本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預測預后領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測ZNF385C異常為手段的腫瘤診斷、預測預后方法；及抑制ZNF385C基因或蛋白質的腫瘤治療劑。
背景技術：
：下咽也稱喉咽，位于喉的后方，會厭上緣至環(huán)狀軟骨下緣平面之間，相當于第三至第六梗椎。上與口咽相連，下與食管相接。分為梨狀窩、環(huán)后區(qū)和咽后壁區(qū)。下咽癌即是指發(fā)生在這三個區(qū)域的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤的0.8％一1.5％。由于其發(fā)生部位隱蔽，不宜被早期發(fā)現，淋巴結轉移發(fā)生率高，5年生存率低于50％，因此下咽癌是一種預后極差的頭頸部惡性腫瘤之一，由于近年來發(fā)病率呈現上升趨勢，下咽癌的早期診斷和預后成為臨床治療的難點。技術實現要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測ZNF385C基因或蛋白表達差異來診斷下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測ZNF385C基因或蛋白表達差異來預測下咽癌預后的方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過抑制ZNF385C基因或ZNF385C蛋白來治療下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療下咽癌的藥物的方法。本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療下咽癌的藥物。為了實現上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：本發(fā)明提供了檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的產品在制備下咽癌診斷工具中的用途。本發(fā)明還提供了檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的產品在制備預測下咽癌預后工具中的用途。進一步，所述檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的產品包括檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合ZNF385C基因的核酸或者能夠結合ZNF385C蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ZNF385C基因的表達水平；所述物質能夠檢測ZNF385C蛋白的表達水平。本發(fā)明的檢測ZNF385C基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。進一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem，擴增不應突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可擴增片段長度多態(tài)性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。上面所述的核酸包括擴增ZNF385C基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當地設計，并通過化學合成來制備。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為QPCR實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1(正向序列)和SEQIDNO.2(反向序列)所示。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。本發(fā)明的檢測ZNF385C蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫測定法、免疫組織化學法、Western印跡等。本發(fā)明的檢測ZNF385C蛋白的產品包括特異性結合ZNF385C蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)(雙抗體)、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測ZNF385C蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞?？贵w可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的ZNF385C蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對ZNF385C蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用DMSO、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-NH2、生物素標記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-NH2、堿性磷酸酶標記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-NH2、過氧化物酶標記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標記試劑盒SH(DojindoLaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)555標記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)647標記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight547和DyLight647(TechnoChemicalCorp.)、Zenon(TM)、AlexaFluor(TM)抗體標記試劑盒、Qdot(TM)抗體標記試劑盒(InvitrogenCorporation)和EZ-標記物蛋白質標記試劑盒(FunakoshiCorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。在本發(fā)明中，“預后”是指腫瘤患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結果。在本說明書中，預后可以是通過手術處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查生物標志物即ZNF385C蛋白或編碼ZNF385C蛋白的基因來預測。預后預測可以這樣進行：根據生物標志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。在本發(fā)明中，“預后良好”是指在通過手術處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘撸A后好可以意指在這樣長時間內存活、無轉移、無復發(fā)、或無再發(fā)。例如，預后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉移或復發(fā)。預后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如本文中所使用的，“預后良好”還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現疾病如轉移，但是惡性低且不嚴重地影響生存能力。在本發(fā)明中，“預后不良”是指患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短時期(例如1、2、3、4、5年或更短)內發(fā)生致命狀況?；蛘?，預后差是指在這樣的短時期里死亡、轉移、復發(fā)、或再發(fā)。例如，預后差可以意指至少3年或尤其至少5年內復發(fā)、轉移、或死亡。預測預后是指預測患者狀況的過程或結果，并不意味著能以100％的準確度預測患者狀況的過程或結果。預測預后是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的水平升高的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。進一步，所述檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的產品可以是檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌的工具，所述工具能夠檢測ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合ZNF385C基因的核酸或者能夠結合ZNF385C蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ZNF385C基因的表達水平；所述物質能夠檢測ZNF385C蛋白的表達水平。進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。進一步，所述診斷下咽癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知ZNF385C基因的異常與下咽癌相關也屬于ZNF385C基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明還提供了一種預測下咽癌預后的工具，所述預測下咽癌預后工具包括能夠結合ZNF385C基因的核酸或者能夠結合ZNF385C蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ZNF385C基因的mRNA水平；所述物質能夠檢測ZNF385C蛋白的表達水平。進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。進一步，所述預測下咽癌預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知ZNF385C基因的異常與下咽癌相關也屬于ZNF385C基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗ZNF385C抗體或其片段所識別的氨基酸的數目沒有特別限制，只要抗體能夠結合ZNF385C即可。當抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能夠識別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制ZNF385C功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數目是至少一個，更優(yōu)選至少三個?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌或預測下咽癌預后的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中ZNF385C基因或蛋白的表達水平；(3)將測得的ZNF385C基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。(4)與對照相比，ZNF385C基因或蛋白的表達水平升高，則該受試者被診斷為下咽癌，或該受試者被確定為預后不良。本發(fā)明還提供了一種下咽癌的治療方法，所述方法包括抑制ZNF385C基因或ZNF385C蛋白。進一步，所述方法包括抑制ZNF385C基因的表達，或抑制ZNF385C蛋白的表達或抑制ZNF385C蛋白的活性。本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對腫瘤細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量ZNF385C基因或者ZNF385C蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預后的效果。更具體地說，當ZNF385C基因或者ZNF385C蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后降低時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預后的治療藥物。本發(fā)明還提供了一種含有ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的抑制劑的藥物。本發(fā)明還提供了上述抑制劑在制備治療下咽癌的藥物中的應用。本發(fā)明的ZNF385C基因或ZNF385C蛋白的抑制劑不受限制，只要是可以抑制ZNF385C或涉及ZNF385C上游或下游途徑的物質的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。進一步，所述抑制劑包括反義核酸、dsRNA、核酶、適體、ZNF385C結合蛋白片段、或抗體或其片段?！胺戳x核酸”指含有與編碼ZNF385C的mRNA互補的序列的核酸。反義核酸可以由DNA、RNA或二者組成。反義核酸不需要與靶ZNF385C的mRNA100％互補。反義核酸可含有非互補堿基，只要它能夠在嚴格條件下特異性雜交即可。當將反義核酸引入細胞時，它結合靶多核苷酸并抑制轉錄、RNA加工、翻譯或穩(wěn)定性。除反義多核苷酸之外，反義核酸還包括多核苷酸模擬物，它含有經過修飾的主鏈、和3′和5′端部分。這樣的反義核酸可以根據ZNF385C序列信息來恰當設計并使用本領域技術人員公知的方法來生成?！癲sRNA”指含有雙鏈RNA結構，通過RNA干擾(RNAi)來抑制基因表達的RNA，包括siRNA(短干擾RNA)和shRNA(短發(fā)夾RNA)。dsRNA不需要與靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表達即可。為了穩(wěn)定化或其它目的，可以將dsRNA的一部分用DNA替代。優(yōu)選的是，siRNA是21-23個堿基的雙鏈RNA。siRNA可以通過本領域技術人員公知的方法來制備，例如通過化學合成或作為天然存在RNA的類似物。shRNA是具有發(fā)夾轉角(hairpinturn)結構的短鏈RNA。shRNA可以通過本領域技術人員公知的方法來制備，例如通過化學合成或通過將編碼shRNA的DNA引入細胞并表達DNA?！昂嗣浮敝妇哂写呋钚缘腞NA，它能夠切割、粘貼、插入、和轉移RNA。核酶的結構可以包括錘頭、發(fā)夾等?！斑m體”指結合某物質諸如蛋白質的核酸。適體可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是雙鏈或單鏈。適體的長度無限制，只要它能夠特異性結合靶分子即可，可以由例如10至200個核苷酸、優(yōu)選10至100個核苷酸、更優(yōu)選15至80個核苷酸、進一步更優(yōu)選15至50個核苷酸組成。適體可以使用本領域技術人員公知的方法來選擇。例如，可以采用SELEX(通過指數式富集進行的配體的系統(tǒng)進化)?！癦NF385C結合蛋白的片段”指結合ZNF385C且抑制ZNF385C實施原始功能的蛋白質的片段。本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用。可以與本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素C、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。本發(fā)明的藥物可根據需要制備成各種劑型。包括但不限于，經皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即可，包括但不限于靜脈內，腹膜內，眼內，動脈內，肺內，口服，小泡內，肌肉內，氣管內，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節(jié)內，心室內，直腸，陰道，顱骨內，尿道內，肝內，瘤內。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可以依據癥狀、性別、年齡等來恰當的確定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。在本發(fā)明的上下文中，“診斷下咽癌”既包括判斷受試者是否已經患有下咽癌、也包括判斷受試者是否存在患有下咽癌的風險。本文所用的“治療”涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：(1)預防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。術語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應用)，其中可達到某些預期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預防措施(例如預防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術語“治療”中。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明的發(fā)現了一種診斷下咽癌的分子標志物，使用該分子標志物可以在下咽癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。另外，通過預測患者的預后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。本發(fā)明的包括ZNF385C基因或蛋白的抑制劑的治療藥物可用作新的下咽癌的治療藥物。附圖說明圖1顯示利用QPCR在mRNA水平上檢測ZNF385C基因的差異表達；圖2顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測ZNF385C基因的差異表達；圖3顯示利用QPCR檢測siRNA對ZNF385C基因表達的干擾效率；圖4顯示利用免疫印跡檢測siRNA對ZNF385C基因表達的干擾效率；圖5顯示利用MTT檢測抑制ZNF385C基因表達對下咽癌細胞增殖的影響；圖6顯示抑制ZNF385C蛋白功能對下咽癌細胞增殖的影響。具體的實施方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1基因芯片篩選差異表達基因1、取材：8例行同期頸部淋巴結清掃的原發(fā)下咽癌患者手術切除癌組織，另取9例非下咽癌疾病患者的下咽正常粘膜組織作為對照。所有癌組織均術后病理證實為下咽癌。全部原發(fā)下咽癌患者術前均未行放、化療，全部病例臨床資料完整。2、組織RNA的獲取使用Trizol一步法提取組織總RNA。3、RNA純度及濃度的測定取RNA溶液1μl，儀器測定OD260、OD280，RNA濃度為OD260值×稀釋倍數×40/1000，計算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液純度高，含蛋白質等雜質少，-20℃保存。4、RNA完整性檢測(1)取2μlRNA樣品行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)；(2)分出區(qū)帶后，genefinder染色，藍光下觀察電泳區(qū)帶；(3)當28s/18s約2:1時，說明RNA穩(wěn)定無降解。5、高通量轉錄組測序5.1RNA-seq讀段定位首先將低質量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHatv1.3.1將清潔片段與UCSCH.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配，H.sapiensUCSChg19版的預先構建的索引從TopHat主頁下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。TopHat根據外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的剪切位點庫，根據這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用的TopHat方法的系統(tǒng)默認參數。5.2轉錄豐度評估匹配上的讀段文件通過Cufflinksv1.0.3處理，Cufflinksv1.0.3將RNA-seq片段數目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區(qū)域的片段數目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數據庫下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。5.3差異表達基因的檢測將下載的EnsemblGTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉錄本的表達豐度，檢測差異表達。在Cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。6、結果RNA-Sep結果顯示，下咽癌組織與正常對照組織之間共篩選出211個差異表達基因，其中表達水平上調的基因54個，表達水平下調的基因157個。實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因基于前期高通量轉錄組深度測序的結果，根據Pvalue的大小，我們選擇ZNF385C基因進行驗證。1、樣本收集按照實施例1的方法收集下咽癌組織45例，正常對照組織50例。2、在mRNA水平上進行驗證2.1提取組織RNA步驟同實施例1。2.2逆轉錄反轉錄使用Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進行：(1)在微量離心管中加入以下反應液體，如表1所示：表1反應液體試劑劑量RNA2.0μgdNTP1.0μlOligo(dT)2.0μlRnasefreedH2O加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；在微量離心管內加入以下反應試劑，制成反應體系：試劑劑量5x1stStrandSynthesisBuffer4.0μlPrimeScriptRTase1.0μlRNaseInhibitor1.0μlRnasefreedH2O4.0μl輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應1h，70℃10min終止反應，4℃冷卻，-20℃保存。采用SYBPPremixExTapTMII試劑盒，在EppendorfReal-timePCR分析儀進行，具體操作如下：(1)在冰上配制以下PCR反應液：試劑劑量SYBR10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcDNA2.0μlddH2O6.0μl總量20.0μl引物序列設計如下：ZNF385C基因：5’-CAACTCCAGACCCTACAT-3’(SEQIDNO.1)；5’-AGGAAGAAGAGGATGAGG-3’(SEQIDNO.2)β-actin：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQIDNO.3)；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQIDNO.4)(2)上機，執(zhí)行下述程序：95℃預變性3min；95℃變性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。結果釆用相對定量法，運用公式2-△△ct計算。實驗重復3次?！鱟t＝ct(A)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(實驗組)-△ct(對照組)結果如圖1顯示，與正常對照組織相比，下咽癌組織中ZNF385C基因的mRNA水平明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3、在蛋白水平上進行驗證按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說明書提取各組蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品中蛋白濃度。以常規(guī)Western-blot方法檢測ZNF385C蛋白變化，各組實驗均重復3次，以β-actin為內參，做ZNF385C蛋白條帶吸光度定量分析，表達量以ZNF385C蛋白/β-actin吸光度的比值代表。結果如圖2顯示，與正常對照組織相比，下咽癌組織中ZNF385C蛋白水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實施例3抑制ZNF385C基因表達1、siRNA設計合成針對ZNF385C的siRNA序列：siRNA-ZNF385C：正義鏈為5’-AAUGAACAGCUUCUUCUUCAG-3’(SEQIDNO.5)反義鏈為5’-GAAGAAGAAGCUGUUCAUUUC-3’(SEQIDNO.6)；以上siRNA序列與陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。2、下咽癌細胞的培養(yǎng)與轉染2.1細胞培養(yǎng)下咽癌FADU細胞采用含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。2.2細胞轉染(1)轉染前24小時，在500μl無抗培養(yǎng)基中接種0.5-2*105個細胞，轉染時細胞融合度為30-50％。鋪板時要將細胞消化完全混勻，避免細胞堆積生長。(2)用50μlOpti-MEM稀釋siRNA(轉染細胞的終濃度為33nM，輕輕吹吸3-5次混勻。(3)輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50μlOpti-MEM稀釋1μlLipofectamine2000輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。(4)混合轉染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。(5)轉染復合物加入到24孔細胞板中，100μl/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。(6)細胞板置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48小時。轉染4-6小時后可換鮮培養(yǎng)基。3、利用QPCR實驗檢測siRNA的干擾效率3.1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。3.2逆轉錄步驟同實施例2。3.3QPCR步驟同實施例2。3.4結果結果如圖3所示，與siRNA-NC組相比，siRNA-ZNF385C能夠有效的抑制ZNF385C基因mRNA的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4、利用Westernblot實驗檢測siRNA的干擾效率步驟同實施例2。結果如圖4所示，與siRNA-NC組相比，siRNA-ZNF385C能夠有效的抑制ZNF385C蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實施例4ZNF385C基因的表達對下咽癌細胞增殖能力的測定1、步驟按照實施例2的步驟進行細胞轉染，將轉染48小時的細胞消化，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔5000個細胞，每孔200μL細胞懸液，分別培養(yǎng)24h、48、72后，以不加細胞者為空白對照組，每孔加入20μLMTT(0.5mg/mL)，培養(yǎng)箱內孵育4h后小心吸去孔內液體，每孔加入100μLDMSO，振蕩10～20min，使結晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔OD570值，以時間和吸光度值分別為橫縱坐標，繪制細胞生長曲線。每孔細胞設置3個復孔。本實驗重復3次。2、結果結果如圖5所示，與轉染siRNA-NC組相比，轉染siRNA-ZNF385C組細胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述實驗結果表明，ZNF385C基因表達促進了下咽癌細胞的增殖。實施例5下咽癌細胞抗體中和實驗1、步驟：將下咽癌細胞FADU接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個細胞/孔/200μl，細胞貼壁后進行如下處理：實驗組1(對照組)：下咽癌細胞中加入無關單抗(1:50)；實驗組2：下咽癌細胞中加入抗人ZNF385C單抗(1:50)。將細胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育24小時后，加入3H-TdR(1μCi/孔)，再培養(yǎng)24小時，收集細胞，加液體閃爍液，β計數儀檢測cpm值。2、統(tǒng)計學方法實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。3、結果結果如圖6所示，相比于對照組，加入抗人ZNF385C單抗的組細胞增殖減緩。上述實驗結果表明，抑制ZNF385C蛋白的功能可以抑制下咽癌細胞增殖。實施例6檢測ZNF385C基因表達對細胞遷移影響1、遷移實驗步驟(1)將轉染24h后的細胞消化，調整細胞密度為105/ml；(2)24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入600μL進口胎牛血清(FBS)，將Transwell小室置入24孔細胞培養(yǎng)板小孔，Transwell小室內加入各100μLRPMI1640培養(yǎng)基細胞懸液；(3)24孔細胞培養(yǎng)板孵育24h，將Transwell小室從24孔細胞培養(yǎng)板取出，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗Transwell小室膜部附著細胞；(4)取新24孔細胞培養(yǎng)板，小孔內加入甲醇/PBS混合液((1:1)600μL，將Transwell小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液從下室(24孔細胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(5)棄掉Transwell小室上室及24孔細胞培養(yǎng)板小孔內甲醇/PBS混合液，下室加入600μL甲醇，將Transwell小室置入小孔，使甲醇從下室(24孔細胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(6)棄掉甲醇，室溫下干燥15-30min；(7)取0.1％結晶紫染液600μL滴入24孔細胞培養(yǎng)板小孔，將Transwell小室置入小孔染色15min；(8)棄掉0.1％結晶紫染液，蒸餾水沖洗Transwell小室15min，晾干，顯微鏡下觀察，取不同視野拍照計數，實驗重復3次。2、結果轉染siRNA-NC組和轉染siRNA-ZNF385C組每個視野下平均遷移細胞數目分別為(168.47±15.13)個和(78.21土7.43)個，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述實驗結果表明，ZNF385C基因表達促進了下咽癌細胞的遷移。實施例7檢測ZNF385C基因表達對細胞侵襲的影響1、侵襲實驗步驟實驗前從-20℃冰箱取出MatrigelTM基質膠，冰盒上融化，取MatrigelTM基質膠與RPMI1640培養(yǎng)基按1:6比例混合，制成混合液加入Transwell小室上室，每孔45μL，將Transwell小室置入24孔細胞培養(yǎng)板，轉移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育30min，后續(xù)細胞接種及培養(yǎng)操作同上述細胞遷移實驗。培養(yǎng)24h后，棄掉培基，用棉簽輕輕拭去Transwell小室上室內MatrigelTM基質膠，勿損傷小室底膜，余操作同細胞轉移實驗。本實驗重復3次。2、結果轉染siRNA-NC組和轉染siRNA-ZNF385C組每個視野下平均侵襲細胞數目分別為(53.52±5.94)個和(25.91土4.78)個，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述實驗結果表明，ZNF385C基因表達促進了下咽癌細胞的侵襲。實施例8體外克隆形成能力的檢測1、步驟(1)將轉染24h后的細胞消化后制成細胞懸液，細胞計數板計數；(2)六孔細胞培養(yǎng)板每孔加入2ml10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基，按500個/孔細胞密度接種細胞懸液，輕輕混勻；(3)六孔細胞培養(yǎng)板移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育10天，每3天更換培養(yǎng)基1次，每次2ml/孔；(4)培養(yǎng)結束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液小心清洗3次，每次5min，室溫干燥，甲醇固定15min，棄掉甲醇，室溫空氣干燥20min；(5)取0.1％結晶紫染液加入細胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml，染色15min；(6)回收0.1％結晶紫染液，細胞培養(yǎng)板蒸餾水清洗15min；(7)拍照觀察計數，重復試驗3次。2、結果轉染siRNA-NC組平均集落形成數目分別為(174.32±14.91)個，轉染siRNA-ZNF385C組細胞平均集落形成數目為(78.69土5.03)個。上述實驗結果表明，ZNF385C基因表達促進了下咽癌細胞的成瘤能力。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。當前第1頁1 2 3