本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，更具體地，涉及一種基于MGB探針鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的試劑盒及其檢測方法。

背景技術：

《中華人民共和國藥典》(2010)規(guī)定阿膠為馬科動物驢(Equus asinus L.)的干皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮而制成的。阿膠具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，是重要的國家級非物質文化遺產(chǎn)，千百年來一直深受歷代醫(yī)家和廣大百姓的青睞。然而近年來，我國驢存欄量逐年下滑，導致各大阿膠企業(yè)均飽受驢皮資源緊缺之困，各地均出現(xiàn)了用其他動物皮熬制的偽品。采用雜皮、骨膠等熬制的膠類假藥不僅臨床效果差，而且還可能出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。因此阿膠生產(chǎn)企業(yè)在收購阿膠原料驢皮時，需要對皮張進行物種鑒定，防止其他動物皮冒充驢皮。國內市場上常見的驢皮偽品有馬皮、騾子皮、牛皮、小水牛皮、小黃牛皮、綿羊皮、山羊板皮等，但以馬皮、騾子皮、牛皮混入者較多。驢皮中混入的牛皮、小水牛皮、小黃牛皮等皮張在外觀上與驢皮相差較大，用傳統(tǒng)方法即可鑒別出，相對較為容易；而馬、騾子與驢的親緣關系較近，這三種動物的干皮張外表非常相似，僅憑肉眼難以鑒別，尤其是在除去毛發(fā)并剪成小塊后，僅憑肉眼是無法鑒別的，因此，阿膠原料的真?zhèn)舞b別成為阿膠生產(chǎn)中迫切需要解決的技術難題。當前，鑒定驢皮、馬皮和騾子皮較為前沿的技術為DNA鑒定技術。DNA鑒定主要是利用顯示生物特征的各種生物物種所具有的不同DNA序列信息進行鑒別，它可以突破依據(jù)動物纖維結構形態(tài)的局限性，與傳統(tǒng)分析方法相比，更加具有客觀性和準確性。

經(jīng)過對現(xiàn)有技術的檢索發(fā)現(xiàn)，公開號為102608117A的專利公布了一種宏觀觀察法和顯微鏡觀察法鑒定驢皮的方法，但該方法具有一定的主觀性，且無法鑒定去除毛發(fā)的動物皮張。公開號為105223291A的專利公開了一種利用液質聯(lián)用技術鑒定驢皮的方法，但該方法無法區(qū)分馬皮和馬騾皮。申請?zhí)枮?01510623447.9的專利公開了一種檢測及鑒別驢、馬或牛皮氣味成分的方法及其鑒別標準，但該方法無法鑒別騾子皮，而騾子皮是摻假較多的動物皮張之一。上述3項專利所公布的方法屬于傳統(tǒng)鑒定方法，所用技術較為滯后，均存在一定的局限性，達不到阿膠生產(chǎn)企業(yè)對驢皮、馬皮、騾子皮進行鑒定的技術要求。公開號為CN1605868A的專利公布了一種通過細胞色素B基因聚合酶鏈式反應-限制性酶切片段長度多態(tài)性方法制備的DNA指紋圖譜來鑒定驢皮的方法，但該方法不能對騾與驢或騾與馬進行區(qū)分。公開號為CN104046700A的專利將線粒體16SrRNA基因和CKM核基因兩者相結合，使用分子信標探針(MB)技術進行5重多色熒光定量PCR同時檢測驢、馬、馬騾及驢騾四種成分。對于本領域技術人員而言，5重多色熒光定量PCR難度較大，不同引物探針之間產(chǎn)生的錯配容易導致假陽性結果，且5條分子信標導致檢測成本較高；另一方面，阿膠生產(chǎn)企業(yè)實際檢測需求是對驢、馬、騾三種動物皮張進行區(qū)分，無需區(qū)分馬騾和驢騾，該專利在實際應用中過于繁瑣。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明從阿膠企業(yè)生產(chǎn)實際需求出發(fā)，根據(jù)驢和馬CKM核基因的堿基差異，利用MGB探針技術對差異堿基進行區(qū)分，無需分析多個基因，從而達到快速準確鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的目的。

為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種基于MGB探針鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的試劑盒，所述試劑盒中包括用于實時熒光定量PCR檢測的PCR反應液。

具體的，所述PCR反應液包括驢和馬ckm基因通用性引物ckm-F/ckm-R，驢MGB探針MGB-Lv，馬MGB探針MGB-Ma，質控引物和質控探針；

其中，所述驢和馬ckm基因通用性引物序列為：

ckm-F：5‘-CAAGCTCTCCTAAACACCTATC-3‘；

ckm-R：5‘-CTGACCTAAAGCCTACGTA-3‘；

所述驢MGB探針序列為：

MGB-Lv：5‘-AGCCATTCATTACGCCT-3‘；

所述馬MGB探針序列為：

MGB-Ma：5‘-CGTTACCGTTACATAC-3‘；

所述質控引物序列為：

16SRNA-F：5‘-ACCTGAAACTAGAACTGACTT-3‘；

16SRNA-R：5‘-GCTTCAATGGGTCCAATGTGAC-3‘；

所述質控探針序列為：

16SRNA-P：5‘-CTTGAATCCTGACGTCTGGCT-3‘；

進一步的，所述PCR反應液還包括Taq DNA聚合酶，無水D-(+)-海藻糖；Tris-HCl；KCl；MgCl₂；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白(BSAV)；ROX參比染料；

進一步的，所述驢MGB探針5‘端修飾FAM熒光基團，3‘端修飾MGB基團；

進一步的，所述馬MGB探針5‘端修飾HEX熒光基團，3‘端修飾MGB基團；

進一步的，所述質控探針5‘端修飾JOE熒光基團，3‘端修飾Dabcyl基團；

進一步的，所述驢和馬ckm基因通用性引物序列濃度均為250nM；所述驢和馬的MGB探針濃度均為500nM；所述質控引物濃度均為250nM；所述質控探針濃度為500nM；所述Taq DNA聚合酶活性濃度為：0.05U/μL；所述無水D-(+)-海藻糖濃度為8％；所述Tris-HCl濃度為20mM，pH為8.3；所述KCl濃度為100mM；所述MgCl₂濃度為7mM；所述dNTPs濃度為0.4mM；所述甘油體積分數(shù)為20％(v/v)；所述牛血清白蛋白濃度為1μgμL^-1；所述ROX參比染料濃度為1μM；

一種基于MGB探針鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

(1)采用市售動物基因組DNA提取試劑盒提取待檢樣品DNA；

(2)配置擴增反應體系；

(3)將步驟(2)配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件為：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集熒光信號，共計40個循環(huán)；

(4)結果判定：Ct值≤36為陽性反應，Ct值＞36為陰性反應，按下表對結果進行判定：

進一步的，所述步驟(2)中擴增反應體系包括：PCR反應液10μL，所述步驟(1)制備樣品DNA2μL，使用無菌水補足至20μL；同時設置用無菌水代替DNA的空白對照，以監(jiān)測反應是否被污染。

本發(fā)明的原理是：驢與馬同屬馬科動物，親緣關系較近，其CKM核基因序列一致性高達99.6％以上，普通Taqman探針難以進行區(qū)分。本申請創(chuàng)造性的選用MGB探針進行檢測，MGB探針在3‘端有MGB基團，可以提高探針的Tm值，與普通TaqMan探針相比，MGB探針可以設計的更短，具有更低的熒光背景、更高的信噪比，MGB探針與模板的單堿基不匹配即可抑制兩者的結合，因而是檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的理想手段；同時，使用MGB探針既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高?；诖?，本發(fā)明利用MGB探針技術對驢和馬CKM基因上不同堿基進行區(qū)分，結合騾子與驢和馬的遺傳關系，從而對驢、馬、騾進行準確鑒定。

具體的，如前所述，本探針試劑盒包含的關鍵引物與探針為1對驢和馬CKM核基因通用引物(擴增序列大小為121bp)，2條驢和馬MGB探針，另外還包括哺乳動物16sRNA基因保守區(qū)的擴增引物與Taqman探針，以作為內源性質控探針來監(jiān)測樣品DNA提取的質量。根據(jù)驢馬騾的遺傳關系，騾子體內同時含有驢和馬的CKM核基因，因此，當檢測樣本中只有驢CKM核基因為陽性時為驢皮，只有馬CKM核基因為陽性時為馬皮，驢和馬CKM核基因同時為陽性時則為騾子皮，加入的質控引物與探針可以對樣品DNA質量進行監(jiān)控，以排除假陰性的干擾。同時，由于動物組織成分更為復雜，提取的DNA溶液中容易摻雜難以去除的PCR抑制成分因而容易導致結果呈現(xiàn)假陰性。申請人通過大量實驗分析最終確定在本申請中聯(lián)合使用BSAV(牛血清白蛋白)和無水D-(+)-海藻糖可對樣本DNA中存在的抑制劑發(fā)揮較強的耐抑制性，有效避免因提取DNA樣品中摻雜難以去除的PCR抑制成分而導致結果呈現(xiàn)假陰性。因此檢測人員使用市售動物基因組DNA提取試劑盒來提取樣品DNA即可，無需使用特殊方法，方便無專業(yè)背景知識的人員使用。

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術的缺陷和條件的限制，對檢測方法和儀器檢測條件進行了優(yōu)化，與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明具有如下有益效果：

1、創(chuàng)新性使用MGB探針技術，所述MGB探針與模板DNA能夠完全結合，因而穩(wěn)定性更好，結果更準確；克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本等缺點，此外，本試劑盒通過優(yōu)化反應液成分，降低了對檢測人員的技術素質要求，簡化了實際操作步驟，而且不需要特殊的試劑和昂貴儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系；

2、本發(fā)明中使用3重復合實時熒光PCR，對驢馬騾鑒定的檢測極限為0.05ng，檢測極限極低，更適合阿膠生產(chǎn)企業(yè)的實際應用；

3、本發(fā)明公布的方法適用于3通道及以上的熒光定量儀，對儀器要求低，因而適用的范圍更廣，通用性更好。

總之，本發(fā)明所述試劑盒及檢測方法具有測定準確、操作簡單方便、快速準確、重復性好、靈敏度高、對檢測人員技術素質要求低、不需要特殊的試劑和昂貴儀器設備，更有利于于阿膠生產(chǎn)企業(yè)的實際應用。

附圖說明

圖1A：MGB-Lv探針檢測極限測試；

圖1B：MGB-Ma探針檢測極限測試；

圖2A：盲樣測試，MGB-Lv為陽性，MGB-Ma為陰性，鑒定為驢皮；

圖2B：盲樣測試，MGB-Ma為陽性，MGB-Lv為陰性，鑒定為馬皮；

圖2C：盲樣測試，MGB-Ma和MGB-Lv同時為陽性，鑒定為騾子皮；

圖3A：試劑盒耐抑制性測試(MGB-Lv檢測，未優(yōu)化試劑盒)；

圖3B：試劑盒耐抑制性測試(MGB-Lv檢測，本發(fā)明試劑盒)；

圖4A：試劑盒耐抑制性測試(MGB-Ma檢測，未優(yōu)化試劑盒)；

圖4B：試劑盒耐抑制性測試(MGB-Ma檢測，本發(fā)明試劑盒)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1試劑盒特異性測試

一種基于MGB探針法鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的試劑盒，所述試劑盒中包括用于實時熒光定量PCR檢測的PCR反應液。

具體的，所述PCR反應液包括：驢和馬ckm基因通用性引物ckm-F/ckm-R，驢MGB探針MGB-Lv，馬MGB探針MGB-Ma，質控引物，質控探針，Taq DNA聚合酶，無水D-(+)-海藻糖；KCl；MgCl₂；dNTPs；甘油；牛血清白蛋白；ROX參比染料；

其中，驢和馬ckm基因通用性引物序列為：

ckm-F：5‘-CAAGCTCTCCTAAACACCTATC-3‘

ckm-R：5‘-CTGACCTAAAGCCTACGTA-3‘

濃度各為250nM；

MGB-Lv序列為：

MGB-Lv：5‘-AGCCATTCATTACGCCT-3‘

5‘端修飾FAM熒光基團，3‘修飾MGB基團，濃度為500nM

MGB-Ma序列為：

MGB-Ma：5‘-CGTTACCGTTACATAC-3‘

5‘端修飾HEX熒光基團，3‘修飾MGB基團，濃度為：500nM

質控引物序列為：

16SRNA-F：5‘-ACCTGAAACTAGAACTGACTT-3‘

16SRNA-R：5‘-GCTTCAATGGGTCCAATGTGAC-3‘

濃度各為250nM，

質控探針序列為：

16SRNA-P：5‘-CTTGAATCCTGACGTCTGGCT-3‘

5‘端修飾JOE熒光基團，3‘修飾Dabcyl基團，濃度為：500nM

Taq DNA聚合酶活性濃度為：0.05U/μL，

無水D-(+)-海藻糖濃度為8％；

Tris-HCl濃度為20mM，pH為8.3；

KCl濃度為100mM；

MgCl₂濃度為7mM；

dNTPs濃度為0.4mM；

甘油體積分數(shù)為20％(v/v)；

牛血清白蛋白濃度為1μgμL^-1；

ROX參比染料濃度為1μM。

使用市售動物基因組DNA提取試劑盒(D1700-50，Solarbio)分別提取驢、馬、騾子、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、魚肉基因組DNA并將其濃度稀釋為25ngμL^-1，配置20μL實時熒光PCR反應體系，所述實時熒光PCR反應體系包括：PCR反應液10μL，各基因組DNA2μL，使用無菌水補足至20μL；

同時設置用無菌水代替DNA的空白對照，進行PCR擴增反應，PCR擴增程序為：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集熒光信號，共計40個循環(huán)。結果如表1，表明該試劑盒特異性較強，適用于驢皮、馬皮和騾子皮的鑒定。

表1試劑盒特異性測試結果

注：“+”表示Ct值小于36，為陽性擴增；“-”表示Ct值大于36或無明顯擴增，為陰性擴增。實施例2試劑盒檢測極限測試

用市售動物基因組DNA提取試劑盒(D1700-50，Solarbio)分別提取驢皮、馬皮、騾子皮基因組DNA，稀釋至25ngμL^-1作為原始DNA溶液，并依次梯度稀釋至2.5ngμL^-1、0.25ngμL^-1、0.025ngμL^-1、0.0025ngμL^-1，則按照實施例1所述方法配置的PCR反應液中基因組DNA的量依次為50ng、5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng。PCR結果如圖1A、B顯示，隨著基因組DNA量的降低，擴增曲線的Ct值依次減小，當目的DNA低至0.05ng時，MGB-LV對應的Ct值為35.31，MGB-MA對應的Ct值為35.42，接近陽性結果的極限；當基因組DNA繼續(xù)降低至0.005ng時，Ct值在38以上或無明顯擴增，表明該試劑盒對驢、馬、騾的檢測極限為0.05ng。

實施例3試劑盒實驗室內重演性測試

為驗證該試劑盒由不同人員使用時的重演性，邀請實驗室內3位檢測人員分別使用試劑盒對驢皮、馬皮和騾子皮進行檢測。使用動物基因組DNA提取試劑盒(D1700-50，Solarbio)提取驢皮馬皮騾子皮基因組DNA。然后3位檢測人員分別按照實施例1所述方法配置PCR反應擴增體系，同時設置用無菌水代替DNA的空白對照，進行PCR擴增反應，PCR擴增程序為：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集熒光信號，共計40個循環(huán)。結果如表2，3位檢測人員所得Ct值的標準方差SD的范圍為0.72-0.86，RSD范圍為2.76％-2.84％，說明該試劑盒具有良好重演性。

表2試劑盒實驗室內重演性測試結果

注：Ct Mean為樣本Ct值平均值，Ct SD為Ct值的標準偏差，Ct RSD為Ct值的相對標準偏差。

實施例4試劑盒不同實驗室間再現(xiàn)性測試

為驗證該試劑盒在不同實驗室間使用時的再現(xiàn)性，邀請3家實驗室分別使用試劑盒對驢皮、馬皮和騾子皮進行檢測。使用動物基因組DNA提取試劑盒(D1700-50，Solarbio)對驢皮馬皮騾子皮DNA進行提取。然后3家實驗室分別按照實施例1配置PCR反應擴增體系，同時設置用無菌水代替DNA的空白對照，進行PCR擴增反應，PCR擴增程序為：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集熒光信號，共計40個循環(huán)。結果如表3，3家實驗室所得Ct值的標準方差SD范圍為0.60-0.84，RSD范圍為2.16％-2.78％，說明該反應液在不同實驗室間具有良好的再現(xiàn)性。

表3試劑盒不同實驗室間再現(xiàn)性測試結果

注：Ct Mean為樣本Ct值平均值，Ct SD為Ct值的標準偏差，Ct RSD為Ct值的相對標準偏差。

實施例5盲樣檢測

盲樣的制備：由一位檢測人員將4份驢皮、4份馬皮、4份騾子皮各剪出一小塊，混合后隨機編號為盲樣1-12，該檢測人員知曉并記錄盲樣1-12成分，然后將12份盲樣交由另一位檢測人員使用本試劑盒進行鑒定。

盲樣鑒定：用動物基因組DNA提取試劑盒提取12份樣品的DNA，按照實施例1所述方法配置PCR反應擴增體系，同時設置用無菌水代替DNA的空白對照，進行PCR擴增反應。PCR擴增程序為：95℃30s；95℃5s，60℃30s，在60℃收集熒光信號，共計40個循環(huán)。PCR結果如圖2和表4，鑒定結果與已知成分一致。

表4盲樣的檢測結果

實施例6試劑盒耐抑制性測試

將本試劑盒PCR反應液中去除8％無水D-(+)-海藻糖和1μgμL^-1牛血清白蛋白這兩種成分后的試劑盒定義為未優(yōu)化試劑盒。

為驗證本試劑盒對PCR抑制成分具有良好的耐受性，將PCR抑制劑hemin(氯高鐵血紅素)加入PCR反應中，同時進行未優(yōu)化試劑盒檢測和本試劑盒檢測。

提取驢皮和馬皮基因組DNA，分別使用未優(yōu)化試劑盒和本試劑盒按實施例1分別配置PCR反應擴增體系，并向體系中加入hemin使其終濃度依次為0.01ngμL^-1、0.1ngμL^-1、1.0ngμL^-1、10ngμL^-1、50ngμL^-1和100ngμL^-1，以測試本試劑盒對PCR抑制劑的耐受性。PCR結果如圖3、4所示，在GMB-Lv和GMB-Ma檢測中，使用未優(yōu)化試劑盒時，當hemin添加量為0.1ngμL^-1時，Ct值分別為35.1和35.3，接近檢測極限，當hemin添加量繼續(xù)升高至1.0ngμL^-1及以上時，PCR無明顯擴增，反應被完全抑制，此時對hemin的耐抑制性為0.1ngμL^-1；使用已優(yōu)化的本試劑盒時，當hemin添加量為50ngμL^-1時，Ct值分別為35.4和35.6，接近檢測極限，當hemin添加量繼續(xù)升高至100ngμL^-1及以上時，PCR無明顯擴增，反應被完全抑制，此時耐抑制性為50ngμL^-1，優(yōu)化后的本試劑盒與未優(yōu)化試劑盒相比耐抑制性提高了500倍，效果顯著。

上述雖然結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。