本發(fā)明涉及食品安全檢測免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種克百威分析測定試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

農(nóng)獸藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可或缺的重要生產(chǎn)資料,對保障農(nóng)業(yè)及糧食生產(chǎn)與安全發(fā)揮著重要作用。化學(xué)農(nóng)獸藥在可預(yù)見的將來,仍是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全保障不可或缺的手段。食品中農(nóng)獸藥殘留及其安全性評估受到科學(xué)研究工作者和公眾的廣泛關(guān)注。但是如果長期不合理使用會帶來環(huán)境污染，生態(tài)破壞以及對人體健康有危害等問題。因此建立高效快速低成本的土壤和水中的農(nóng)藥殘留成為重中之重?；谵r(nóng)藥能有效除蟲害，草害作用，農(nóng)藥的使用量也在大量增加，田間所施的農(nóng)藥，大部分會進(jìn)入到水、土壤和大氣中去，人們平常噴灑的農(nóng)藥，大部分會在土壤中形成農(nóng)藥殘留，而且有些農(nóng)藥的殘留量比較大容易蓄積并且難分解，如此日積月累最終危害的是人類自身的安全，尤其是高毒性、難于降解農(nóng)藥的使用已經(jīng)到了威脅生態(tài)環(huán)境和人類身體健康的地步，為了保證農(nóng)產(chǎn)品的食用安全，各個國家(美國，歐盟，日本等)先后制定了農(nóng)藥在不同食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)?？税偻?Carbofuran)是一種高效廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲劑，被廣泛用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟(jì)作物等的害蟲防治。克百威對膽堿酯酶的抑制不可逆,對人、畜、禽、魚等的毒性極高。其在酸性土壤中很難降解，易污染土壤和水源，尤其是在蔬菜和糧食作物上的大量使用，形成農(nóng)藥殘留，對公眾的健康和環(huán)境構(gòu)成直接威脅。因此，建立高效快速的克百威檢測技術(shù)，對加強(qiáng)環(huán)境和農(nóng)副產(chǎn)品中克百威殘留的監(jiān)測及快速診斷具有重要意義。

免疫分析方法的作用和地位目前已得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可，免疫分析方法的研究也是檢測方法研究最熱門的領(lǐng)域之一。在免疫分析方法領(lǐng)域中，我國在酶聯(lián)免疫分析方法方面開展了較為深入的研究，包括半抗原合成、抗體制備、標(biāo)記物偶聯(lián)、反應(yīng)體系中各種理化性質(zhì)對免疫分析方法的影響及半抗原結(jié)構(gòu)與其所制備得到抗體之間的構(gòu)效關(guān)系等方面。近年來，我國學(xué)者在熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物傳感器和生物條形碼免疫分析方法方面也開展了較多的研究工作。

目前納米技術(shù)引起了人們的廣泛關(guān)注。納米材料具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和獨特的生物相容性，對生物分子有很強(qiáng)的吸附功能，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價結(jié)合?；诩{米粒子的生物條形碼免疫分析方法，利用生物條形碼信號放大作用及磁性納米粒子的分離富集作用，其最低檢出限相對于ELISA方法提高了幾個數(shù)量級，致使其誕生以來，便獲得科學(xué)界的高度關(guān)注。

然而，目前現(xiàn)有技術(shù)中，還缺乏一種高靈敏度的應(yīng)用生物條形碼技術(shù)檢測克百威的方法。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明將新型酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針與克百威的免疫分析學(xué)有機(jī)結(jié)合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、特異、穩(wěn)定檢測克百威的試劑盒，該試劑盒適于在食品安全檢測中有效地推廣應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種克百威分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含有：

克百威標(biāo)準(zhǔn)品、克百威納米探針、克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針、催化底物以及終止液；

所述克百威納米探針由磁性納米粒子和克百威完全抗原偶聯(lián)而成；

所述克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針由抗克百威抗體以及HRP包被膠體金顆粒得到；所述HRP與鏈霉親和素組成復(fù)合物，以生物素修飾的單鏈DNA為媒介包被至所述膠體金顆粒上。

優(yōu)選的，所述催化底物為TMB顯色液(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)。

克百威(Carbofuran)分子式：C₁₂H₁₅NO₃；CAS號：1563-66-2。

為了提高檢測靈敏度，本發(fā)明利用生物條形碼技術(shù)構(gòu)建了一種新型多功能酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針，并發(fā)展基于該納米金復(fù)合探針的免疫方法。農(nóng)藥單克隆抗體、單鏈DNA、HRP共組裝到納米金表面構(gòu)建多功能酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針。其中，單克隆抗體用于免疫反應(yīng)，生物素修飾單鏈DNA作為納米金與HRP之間的橋梁，HRP作為信號分子。經(jīng)單鏈DNA的橋接作用，一個多功能納米金復(fù)合探針攜帶約多個個HRP分子。通過免疫競爭反應(yīng)，每個免疫復(fù)合物所對應(yīng)的HRP分子數(shù)得以增加，信號強(qiáng)度得以放大，能夠檢測低至13.4ng L^-1的克百威農(nóng)藥，同時保持良好的特異性。

該試劑盒的使用效果具有簡便、快速、靈敏、特異、穩(wěn)定等優(yōu)點。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)推廣使用，為食品安全檢測提供一種非常有價值的檢測手段。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述克百威完全抗原由克百威和載體蛋白偶聯(lián)而成。

更優(yōu)選的，所述載體蛋白為雞卵白蛋白。

雞卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)也稱雞卵清白蛋白，由386個氨基酸組成，分子量約43Kd。OVA作為惰性蛋白，它能維持膠體金的膠體穩(wěn)定，起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。

載體蛋白也可選用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述磁性納米粒子的粒徑為18～22nm。

磁性納米粒子的粒徑對克百威完全抗原的偶聯(lián)數(shù)量有著很大的影響，從而影響著最終反應(yīng)的靈敏度。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述膠體金顆粒的粒徑為13～15nm。

本申請的技術(shù)要點是通過形成克百威納米探針-克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針的結(jié)合，與克百威-克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針的結(jié)合進(jìn)行競爭，并且前者的結(jié)合應(yīng)該可以均一的分離。靈敏度提高的關(guān)鍵在于被檢物的有效回收和作為每個被檢物識別結(jié)合位點對應(yīng)的HRP的有效釋放。HRP催化底物得到的信號值對應(yīng)被檢物的量(克百威納米探針對被檢克百威的競爭性結(jié)合的抑制率)，因此可以通過HRP間接定量痕量的被檢物?？税偻{米探針-克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針的結(jié)合實質(zhì)是克百威納米探針中的克百威完全抗原與克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針中的抗克百威抗體的結(jié)合，而二者的結(jié)合強(qiáng)度與抗體/抗原的量密切相關(guān)，抗體/抗原的量則與膠體金顆粒/磁性納米粒子的粒徑密切相關(guān)。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述抗克百威抗體為單克隆抗體。

單克隆抗體由于可以通過細(xì)胞株進(jìn)行生產(chǎn)，各批次之間性質(zhì)穩(wěn)定，且特異性強(qiáng)，因而更適合試劑盒產(chǎn)品。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針具體由以下方法制備得到：

1)、取膠體金溶液調(diào)pH至8.8～9.2后向其中加入抗克百威抗體，攪拌混合，靜置25～35min；然后加入生物素修飾的單鏈DNA鏈，8～12℃靜置36～44h；再調(diào)整pH至7.3～7.5，加入NaCl至濃度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min離心8～12min，棄上清，得到含寡核苷酸的膠體金；

2)、用牛血清白蛋白濃度為0.8～1.2％的磷酸鹽緩沖溶液重懸所述含寡核苷酸的膠體金，孵育1～3h；再加入鏈霉親和素-HRP，室溫反應(yīng)1～3h，離心棄上清，得到所述克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針。

進(jìn)一步優(yōu)選的，在加入NaCl至既定濃度時，在120～180min內(nèi)分2～4次等量加入，每次間隔40～60min；更優(yōu)選的，在加入NaCl至既定濃度時，在140～160min內(nèi)分3次等量加入，每次間隔50min。

加入NaCl的過程即DNA的老化過程。納米金和DNA都帶負(fù)電，所以會相互排斥，加入NaCl可以屏蔽掉納米金表面的一些電荷，減少納米粒子間的排斥。但過高濃度的NaCl會導(dǎo)致鹽離子強(qiáng)度過大，易引起DNA團(tuán)聚，所以將其逐步加入，防止瞬間離子強(qiáng)度的過大。

如上所述的克百威分析測定試劑盒在克百威定性定量分析中的應(yīng)用。

利用磁分離系統(tǒng)分離免疫結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物，采用熱變性技術(shù)促使膠體金納米探針釋放HRP，并利用HRP對底物催化得到信號值的方法測定克百威含量，實現(xiàn)對克百威農(nóng)藥的定量檢測。

優(yōu)選的，如上所述的克百威定性定量分析的方法，該方法包括：

a)、將克百威標(biāo)準(zhǔn)品、提取與凈化后的待測樣品分別與等體積的克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針和克百威納米探針混合孵育；

b)、洗滌孵育產(chǎn)物并去雜化得到競爭復(fù)合物；

c)、使用催化底物與所述競爭復(fù)合物共孵育，然后加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定；

d)、以克百威標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度所對應(yīng)的灰度抑制率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的克百威濃度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明可以特異地定量檢測克百威含量。具有簡便、快速、靈敏、特異、穩(wěn)定等優(yōu)點。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)推廣使用，為食品安全檢測提供一種非常有價值的檢測手段。

2)、根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，磁性納米探針中的克百威半抗原與檢測樣品中的克百威競爭新型酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針的克百威單抗形成直接競爭體系，因此本法采用的競爭反應(yīng)體系，即確保檢測的靈敏度，也可有效保證檢測結(jié)果的良好重現(xiàn)性。另外，這種模式還便于操作和生產(chǎn)。

3)、本發(fā)明的試劑盒使用的是酶催化底物TMB顯色，靈敏度大大提高，可為蔬菜水果中克百威的檢測提供更為靈敏、快速、可靠的依據(jù)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例中以克百威標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度所對應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

克百威分析測定試劑盒的制備方法

S11、克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針的制備

金納米顆粒合成方法

向硅化好的燒杯中分別加入98mL去離子水，再分別入2mL 50mM氯金酸原液，使氯金酸的濃度為1mM，在磁力攪拌器上1000rpm/min攪拌、250℃加熱，液體沸騰后繼續(xù)煮沸2min；吸取10mL 38.8mM檸檬酸三鈉，迅速一次性加入燒杯中，保持?jǐn)嚢杷俣群图訜釡囟炔蛔?，繼續(xù)煮沸6min，可發(fā)現(xiàn)溶液顏色由無色逐漸變成紫色，再變成酒紅色，根據(jù)加入檸檬酸三鈉還原劑量的不同最終變成不同的顏色，待液體冷卻后用去離子水補(bǔ)回原體積，于4℃密閉保存，合成的金納米顆粒的粒徑控制在13～15nm。

分別取一定體積膠體金、用0.1mol/L K₂CO₃調(diào)節(jié)至pH9.0；靜置15min，加入一定量的克百威單克隆抗體,在攪拌下將膠體金和抗體混合,靜置30min。然后加入生物素修飾的單鏈DNA鏈，10℃靜置40h，再以PBS調(diào)整至pH 7.4，提高NaCl濃度，NaCl分3次加入，每隔1個小時加入一次，至終濃度0.1mol/L，10 000r/min離心10min,即得到含寡核苷酸的膠體金。然后再加入5％牛血清白蛋白(BSA)，使其最終濃度為1％。將鏈霉親和素-HRP加入單克隆抗體修飾的膠體金中，室溫反應(yīng)兩個小時，離心得到新型酶標(biāo)膠體金納米復(fù)合探針。

S12、克百威磁性納米探針的制備

1)、雞卵白蛋白(OVA)標(biāo)記克百威半抗原的制備

辣根過氧化物酶標(biāo)記克百威半抗原的制備，具體方法如下：

取半抗原0.25mmol,溶于1mL DMF，攪拌下加入60μl正三丁胺和30μl氯甲酸乙酯，室溫攪拌反應(yīng)1h。取反應(yīng)液300μl緩慢滴加到6mL溶有120mg OVA的CBS緩沖溶液(0.01mol/L)中，室溫攪拌反應(yīng)2h后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS透析3d，每天換透析液3-4次。取出分裝保存于-20℃的冰箱中。

2)、磁性納米粒子合成方法

磁性微球的形成過程：取8.1g FeCl₃·6H₂O和3.3g FeCl₂·4H₂O加入150mL去離子水，配成溶液，然后移入三口燒瓶中。在N₂保護(hù)環(huán)境中與劇烈攪拌狀態(tài)下向Fe²⁺和Fe³⁺的混合溶液中18mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的濃氨水，溶液中開始生成棕褐色的Fe₃O₄粒子，調(diào)節(jié)溶液的pH值在9～11之間，此刻反應(yīng)溫度為70℃，在反應(yīng)的過程中要保證一定的攪拌速度，反應(yīng)的離子方程式為：

Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-＝Fe₃O₄+4H₂O

Fe₃O₄/油酸的合成：在劇烈攪拌狀態(tài)下將5.0g油酸(C₁₈H₃₄O₂)加入Fe₃O₄的液體中，然后在N₂保護(hù)環(huán)境下，溫度為70℃水浴中反應(yīng)一個小時，使油酸均勻的包覆在粒子表面。反應(yīng)結(jié)束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來，用乙醇洗滌3次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH＝7，此時得到油酸均勻包覆的Fe₃O₄粒子。

單層羧基功能化的Fe₃O₄粒子合成：采用高錳酸鉀氧化油酸法合成壬二酸(HOOC(CH₂)₇COOH)形成羧基化磁性納米粒子。加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO₄溶液在劇烈攪拌狀態(tài)，溫度為50℃條件下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后利用外加磁場將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，并先后用去離子水洗滌3次，所得產(chǎn)物在40℃下真空干燥，將干燥后的粒子溶于水溶液便得到穩(wěn)定的羧基化磁性納米粒子。磁性納米粒子的粒徑控制在18～22nm。

3)、磁性微球和OVA-半抗原的連接

a)、微球的活化。用pH＝6.0，15mmol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(MES)作為活化緩沖溶液，取1mL磁珠于2.0mL離心管中，加入活化緩沖溶液后，將上清液吸掉；再用活化緩沖液重新洗滌磁珠2遍，再分別加入碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫活化30min。

b)、微球與OVA-半抗原偶聯(lián)。用pH＝7.4，0.01mol/L的磷酸鹽吐溫(PBST，1％Tween-20)溶液作偶聯(lián)緩沖液，用活化緩沖液重新洗滌已經(jīng)活化的磁珠3遍，再用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠2遍；然后用偶聯(lián)緩沖液重懸磁珠，再加入OVA-半抗原，使得磁珠表面活化的羧基與OVA的氨基于37C下反應(yīng)1h，將OVA-半抗原偶聯(lián)于磁珠表面，得到免疫磁珠。

c)、封閉。用偶聯(lián)緩沖液洗滌偶聯(lián)后磁珠2遍，加入含有2％BSA的偶聯(lián)緩沖液封閉磁珠60min。最終得到免疫磁性探針。

S13、克百威標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用克百威純品配制(10.0ng L^-1-40μg L^-1)，共7瓶。

所述克百威純品純度不低于90％。

S14、反應(yīng)體系工作濃度選定

經(jīng)優(yōu)化選定磁性納米探針稀釋倍數(shù)為100倍，膠體金納米探針稀釋倍數(shù)為20倍。

S15、半成品及成品組成

上述步驟所得部分分裝即為半成品，抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝為克百威分析測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。

綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進(jìn)行了篩選試驗和質(zhì)量鑒定，包括抗體和克百威半抗原的活性，膠體金顆粒的粒徑，磁性納米顆粒的粒徑和磁性等。然后通過對試劑盒的反應(yīng)模式、反應(yīng)時間、偶聯(lián)效率、催化時間，等一系列的條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了高靈敏度及良好重現(xiàn)性的克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針放大免疫分析方法。

實施例2

本發(fā)明的試劑盒使用方法

以上實施案例1制備的克百威酶標(biāo)膠體金復(fù)合探針放大免疫分析試劑盒的具體操作如下：

S21、自4℃冰箱中取出試劑盒，室溫平衡10分鐘；

S22、反應(yīng)孔中分別加各濃度克百威標(biāo)準(zhǔn)品(10.0ng L^-1-40μg L^-1)和經(jīng)前處理后得到的樣品各20μL，設(shè)一個重復(fù)，然后每孔加入磁性納米探針20μL，用微量振蕩器充分振蕩混勻，然后置于溫度為37℃，相對濕度為70％的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中溫育1h.；

S23、用PBST液洗滌三次，去雜化得到競爭復(fù)合物；

S24、50μL反應(yīng)底物TMB加入競爭反應(yīng)復(fù)合物中，37℃反應(yīng)15min，然后加入50μL終止液以終止反應(yīng)，放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定；

S25、以克百威標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度所對應(yīng)的灰度抑制率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的克百威濃度。

實驗例1

本發(fā)明試劑盒的方法學(xué)檢定結(jié)果

按照本領(lǐng)域中常見的檢定規(guī)程對實施案例1中制備的試劑盒進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1。

表1本發(fā)明試劑盒的方法學(xué)檢定結(jié)果

以上結(jié)果表明“克百威膠體金復(fù)合探針結(jié)合HRP免疫分析測定試劑盒”的準(zhǔn)確性、特異性、精密性、靈敏度和穩(wěn)定性是完全符合條件的。

實驗例2

克百威添加回收率試驗

為了檢驗克百威膠體金復(fù)合探針結(jié)合HRP免疫分析測定試劑盒的實際應(yīng)用性能，我們將克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到自來水中來模擬被克百威的水樣，通過標(biāo)準(zhǔn)添加回收實驗來測定自來水中克百威的濃度，添加濃度為10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的克百威，檢測結(jié)果見表2。

表2樣品中克百威的添加回收率

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。