或者M(jìn)2可以明顯地、精確地將黃天霸與外觀相似的木門百合區(qū)分開(kāi)。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施方式僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所做的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。