技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及親和力測(cè)定的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法以及生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)組件。

背景技術(shù)：

親和力測(cè)定是測(cè)量溶液中的物質(zhì)，分析物的存在或濃度的生物化學(xué)測(cè)試，所述溶液通常包含物質(zhì)的復(fù)雜混合物，例如生物學(xué)液體，如血液、唾液、血清或尿。這樣的測(cè)定基于給定分子或所述分子的特定部分如抗體以高特異性結(jié)合至一種或非常有限組的其他分子的能力。測(cè)定的特異性取決于分析物能夠結(jié)合至其特異性結(jié)合伙伴以排除待分析的樣品中的所有其他物質(zhì)的程度。

除了需要特異性，必須選擇對(duì)分析物具有足夠高親和力的結(jié)合伙伴以產(chǎn)生準(zhǔn)確和可重復(fù)的測(cè)量，即可測(cè)量信號(hào)。在歷史上，這通過(guò)測(cè)量一些物理特征如光散射的變化或折射率的變化來(lái)完成。通過(guò)現(xiàn)代儀器，這類方法再次越來(lái)越受歡迎。然而，現(xiàn)在的大多數(shù)免疫測(cè)定依賴于使用分析試劑以結(jié)合至分析物，所述分析試劑與可檢測(cè)的標(biāo)記結(jié)合(associate)。已證實(shí)各種標(biāo)記，包括用于放射免疫測(cè)定的放射性元素；酶；熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光染料；乳膠和磁性顆粒；染料微晶、金、銀和硒膠體顆粒；金屬螯合物；輔酶；電活性基團(tuán)；寡核苷酸、穩(wěn)定的自由基、聚合物等。這類標(biāo)記用于分離游離和結(jié)合的標(biāo)記試劑之后檢測(cè)和定量結(jié)合事件，或者通過(guò)以結(jié)合事件影響標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)的變化這樣的方式設(shè)計(jì)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)和定量結(jié)合事件。

親和力測(cè)定通常探測(cè)肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如適配體與固定的結(jié)合伙伴的相互作用。典型的結(jié)合伙伴包括蛋白，其可以為受體、酶或抗體，但是還包括多肽和多氨基酸(例如，鎳結(jié)合位點(diǎn)的多His標(biāo)簽、酰胺或Schiff堿連接的多賴氨酸、硫醚連接的多半胱氨酸)。例如，基于固定方案的鏈霉親和素廣泛用于將生物素化的生物學(xué)元素連接至測(cè)定表面。

例如，親和力測(cè)定可以進(jìn)一步分類為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中，生物學(xué)樣品中的分析物與標(biāo)記的分析物類似物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其伙伴。然后測(cè)量結(jié)合至伙伴的標(biāo)記的分析物類似物的量。在這種方法中，反應(yīng)信號(hào)與生物學(xué)樣品中分析物的濃度成反比。這是因?yàn)榉磻?yīng)信號(hào)越大，樣品中越少分析物可用于與標(biāo)記的分析物類似物競(jìng)爭(zhēng)。

在非競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中，其也稱為“夾心測(cè)定”，生物學(xué)樣品中的分析物結(jié)合至其伙伴，然后標(biāo)記試劑結(jié)合至所述分析物。然后測(cè)量位點(diǎn)上標(biāo)記試劑的量。不像競(jìng)爭(zhēng)性方法，非競(jìng)爭(zhēng)性方法即夾心測(cè)定的結(jié)果直接與生物學(xué)樣品中分析物的濃度成比例。這是因?yàn)槿绻飳W(xué)樣品中不存在分析物，則標(biāo)記試劑不會(huì)結(jié)合。

親和力測(cè)定，特別是免疫測(cè)定廣泛用作細(xì)菌、病毒、內(nèi)分泌和寄生疾病的診斷工具以及濫用和慢性疾病狀態(tài)的檢測(cè)藥物，一個(gè)實(shí)例是可以導(dǎo)致心臟病發(fā)作的心臟疾病。

各種技術(shù)如放射免疫測(cè)定、免疫過(guò)氧化物酶和ELISA目前用于親和力測(cè)定，特別是免疫測(cè)定。然而，放射免疫測(cè)定具有需要使用危險(xiǎn)和破壞環(huán)境的試劑的缺點(diǎn)。

此外，除了特異性，如上文所述，靈敏度對(duì)于測(cè)定性能是至關(guān)重要的。測(cè)定的靈敏度可以通過(guò)結(jié)合事件產(chǎn)生的特異性信號(hào)與系統(tǒng)的背景噪聲相比的比例來(lái)定義。

降低信噪比(SNR)的因素包括試劑如抗體非特異性結(jié)合至測(cè)定的各種組分。此外，與測(cè)定的試劑如酶底物反應(yīng)的測(cè)定基質(zhì)的一些內(nèi)源性組分的活性傾向于產(chǎn)生“假”反應(yīng)產(chǎn)物，其干擾標(biāo)記的復(fù)合物如標(biāo)記的抗體-抗原復(fù)合物形成的“真正”產(chǎn)物的準(zhǔn)確檢測(cè)。

通常，將添加劑如封閉試劑加入測(cè)定基質(zhì)以降低測(cè)定噪聲并減少假陽(yáng)性信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與現(xiàn)有技術(shù)已知的親和力測(cè)定相比具有更高信噪比的親和力測(cè)定。

本發(fā)明的另一目的是提供這樣的親和力測(cè)定，其適合廣泛的分析物。

具體地，本發(fā)明的目的是提供一種適合整合入醫(yī)療點(diǎn)或者臺(tái)面、裝置和微型化的親和力測(cè)定。

本發(fā)明的另一目的是提供一種產(chǎn)生最少假陽(yáng)性結(jié)果的快速和可靠的親和力測(cè)定。

這些目的通過(guò)用獨(dú)立權(quán)利要求所示的親和力測(cè)定檢測(cè)生物學(xué)樣品中的生物學(xué)靶標(biāo)的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。從屬權(quán)利要求表明優(yōu)選的實(shí)施方案。在這種上下文中值得注意的是，以下描述中給出的所有范圍應(yīng)當(dāng)理解為它們包括限定這些范圍的值。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的這些和其他方面參考下文所述的實(shí)施方案會(huì)清楚和闡明。

圖1圖示根據(jù)本發(fā)明將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積以及檢測(cè)和/或定量的進(jìn)一步任選存在的步驟的一個(gè)實(shí)例。

圖2圖示根據(jù)本發(fā)明在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的一個(gè)實(shí)例。

圖3示出本發(fā)明怎樣實(shí)現(xiàn)增加信噪比的目的的另一方面。

圖4示出第一捕獲部分的組織的實(shí)例。

圖5示出合適的接頭的模塊設(shè)計(jì)的一些實(shí)例。

圖6示出富集的3-表位親和力測(cè)定的概念驗(yàn)證。

圖7示出來(lái)自建立心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)和前列腺特異性抗原(PSA)的3-表位親和力測(cè)定的初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖8圖示熱切割然后競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定的實(shí)例。

圖9更詳細(xì)地示出3-表位測(cè)定中的第一捕獲部分不干擾檢測(cè)。

圖10示出捕獲時(shí)間常數(shù)的確定。

圖11示出步驟c)的評(píng)價(jià)，即對(duì)各種體積濃縮因素的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮的評(píng)價(jià)。

圖12示出步驟c)的劑量反應(yīng)曲線，即生物學(xué)靶標(biāo)濃縮的劑量反應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)親和力測(cè)定檢測(cè)生物學(xué)樣品中的生物學(xué)靶標(biāo)的方法包括以下步驟

a)提供包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積；

b)將第一捕獲部分加入包含所述生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積，其中所述第一捕獲部分粘附至顆粒；

c)將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的洗脫體積；

d)從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學(xué)靶標(biāo)；

e)以?shī)A心或競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式直接或間接檢測(cè)和/或定量所述生物學(xué)靶標(biāo)，其中所述生物學(xué)靶標(biāo)與至少一種捕獲部分結(jié)合，優(yōu)選與至少兩種捕獲部分結(jié)合。

這種親和力測(cè)定具有這樣的優(yōu)勢(shì)，將生物學(xué)靶標(biāo)濃縮并去除可以干擾檢測(cè)的因素，因此導(dǎo)致增加的特異性結(jié)合和減少的非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致測(cè)定的大大增加的信噪比和更高的靈敏度。

具體地，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量分開(kāi)是有益的。因此第一捕獲部分的量與粘附的顆粒可以是大的，以便捕獲盡可能多的生物學(xué)靶標(biāo)，但是第一捕獲部分與粘附的顆粒不干擾生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量。例如，如果第一捕獲部分與粘附至它們的大磁性顆粒用來(lái)捕獲大體積的生物學(xué)靶標(biāo)，例如生物學(xué)樣品，其比較小的顆粒更易于驅(qū)動(dòng)。因此，更易于從大體積(生物學(xué)樣品)收集這些較大的顆粒，并且將它們和結(jié)合的生物學(xué)靶標(biāo)轉(zhuǎn)移至較小的體積(洗脫體積)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)靶標(biāo)”指待檢測(cè)的生物學(xué)來(lái)源的物質(zhì)。生物學(xué)靶標(biāo)的非限制性實(shí)例為蛋白、肽、抗體、毒性物質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、細(xì)胞組分、病毒、細(xì)胞外基質(zhì)的組分、細(xì)胞、細(xì)胞片段、核酸、半抗原和/或藥物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和力測(cè)定”指測(cè)量生物學(xué)靶標(biāo)的存在或濃度的生物化學(xué)測(cè)試，其基于捕獲部分以高特異性結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)以及任選地結(jié)合至一種或非常有限組的其他分子的能力。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品體積”指其中最初提供生物學(xué)靶標(biāo)的體積或部分體積。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“捕獲部分”指結(jié)合元件，例如這樣的部分，其包含選擇性結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的表位的互補(bǔ)性決定區(qū)域并可以結(jié)合至至少一種其他實(shí)體如顆粒，并且可以具有與其結(jié)合的試劑。

在一優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲部分為抗體，例如動(dòng)物抗體、人抗體、人嵌合抗體和人源化抗體及其片段，如Fab片段等，或者為適配體，或者為核酸或多肽或包含結(jié)合位點(diǎn)的任何物質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合元件”指另一元件可以結(jié)合或關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)為表位，即抗原決定簇，即被免疫系統(tǒng)，特別是抗體、B細(xì)胞或T細(xì)胞識(shí)別的抗原部分。

適配體是結(jié)合至特異性靶分子的寡核酸(oligonucleic acid)或肽分子。適配體通常通過(guò)從大的隨機(jī)序列池選擇來(lái)產(chǎn)生，但是天然適配體還存在于核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch)中。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“顆?！敝改軌蛑С植东@部分的粘附的結(jié)構(gòu)，例如珠。顆?？梢灾苽渥原傊?、聚苯乙烯、乳膠、聚乙烯醇、硅。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，顆?？梢跃哂?μm-0.1μm的直徑，更優(yōu)選1μm-0.3μm，即≥0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和/或≤1μm。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“切割”指從顆粒分離捕獲部分或者從捕獲部分分離生物學(xué)靶標(biāo)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“粘附至”指捕獲部分通過(guò)接頭粘附至顆粒之一的情況。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接頭”指允許從顆粒分離第一捕獲部分的結(jié)構(gòu)。接頭可以位于第一捕獲部分上和/或顆粒中。例如，如果采用pH誘導(dǎo)的切割就可以是這樣。或者，接頭可以是偶聯(lián)至捕獲部分和/或顆粒的分離結(jié)構(gòu)。

接頭可以利用模塊設(shè)計(jì)來(lái)構(gòu)建；圖5給出一些實(shí)例。原則上可以使用任何偶聯(lián)(生物)化學(xué)(羧基、胺、sulfhydride、馬來(lái)酰亞胺等)，優(yōu)選互相不同。此外，接頭應(yīng)當(dāng)包含可切割的實(shí)體?？汕懈畹膶?shí)體的實(shí)例和切割的方法包括但不限于：

可以通過(guò)蛋白酶切割的肽(優(yōu)選特異性氨基酸序列)；和/或

可以通過(guò)核酸酶切割的核酸序列(優(yōu)選特異性序列/核酸酶)；和/或

光致斷裂元件(Photocleavable element)；和/或

溫度誘導(dǎo)的切割；和/或

化學(xué)誘導(dǎo)的切割(例如S-S鍵的還原)；和/或

pH誘導(dǎo)的切割。

接頭的實(shí)例為包含限制位點(diǎn)的合成DNA片段，但是接頭的許多不同選擇是可用的。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合(associated with)”指物理結(jié)合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“直接檢測(cè)和/或定量”表示檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)本身。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“間接檢測(cè)和/或定量”表示使用競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定，其中不檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)本身，但是檢測(cè)和/或定量與生物學(xué)靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)步驟e)的至少一種捕獲部分的實(shí)體，例如生物學(xué)靶標(biāo)的類似物。

在一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟e)中的至少一種捕獲部分為檢測(cè)表面的一部分。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)表面”指能夠結(jié)合生物學(xué)靶標(biāo)以及使得能夠檢測(cè)的表面。為了本發(fā)明的目的，檢測(cè)表面可以是生物的、非生物的、有機(jī)的、無(wú)機(jī)的或者它們的組合，并且可以為顆粒、鏈、沉淀、凝膠、片、管、球、容器、毛細(xì)管、墊、薄片、膜、玻片等的形式，具有任何方便的形狀，包括圓盤、球形、圓形等，只要其允許檢測(cè)結(jié)合的生物學(xué)靶標(biāo)。

在這樣的設(shè)定中，特別優(yōu)選步驟e)中的至少一種捕獲部分包含以這樣的方式構(gòu)建的生物化學(xué)分子或結(jié)構(gòu)，其允許結(jié)合至支持物以及生物學(xué)靶標(biāo)。這樣的生物化學(xué)分子或結(jié)構(gòu)的實(shí)例為核酸，優(yōu)選多達(dá)200個(gè)堿基的DNA寡核苷酸，以及蛋白和半抗原如抗體或凝集素，其可以結(jié)合分子結(jié)構(gòu)如DNA序列、抗體、抗原或酶。

步驟e)中的至少一種捕獲部分還可以包含強(qiáng)結(jié)合物質(zhì)如鏈霉親和素。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”指確定生物學(xué)靶標(biāo)的物理存在和/或定量檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)。

在一優(yōu)選實(shí)施方案中，親和力測(cè)定為免疫測(cè)定，即該測(cè)定利用抗體特異性結(jié)合分析物，即生物學(xué)靶標(biāo)。這有利于可獲得具有不同結(jié)合位點(diǎn)的不同抗體的良好選擇的那些生物學(xué)靶標(biāo)，因?yàn)榭贵w-抗原結(jié)合通常是高度特異性和非常靈敏的。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)-d)順序應(yīng)用一次或多次。這是有利的，因?yàn)槠湓试S更高地富集和/或純化溶液中的生物學(xué)靶標(biāo)。

此外，優(yōu)選生物學(xué)靶標(biāo)與步驟e)中的至少兩種捕獲部分結(jié)合，其中所述兩種捕獲部分中的一種為檢測(cè)表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測(cè)。換句話說(shuō)，生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面。

這種生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面的捕獲部分具有這樣的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)不需要額外的系列結(jié)合步驟。

在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟e)中，第一捕獲部分或第二捕獲部分與另一捕獲部分結(jié)合。

因此，如果第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割，第一捕獲部分或其一部分可以用來(lái)結(jié)合至另一捕獲部分。優(yōu)選地，額外的捕獲部分是檢測(cè)表面的一部分。這樣，生物學(xué)靶標(biāo)間接結(jié)合至額外的捕獲部分并因此結(jié)合至檢測(cè)表面，從而使得能夠檢測(cè)(參見(jiàn)例如圖3B)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“間接結(jié)合”表示生物學(xué)靶標(biāo)本身不結(jié)合至檢測(cè)表面。取而代之，第一捕獲部分的一部分如第三實(shí)體或標(biāo)簽結(jié)合至檢測(cè)表面(參見(jiàn)例如圖3B和圖3C)。

如果生物學(xué)靶標(biāo)僅具有一個(gè)捕獲部分可以結(jié)合的位點(diǎn)，則間接結(jié)合特別有利，因?yàn)樵跈z測(cè)表面上的生物學(xué)靶標(biāo)的重新捕獲發(fā)生時(shí)這個(gè)位點(diǎn)已被第一捕獲部分占據(jù)。

或者，無(wú)論第一捕獲部分是否與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割，第二捕獲部分均可以結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)，并且這種第二捕獲部分轉(zhuǎn)而可以用來(lái)結(jié)合至另一捕獲部分。因此同樣地，如果額外的捕獲部分是檢測(cè)表面的一部分，則生物學(xué)靶標(biāo)間接結(jié)合至額外的捕獲部分并因此結(jié)合至檢測(cè)表面，從而使得能夠檢測(cè)(參見(jiàn)例如圖3C)。

在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟e)中，生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分結(jié)合。

因此在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)與至少3種捕獲部分結(jié)合。例如，這些可以是與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割的第一捕獲部分以及兩種額外的捕獲部分，其中一種是檢測(cè)表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測(cè)。換句話說(shuō)，生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面(參見(jiàn)例如圖3D)。

這種生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至檢測(cè)表面的捕獲部分具有這樣的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)不需要額外的系列結(jié)合步驟。

此外，生物學(xué)靶標(biāo)可以與4種捕獲部分結(jié)合，如果第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割就可以是這樣?？赡軄?lái)自生物學(xué)靶標(biāo)的第二輪濃縮并在切割之后還保持連接至生物學(xué)靶標(biāo)的第二捕獲部分結(jié)合至第三捕獲部分，其是檢測(cè)表面的一部分，而第四捕獲部分連接至顆粒，使得能夠在這種檢測(cè)表面上檢測(cè)。第二部分可以通過(guò)DNA-接頭結(jié)合至第三捕獲部分，所述DNA-接頭具有第三捕獲部分識(shí)別的表位。

例如，如果檢測(cè)表面的捕獲部分即第三捕獲部分與第二捕獲部分之間的結(jié)合通過(guò)強(qiáng)結(jié)合物質(zhì)介導(dǎo)，如生物素與鏈霉親和素之間的相互作用，則這種配置是有利的。

在本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑與至少一種捕獲部分結(jié)合，或者在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定形式的情況下，與步驟e)中的生物學(xué)靶標(biāo)的類似物結(jié)合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“試劑”指使得能夠在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)和/或促進(jìn)在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的物質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)靶標(biāo)的類似物”指在競(jìng)爭(zhēng)性親和力測(cè)定中與生物學(xué)靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)。

包含這個(gè)額外步驟的親和力測(cè)定是有利的，因?yàn)樵噭┛梢允桥c本領(lǐng)域已知的公認(rèn)的檢測(cè)系統(tǒng)一起工作的許多物質(zhì)中的任何一種。因此，無(wú)論測(cè)定的生物學(xué)靶標(biāo)，實(shí)際的檢測(cè)反應(yīng)可以從多種已知的方法中選擇。

如果親和力測(cè)定包含這個(gè)額外步驟，如果接頭包含間隔元件，這是有益的，因?yàn)闄z測(cè)表面與試劑之間的距離增加，這允許非特異性與特異性結(jié)合之間更好的區(qū)別。

優(yōu)選地，所述試劑選自：

放射性同位素；和/或

固相，例如磁珠或乳膠珠或檢測(cè)表面；和/或

熒光、磷光和/或化學(xué)發(fā)光染料；和/或

酶和/或酶底物；和/或

核酸序列、肽；和/或

膠體或納米顆粒；和/或

聚合物或大分子，例如樹(shù)狀聚體或脂質(zhì)體。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于步驟a)中的生物學(xué)樣品體積的第二體積通過(guò)磁性分離或重力來(lái)進(jìn)行。

優(yōu)選地，在濃縮步驟中，生物學(xué)樣品體積以1:2-1:1000的比例減小，即1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:500和/或1:1000。

此外，生物學(xué)樣品體積優(yōu)選具有1μl-5ml的體積，即≤1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、50μl、100μl、300μl、500μl、1ml、3ml和/或5ml。

濃縮步驟之后的生物學(xué)樣品體積，這里也稱為洗脫體積，對(duì)于酶促洗脫可以高達(dá)例如5μL，而對(duì)于光化學(xué)洗脫可以高達(dá)例如15μL。

可用于濃縮步驟a)中的生物學(xué)靶標(biāo)的兩種方法磁性分離或重力是快速、可靠的技術(shù)。

在一可選實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)比例的減小通過(guò)過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，顆?？梢詾镠is-標(biāo)簽，即由至少5個(gè)組氨酸(His)殘基組成的氨基酸基序，并且過(guò)濾可以利用親和介質(zhì)如Ni Sepharose、NTA-瓊脂糖、His60Ni、HisPur樹(shù)脂或Talon樹(shù)脂來(lái)進(jìn)行。

優(yōu)選地，顆粒為磁性顆粒和/或超順磁顆粒。這是有益的，因?yàn)榇判灶w粒和/或超順磁顆粒具有高表面比體積比例，并且磁性顆粒使得生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例能夠通過(guò)磁性分離而減小。

例如，如果顆粒為磁性顆粒，則本發(fā)明的方法可以如下進(jìn)行：首先，將包含生物學(xué)靶標(biāo)的生物學(xué)樣品體積提供在第一室中。然后，加入粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分。在足夠的生物學(xué)靶標(biāo)與粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分之間的結(jié)合發(fā)生之后，利用磁力將捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)轉(zhuǎn)移至第二個(gè)較小的室，從而減小生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例。隨后，從磁性顆粒切割第一捕獲部分，并且將磁性顆粒從第二個(gè)較小的室去除。最后，在檢測(cè)表面上重新捕獲生物學(xué)靶標(biāo)，并且在檢測(cè)表面上檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)。

利用這種方法，大量磁性顆?？梢杂脕?lái)分離和濃縮生物學(xué)樣品體積內(nèi)的生物學(xué)靶標(biāo)而不干擾隨后的檢測(cè)步驟。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選方法中，從顆粒切割第一捕獲部分通過(guò)酶促、熱和/或光化學(xué)切割進(jìn)行。

還可以平行或順序(after each other)聯(lián)合使用的每種不同的切割方法具有其特定優(yōu)勢(shì)。然而，所有切割方法均可以與親和力測(cè)定聯(lián)合使用，因?yàn)樗星懈罘椒ň鹱钚「蓴_和流體的最小污染?？蛇x方法，例如通過(guò)降低pH切割或化學(xué)誘導(dǎo)的切割如還原反應(yīng)可以強(qiáng)烈影響生物學(xué)靶標(biāo)的狀態(tài)和構(gòu)象，并且可以改變?nèi)芤旱幕瘜W(xué)條件，從而強(qiáng)烈干擾隨后的親和力測(cè)定。雖然最后這兩種方法均為簡(jiǎn)單的公知的從抗體洗脫分析物的方式，但是它們具有在過(guò)程中以后影響生物學(xué)靶標(biāo)的親和力測(cè)定的缺點(diǎn)。

例如酶促切割可以用于所有靶標(biāo)，并且它是溫和的過(guò)程，可以用于是蛋白的生物學(xué)靶標(biāo)，因?yàn)樗ǔ２蛔冃缘鞍住Ｒ虼?，本發(fā)明的方法對(duì)于濃縮即蛋白的富集特別有利，濃縮的進(jìn)行通常非常具有挑戰(zhàn)性，這是由于蛋白分子對(duì)溫度的敏感性和緩沖制劑的變化。此外，酶促切割允許隨后的免疫測(cè)定。使用DNA的優(yōu)勢(shì)是測(cè)定的性能可以通過(guò)在抗體結(jié)合以外的地方放置限制位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)。剩余的DNA接頭可以用來(lái)增加最終測(cè)定上的檢測(cè)信號(hào)。

切割的優(yōu)選酶為DNase和EcoR1。對(duì)于優(yōu)選實(shí)施方案，DNAse表現(xiàn)出比EcoR1更高的收率。可以使用任何特異性核酸酶，具有對(duì)DNA序列的最小影響。這里，在優(yōu)選實(shí)施方案中，EcoRI用來(lái)顯示系統(tǒng)可以是可適應(yīng)的，并且還顯示核酸檢測(cè)方法的通用性。

熱切割具有這樣的優(yōu)勢(shì)，切割位點(diǎn)具有比酶促切割少的特異性要求，其特別適合可以耐受高溫的生物學(xué)靶標(biāo)，例如小分子。然而，如果小心不要使用可以變性蛋白的溫度，則還可以對(duì)是蛋白的生物學(xué)靶標(biāo)進(jìn)行熱切割。

在熱切割的情況下，從顆粒切割第一捕獲部分的步驟可以被從第一捕獲部分切割生物學(xué)靶標(biāo)代替。然而，當(dāng)然還可能將熱切割位點(diǎn)構(gòu)建入接頭和/或第一捕獲部分本身。

光化學(xué)切割是有益的，因?yàn)椴恍枰尤肫渌孜?，例如酶促反?yīng)的酶。關(guān)于將這種測(cè)定整合入緊湊型裝置，光化學(xué)切割也表現(xiàn)出一些優(yōu)勢(shì)。

然而，用這種形式的切割，測(cè)定需要在允許光穿透的環(huán)境如暗盒(cartridge)中進(jìn)行。

此外，優(yōu)選的檢測(cè)和/或定量方法選自：

-光學(xué)檢測(cè)，例如熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、吸收、散射、成像、瞬逝場(chǎng)技術(shù)、受抑全內(nèi)反射、表面等離子共振、拉曼、光譜學(xué)；和/或

-酶反應(yīng)；和/或

-核酸擴(kuò)增技術(shù)，例如免疫-PCR、滾環(huán)擴(kuò)增；和/或

-磁性檢測(cè)，例如通過(guò)磁致電阻、霍爾效應(yīng)、線圈；和/或

-聲波檢測(cè)，例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體；和/或

-電檢測(cè)，例如電導(dǎo)、阻抗、電流、氧化還原循環(huán)、電荷；和/或

-光磁檢測(cè)。

一種光學(xué)檢測(cè)技術(shù)為受抑全內(nèi)反射(FTIR)。在正確的角度照明，通常反射擊中傳感器的活性表面下側(cè)的光強(qiáng)度沒(méi)有任何損失，這是全內(nèi)反射。然而，當(dāng)納米顆粒結(jié)合至表面的對(duì)側(cè)時(shí)，它們散射并吸收光，減少反射光束的強(qiáng)度。通過(guò)傳感器檢測(cè)對(duì)應(yīng)于結(jié)合的納米顆粒的數(shù)量的反射光束的這些強(qiáng)度變化，例如與數(shù)碼相機(jī)中使用的相似的CMOS圖像傳感器。這是FTIR。

各種合適的酶反應(yīng)如辣根過(guò)氧化物酶是本領(lǐng)域公知的。

免疫-PCR為抗原檢測(cè)系統(tǒng)，其中特異性DNA分子用作標(biāo)記，并且PCR用來(lái)檢測(cè)這種標(biāo)記。

如果試劑為磁性顆粒，檢測(cè)的優(yōu)選方法為FTIR，因?yàn)槠淇煽俊⒖焖?，并且可以在小體積中工作。

在本發(fā)明的方法的一優(yōu)選實(shí)施方案中，切割為酶促的，試劑為磁珠，并且生物學(xué)靶標(biāo)與進(jìn)一步的捕獲部分結(jié)合。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過(guò)生物學(xué)靶標(biāo)上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行。

在這樣的情況下，生物學(xué)靶標(biāo)上的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被與試劑結(jié)合的第一捕獲部分、第二捕獲部分以及第三捕獲部分占據(jù)，所述第三捕獲部分優(yōu)選為檢測(cè)表面的一部分。

本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)雖然生物學(xué)靶標(biāo)上的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)已被占據(jù)，靶標(biāo)仍然可以通過(guò)第三結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合至檢測(cè)表面。換句話說(shuō)，已結(jié)合的元件不空間上阻礙生物學(xué)靶分子的檢測(cè)，即使在磁珠作為試劑，第二捕獲部分試劑復(fù)合物非常大的情況下也是如此。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)結(jié)合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過(guò)結(jié)合至表位進(jìn)行，即結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的抗原決定簇。

這種“3-表位-測(cè)定”是有利的，因?yàn)槠渚哂懈咛禺愋裕@是由于結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)的3個(gè)抗原決定簇。此外，由于從顆粒酶促切割第一捕獲部分，生物學(xué)靶標(biāo)在空間上對(duì)于試劑結(jié)合的第二捕獲部分非常易于接近，并且直接結(jié)合至檢測(cè)表面。

在一可選實(shí)施方案中，提供生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)組件，其包含第一、第二和第三捕獲部分，其中試劑與第二和/或第三捕獲部分結(jié)合，并且生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合至所有三個(gè)捕獲部分，從而使得能夠檢測(cè)。

在這種檢測(cè)組件的一優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)靶標(biāo)通過(guò)表位結(jié)合至所有捕獲部分。

在另一可選實(shí)施方案中，提供捕獲部分，其包含

a)第一實(shí)體，用于附著至顆粒，

b)第二實(shí)體，用于切割對(duì)顆粒的附著，以及

c)第三實(shí)體，用于附著至檢測(cè)表面。

優(yōu)選地，權(quán)利要求13的捕獲部分在權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法中用作第一捕獲部分。

因此，當(dāng)使用這個(gè)實(shí)施方案時(shí)，第一捕獲部分結(jié)合至生物學(xué)靶標(biāo)，并且與生物學(xué)靶標(biāo)一起從顆粒切割。

優(yōu)選地，檢測(cè)表面包含進(jìn)一步的捕獲部分。

與上述3-表位測(cè)定相反，結(jié)合至檢測(cè)表面是間接的，因?yàn)榈谌龑?shí)體結(jié)合至檢測(cè)表面而不是生物學(xué)靶標(biāo)。

在這種情況下，如果接頭包含間隔是有益的，因?yàn)檫@增加檢測(cè)表面上第三實(shí)體的結(jié)合面積。具體地，間隔增加在檢測(cè)表面上找到結(jié)合位置的面積，因?yàn)槠渲械谌龑?shí)體可以成功地結(jié)合更多方向或空間。

一般來(lái)說(shuō)，可以研究本發(fā)明的方法的步驟b)期間發(fā)生的第一捕獲反應(yīng)作為時(shí)間和顆粒濃度的函數(shù)。步驟b)期間發(fā)生的第一捕獲部分與生物學(xué)靶標(biāo)之間的相互作用可以模擬為一階速率表達(dá)式及之后的重排；捕獲效率(ε_capt)如下：

其中

其中，tc_apt為本發(fā)明的方法的步驟b)的實(shí)驗(yàn)溫育時(shí)間，τ為估計(jì)的捕獲常數(shù)，k_on為以M^-1.s^-1計(jì)的結(jié)合速率常數(shù)，而[Ab]為顆粒(M)上的第一捕獲部分如抗體的濃度。τ直接關(guān)聯(lián)至顆粒的濃度。在這個(gè)捕獲步驟中，第一捕獲部分濃度與生物學(xué)樣品體積中顆粒的量成比例。當(dāng)t_capt>>τ時(shí)，ε_capt接近100％。當(dāng)t_capt<<τ時(shí)，則ε_capt較低，并且可以接近被t_capt超過(guò)。τ與生物學(xué)樣品體積中顆粒的量成比例。

此外，例如圖11所示，可以計(jì)算富集因子(ξ)。然而，富集效率與體積比例不是線性的。對(duì)于30分鐘方法，對(duì)于1:1體積，用最小量的顆粒，整個(gè)方法的效率ξ確定在0.29，而80:1體積獲得的富集的因子約14.9。這可以通過(guò)將該方法分離為捕獲、濃縮和洗脫步驟來(lái)理解。富集效率(ξ)如下：

其中(ξ)為富集效率；ε_capt為捕獲效率，其為0-1；ε_conc為濃縮效率，其為生物學(xué)樣品體積比洗脫體積的比例(V_S/V_el)，如果需要富集，其大于1；ε_el為洗脫效率，其為0-1。

總效率或富集效率獨(dú)立于生物學(xué)靶標(biāo)濃度。

附圖討論

本發(fā)明的目的的其他細(xì)節(jié)、特點(diǎn)、特征和優(yōu)勢(shì)公開(kāi)于從屬權(quán)利要求，附圖以及各附圖和實(shí)例的以下描述以示例性方式顯示本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案和材料的實(shí)例。在附圖中：

圖1圖示將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積以及檢測(cè)和/或定量的進(jìn)一步任選存在的步驟的一個(gè)實(shí)例。在這個(gè)實(shí)例中，第一容器101包含生物學(xué)樣品體積102，其包含生物學(xué)靶標(biāo)103和粘附至顆粒104的第一捕獲部分，在這種情況下，所述顆粒104為磁珠。此外，第一容器101通過(guò)連接器105與小于第一容器的第二容器106以流體聯(lián)系，并且第二容器106通過(guò)另一連接器105與第三容器108以流體聯(lián)系。第三容器108包含與試劑107結(jié)合的第二捕獲部分。

圖1A顯示一些生物學(xué)靶標(biāo)103已結(jié)合至粘附至磁珠104的第一捕獲部分。在下一步中，在圖1B中，利用磁力將粘附至磁珠104的第一捕獲部分轉(zhuǎn)移至第二容器106。還因此大部分生物學(xué)靶標(biāo)103現(xiàn)在存在于第二容器106中，并且因此以較小的洗脫體積存在。因此將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積。

在圖1C中，已從粘附至磁珠104的第一捕獲部分切割生物學(xué)靶標(biāo)，并且已利用磁力將粘附至磁珠104的第一捕獲部分轉(zhuǎn)移回第一容器101。

在圖1D中，已通過(guò)連接器105將與試劑107結(jié)合的第二捕獲部分從第三容器108轉(zhuǎn)移至第二容器106，并且第二捕獲部分已重新捕獲生物學(xué)靶標(biāo)103。

利用這種方法，粘附至磁珠104(高珠濃度)的大量第一捕獲部分可以用來(lái)捕獲生物學(xué)靶標(biāo)103，而較少量的與試劑107結(jié)合的第二捕獲部分可以用于檢測(cè)。

如這個(gè)實(shí)例所示，將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積導(dǎo)致信噪比的顯著增加，這甚至可以通過(guò)將生物學(xué)樣品體積的溶液交換為不同溶液的機(jī)會(huì)來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)，例如所述不同溶液儲(chǔ)存在第二容器中，其包含較少的可以干擾檢測(cè)的因子。

圖2圖示根據(jù)本發(fā)明在親和力測(cè)定中檢測(cè)生物學(xué)靶標(biāo)的方法的一個(gè)實(shí)例。提供包含生物學(xué)靶標(biāo)202的生物學(xué)樣品體積201之后，加入第一捕獲部分203，這里為生物學(xué)靶標(biāo)上的表位的抗體，其通過(guò)DNA-接頭209粘附至顆粒204，在這個(gè)圖2中為鏈霉親和素磁性顆粒。在下一步中，將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)202濃縮為小于生物學(xué)樣品體積201的洗脫體積。這種將生物學(xué)靶標(biāo)從較大體積濃縮為較小體積這樣進(jìn)行，通過(guò)磁力轉(zhuǎn)移磁性顆粒204并因此將具有任何結(jié)合的生物學(xué)靶標(biāo)的第一捕獲部分203轉(zhuǎn)移至較小體積。然后從磁性顆粒204切割第一捕獲部分203。在這個(gè)實(shí)例中，這通過(guò)用酶DNase處理來(lái)進(jìn)行，DNase在預(yù)定位置切割DNA-接頭209，從而從磁性顆粒204分別釋放抗體-生物學(xué)靶標(biāo)復(fù)合物和未結(jié)合的抗體。在下一步中，將生物學(xué)靶標(biāo)202重新捕獲在包含第三捕獲部分206的檢測(cè)表面205上，這里所述第三捕獲部分206為結(jié)合生物學(xué)靶標(biāo)202的抗體。此外，具有與其結(jié)合的試劑208(這里為磁珠)的第二捕獲部分207也結(jié)合生物學(xué)靶標(biāo)202。因此，形成的復(fù)合物為3-表位復(fù)合物，其可以在Magnotech裝置上通過(guò)FTIR檢測(cè)。這種裝置具有這樣的優(yōu)勢(shì)，未結(jié)合或弱結(jié)合的磁珠通過(guò)磁力從表面去除，因此不可以干擾檢測(cè)。本發(fā)明的方法的步驟e)例如在轉(zhuǎn)換驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行4分鐘。代替生物學(xué)靶標(biāo)直接結(jié)合在檢測(cè)表面，還可能使用間接結(jié)合，其中部分第一捕獲部分結(jié)合至檢測(cè)表面。部分一結(jié)合至檢測(cè)表面可以是例如DNA-接頭209的剩余物“標(biāo)簽”切割以從顆粒釋放第一捕獲部分。如果選擇這種方法，該測(cè)定稱為“標(biāo)簽-測(cè)定”。

圖3示出本發(fā)明怎樣實(shí)現(xiàn)最小化信噪比的目的的另一方面。圖3A示出的是終點(diǎn)，即在常規(guī)夾心測(cè)定中檢測(cè)信號(hào)，其中生物學(xué)靶標(biāo)301結(jié)合至與試劑303(這里為磁性顆粒)結(jié)合的捕獲部分302和檢測(cè)表面304。

圖3B示出終點(diǎn)，即在“標(biāo)簽-測(cè)定”中檢測(cè)，其中生物學(xué)靶標(biāo)301結(jié)合至與試劑303(這里為磁性顆粒)結(jié)合的捕獲部分302以及包含另一實(shí)體305標(biāo)簽的第一捕獲部分306。然后標(biāo)簽305結(jié)合檢測(cè)表面304。

圖3C示出終點(diǎn)，即在另一“標(biāo)簽-測(cè)定”中檢測(cè)，其中生物學(xué)靶標(biāo)301結(jié)合至第一捕獲部分308，所述第一捕獲部分308在將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積中起作用，但是在生物學(xué)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量中不起作用。為了這一事件，即檢測(cè)和/或定量步驟，使用與試劑303(這里為磁性顆粒)結(jié)合的第二捕獲部分302以及包含另一實(shí)體305標(biāo)簽的另一捕獲部分306。標(biāo)簽305結(jié)合檢測(cè)表面304。因此，因?yàn)闄z測(cè)表面還包含捕獲部分，該測(cè)定包含4種不同的捕獲部分。

圖3D示出終點(diǎn)，即在“3-表位測(cè)定”中檢測(cè)，如上文圖2的最后一張圖片所示。生物學(xué)靶標(biāo)301結(jié)合至與試劑303(這里為磁性顆粒)結(jié)合的捕獲部分302。生物學(xué)靶標(biāo)還結(jié)合至第一捕獲部分307和檢測(cè)表面304。

標(biāo)簽-測(cè)定和3-表位測(cè)定與常規(guī)夾心測(cè)定相比是有利的，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S減小生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例，導(dǎo)致信噪比的顯著增加。此外，在標(biāo)簽-測(cè)定和3-表位測(cè)定中，可以通過(guò)切割入清理溶液來(lái)純化生物學(xué)靶標(biāo)。此外，在兩種測(cè)定中，當(dāng)使用磁性顆粒時(shí)可以避免樣品基質(zhì)中不可逆的磁性顆粒聚集的問(wèn)題，并且兩種測(cè)定允許使用強(qiáng)結(jié)合劑如生物素以增加測(cè)定反應(yīng)速率。

圖4示出第一捕獲部分的組織的實(shí)例。

圖4A示出粘附至顆粒402的第一捕獲部分401的實(shí)例。在這個(gè)實(shí)例中，捕獲部分401通過(guò)接頭403粘附至顆粒402，所述接頭403包含附著至顆粒402的第一部分404(即第一實(shí)體)以及附著至第一捕獲部分401的第二部分405。接頭403包含第一預(yù)定位置406(即第二實(shí)體)，在這里第一捕獲部分401可以從顆粒402切割，并且還包含第二預(yù)定位置或區(qū)域407(即第三實(shí)體)，其可以結(jié)合至檢測(cè)表面(未顯示)。因此在進(jìn)行標(biāo)簽-測(cè)定時(shí)可以采用粘附至顆粒402的第一捕獲部分401的這種組織。

圖4B示出粘附至顆粒402的第一捕獲部分401的實(shí)例。在這個(gè)實(shí)例中，捕獲部分401通過(guò)接頭403粘附至顆粒402，所述接頭403包含附著至顆粒402的第一部分404(即第一實(shí)體)以及附著至第一捕獲部分401的第二部分405(即第二實(shí)體)。接頭403包含第一預(yù)定位置406，在這里可以從顆粒402切割第一捕獲部分401。與圖4A的結(jié)構(gòu)相比，這里不需要可以結(jié)合至檢測(cè)部分的第二預(yù)定位置或區(qū)域。因此在進(jìn)行3-表位測(cè)定時(shí)可以采用粘附至顆粒402的第一捕獲部分401的這種組織。

圖4A和4B可以用于DNAse洗脫與3-表位測(cè)定重新捕獲。優(yōu)選地，圖4A示出的設(shè)計(jì)可以用于如先前定義的標(biāo)簽測(cè)定；圖4B可以優(yōu)選用于重新捕獲，僅利用DNA的互補(bǔ)單鏈。

圖5示出合適的接頭的模塊設(shè)計(jì)的一些實(shí)例。

圖5A示出包含可以切割為兩個(gè)部分的接頭502的捕獲部分501的圖示實(shí)例。

圖5B示出包含可以切割為兩個(gè)部分的接頭502和強(qiáng)結(jié)合劑503(在這種情況下為生物素)的捕獲部分501的圖示實(shí)例。

圖5C示出包含可以切割為兩個(gè)部分的接頭502、強(qiáng)結(jié)合劑503(這里為生物素)和間隔504的捕獲部分501的圖示實(shí)例。使用生物素具有這樣的優(yōu)勢(shì)，任何顆粒均可以粘附至第一捕獲部分，只要其包含鏈霉親和素或抗生物素蛋白。

圖6示出上文圖3所述的3-表位親和力測(cè)定的概念驗(yàn)證。采用的生物學(xué)靶標(biāo)為25pM的PSA，樣品體積為5μl，第一捕獲部分為PSA的單克隆抗體PSA10，并且顆粒為磁性顆粒。磁性顆粒與PSA10通過(guò)DNA接頭互相粘附。所述接頭由48個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA隨后10個(gè)堿基的單鏈DNA組成。這種DNA接頭為這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以適合兩種類型的切割：用DNAse(其消化雙鏈和單鏈DNA)非特異性切割和用EcoRI(其消化雙鏈DNA的特定序列)特異性洗脫。其優(yōu)勢(shì)在于允許顆粒的更高柔性和足夠的間隔以使得酶能夠接近。圖6中的數(shù)據(jù)是用DNAse(750單位，來(lái)自Qiagen)產(chǎn)生的。在這個(gè)測(cè)定中，采用結(jié)合第二捕獲部分的額外的步驟，所述第二捕獲部分具有與其結(jié)合的試劑。第二捕獲部分為PSA的另一單克隆抗體PSA36，并且試劑為磁珠。在檢測(cè)表面(這里為Magnotech裝置的FTIR生物傳感器表面)上重新捕獲PSA通過(guò)PSA結(jié)合至另一單克隆PSA抗體即PSA66來(lái)完成。所有抗體均來(lái)自Fujirebio。生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)(緩沖液中的25pM的PSA)的比例的減小在1:1、1:5和1:10的比例下測(cè)量。可以清楚地看到，隨著體積比例增加，檢測(cè)信號(hào)增加。因此，生物學(xué)樣品體積比生物學(xué)靶標(biāo)的比例的減小導(dǎo)致檢測(cè)之前生物學(xué)靶標(biāo)的濃縮，因此導(dǎo)致較低的信噪比以及親和力測(cè)定的更大靈敏度。

圖7A示出建立如上文所述的用于心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)的3-表位親和力測(cè)定的初步實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)是用來(lái)確定心肌缺血發(fā)病率的心臟標(biāo)志物。將生物學(xué)靶標(biāo)cTnI與第一捕獲部分60nM的MAb2(來(lái)自BiosPacific)預(yù)溫育10分鐘，然后將溶液注射入MagnoTech測(cè)定，并且生物學(xué)靶標(biāo)cTnI結(jié)合至與磁珠結(jié)合的第二捕獲部分a-cTnI 560(來(lái)自Hytest)以及檢測(cè)表面，這里為Magnotech裝置的FTIR生物傳感器表面。cTnI結(jié)合至檢測(cè)表面通過(guò)多克隆抗體4T21/2(來(lái)自Hytest)介導(dǎo)。數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)第一捕獲部分和與磁珠結(jié)合的第二捕獲部分的結(jié)合不抑制cTnI結(jié)合至檢測(cè)表面或用Magnotech裝置檢測(cè)。

圖7B示出來(lái)自與圖7A中相似的建立PSA的3-表位親和力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

圖8圖示熱切割的實(shí)例，其中從顆粒切割第一捕獲部分的步驟被從第一捕獲部分切割生物學(xué)靶標(biāo)代替。示出的是將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為小于生物學(xué)樣品體積的洗脫體積之后的測(cè)定步驟。通過(guò)熱切割從粘附至顆粒(這里為磁性顆粒803)的第一捕獲部分802切割生物學(xué)靶標(biāo)801，并且利用磁力去除粘附至磁性顆粒803的第一捕獲部分802。隨后以競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定形式檢測(cè)和/或定量生物學(xué)靶標(biāo)801。通過(guò)第二捕獲部分807重新捕獲生物學(xué)靶標(biāo)801，所述第二捕獲部分807具有與其結(jié)合的試劑808，這里為磁珠。檢測(cè)表面805包含第三捕獲部分806，其為靶標(biāo)類似物。捕獲部分807上靶標(biāo)801的存在減少試劑808結(jié)合至具有靶標(biāo)類似物806的檢測(cè)表面805。檢測(cè)表面805上試劑808的存在減少或者抑制試劑808結(jié)合至檢測(cè)表面805可以例如通過(guò)Magnotech裝置上的FTIR來(lái)檢測(cè)。

圖9更詳細(xì)地示出3-表位測(cè)定中的第一捕獲部分不干擾檢測(cè)。這可以從圖6和圖7扣除。具體地，比較夾心測(cè)定和3-表位測(cè)定以確定第一捕獲部分如第三抗體對(duì)檢測(cè)的影響。兩條劑量反應(yīng)曲線比較用PSA-10涂覆的珠和PSA-66涂覆的表面產(chǎn)生的夾心測(cè)定與用PSA-66涂覆的暗盒上的PSA-36珠和額外的PSA-10獲得的3-表位測(cè)定。因?yàn)閮煞N測(cè)定均具有相似的劑量反應(yīng)曲線和1pM左右的靈敏度，所以第一捕獲部分的存在不阻礙檢測(cè)。

圖10示出捕獲時(shí)間常數(shù)的確定。一般來(lái)說(shuō)，可以研究本發(fā)明的方法的步驟b)期間發(fā)生的第一捕獲反應(yīng)作為時(shí)間和顆粒濃度的函數(shù)?？梢哉{(diào)整顆粒濃度以在選擇的時(shí)間中高效捕獲生物學(xué)靶標(biāo)。當(dāng)顆粒濃度增加時(shí)，捕獲會(huì)快得多。對(duì)于現(xiàn)實(shí)分析時(shí)間，在這個(gè)實(shí)例中富集過(guò)程設(shè)計(jì)為不超過(guò)30分鐘，而第一捕獲部分的量?jī)?yōu)化為25μg捕獲部分/mg顆粒。在該前景中，捕獲溫育時(shí)間固定在15分鐘或900s。然而，如圖10所示，在溶液中對(duì)于0.2mg/mL顆粒在5pM下需要30分鐘以達(dá)到平衡。捕獲過(guò)程不是線性過(guò)程，但是這可以模擬。生物學(xué)靶標(biāo)與第一捕獲部分之間的相互作用可以模擬為一階速率表達(dá)式和之后的重排；捕獲效率由如上文所示的方程I給出。對(duì)以下條件研究捕獲過(guò)程：將5μL的2mg/mL的顆粒與45μL的PSA樣品混合并溫育不同時(shí)間直至平衡。圖10中的結(jié)果使得能夠如方程II所定義地估計(jì)τ，實(shí)驗(yàn)上約720s。τ取決于第一捕獲部分的濃度，因此取決于顆粒濃度。在步驟b)中，使用不同濃度的顆粒。結(jié)果對(duì)于各濃度的顆粒，τ改變。然后如圖10b所示，可以確定各顆粒濃度的捕獲效率。

圖11示出在30min的總測(cè)定時(shí)間中對(duì)各種體積濃縮因素的富集測(cè)定。將光信號(hào)相對(duì)于以pM計(jì)的PSA的終濃度作圖。不同體積比例用于富集，生物學(xué)樣品體積為5-400μL，而洗脫體積固定在5μL。

在這個(gè)實(shí)例中，將捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)濃縮為洗脫體積用酶促洗脫來(lái)進(jìn)行，以便保持該過(guò)程獨(dú)立于生物學(xué)靶標(biāo)如所關(guān)注的蛋白。在這個(gè)實(shí)例中酶用來(lái)切割顆粒與抗體之間的接頭。該方法進(jìn)行30分鐘，包括本發(fā)明的方法的步驟b的15分鐘，本發(fā)明的步驟c和d的10分鐘，步驟e)的5分鐘和30s。如圖11所示，對(duì)0-50pM范圍的PSA獲得與參考劑量反應(yīng)曲線相比富集的信號(hào)。富集劑量反應(yīng)曲線的區(qū)別在于作為PSA的起始體積的生物學(xué)樣品體積(V_S)與洗脫體積(V_el)之間的比例。生物學(xué)樣品體積為5-400μL。將生物學(xué)樣品與0.01mg的顆?；旌?，將其濃縮至5μL。將洗脫液在生物傳感器上檢測(cè)。富集因子(ξ)通過(guò)計(jì)算富集測(cè)定獲得的劑量反應(yīng)曲線的斜率比參考的劑量反應(yīng)曲線的斜率的比例獲得自圖11。圖11顯示當(dāng)體積比例超過(guò)因子10時(shí)，樣品有效濃縮。靈敏度的增加與體積比例的增加一致。

圖12示出步驟c)的劑量反應(yīng)曲線，即生物學(xué)靶標(biāo)濃縮的劑量反應(yīng)曲線。在這個(gè)實(shí)例中，對(duì)于30分鐘的總測(cè)定時(shí)間，將肝素血漿池與緩沖液中的劑量反應(yīng)曲線比較。在這個(gè)實(shí)例中，生物學(xué)靶標(biāo)的濃縮聯(lián)合酶促洗脫在生物基質(zhì)中具有有效清理血漿的潛力，因?yàn)榉翘禺愋缘鞍撞豢梢杂妹赶疵?。圖12證實(shí)富集在摻入靶標(biāo)的肝素血漿池中是可行的。將血漿首先用抗PSA顆粒耗盡以確保該池不含PSA。將樣品首先耗盡，然后摻入準(zhǔn)確濃度的PSA。為了避免稀釋，將顆粒直接重懸于血漿(V_P＝0)中，并且顆粒與血漿的接觸很大。如圖12所示，血漿中獲得的斜率在與富集x 80的緩沖液中獲得的斜率相同的范圍中。兩種基質(zhì)令人驚訝地表現(xiàn)出相似的靈敏度。

對(duì)于前列腺癌的復(fù)發(fā)這是有意義的，靶向的PSA的范圍實(shí)際上低于健康供體，一般為10-20pM。在緩沖液中，圖12的x80的測(cè)定表現(xiàn)出10-20pM的飽和度。PSA測(cè)試靶向0.01-100ng/ml的范圍，具有4-10ng/mL的癌癥診斷的灰色地帶。然而，前列腺癌中的復(fù)發(fā)病例顯示需要高度靈敏的測(cè)試。PSA的情況是有趣的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)濃縮捕獲的生物學(xué)靶標(biāo)，據(jù)證實(shí)靈敏度可以變換至檢測(cè)活組織檢查后癌癥的復(fù)發(fā)。因此，對(duì)于相同的檢測(cè)平臺(tái)，測(cè)定可以富集并且可適用于兩種應(yīng)用：一般監(jiān)測(cè)和高度靈敏的測(cè)定。

實(shí)施例

材料

除非另有說(shuō)明，所有緩沖材料均由Sigma Aldrich Corporation提供。用羧酸基團(tuán)官能化的超順磁性顆粒(MasterBeads 500nm直徑)購(gòu)自Ademtech。篩選許多識(shí)別PSA上的各種表位的抗體對(duì)，并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)利用光磁生物傳感器技術(shù)檢測(cè)非常有效。在這個(gè)工作中，我們集中在來(lái)自由作為捕獲抗體的單克隆抗體PSA-10、作為第二重新捕獲抗體的PSA-36和作為固定在傳感器表面上的捕獲抗體的PSA-66組成的對(duì)的結(jié)果?？贵w由Fujirebio提供。校準(zhǔn)品通過(guò)在來(lái)自20個(gè)看起來(lái)健康的供體的純?nèi)烁嗡匮獫{池或PBS中的5％BSA(用于緩沖液實(shí)驗(yàn))中稀釋來(lái)制備自人PSA復(fù)合物(Fujirebio PSA試劑盒)。DNase購(gòu)自Qiagen，并且在無(wú)菌不含RNAse的水中稀釋。NEB EcoRI的x10濃縮緩沖液由NEBiolabs提供，用作洗脫緩沖液。在室溫與振蕩下于1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC,Sigma Aldrich)化學(xué)將抗體綴合1小時(shí)。用TSK-Gel SuperSW 3000柱(Tosoh Biosciences，300x 4.6mm，4μm顆粒，25nm平均孔徑)純化綴合物，以0.25mL的60mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.8每分鐘的流速在環(huán)境溫度下運(yùn)行，在260和280nm下監(jiān)測(cè)。捕獲珠制備如下：將用500nM DNA偶聯(lián)的PSA-10IgG偶聯(lián)的2mg/mL的1:1鏈霉親和素珠的混合物溫育20分鐘。然后，將珠洗滌并以2mg/mL重懸于PBS中的5％BSA中。將50μL 2mg/ml的捕獲珠與PSA樣品混合15分鐘，然后將珠通過(guò)磁力洗滌并重懸于1:1DNase和NEB EcoRI x1中。10分鐘洗滌之后，將珠通過(guò)磁力去除。將3.5μL洗脫物與3.5μL 2mg/mL的PSA-36涂覆的磁珠混合并直接注射入一次性暗盒。

實(shí)施例1

除了圖6和圖7所示的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的親和力測(cè)定還利用熱切割來(lái)進(jìn)行。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，30ng/mL的阿片劑(來(lái)自Cerillian的DB1327)用作生物學(xué)靶標(biāo)，第一捕獲部分為來(lái)自NatuTec的嗎啡-3抗體，并且顆粒為磁性顆粒。熱切割步驟在50℃-95℃的溫度范圍中測(cè)試，80℃給出最佳結(jié)果。在檢測(cè)表面上重新捕獲生物學(xué)靶標(biāo)通過(guò)在用BSA和阿片劑涂覆的FTIR生物傳感器表面上捕獲阿片劑來(lái)進(jìn)行，并且檢測(cè)在MagnoTech裝置中利用第二捕獲部分進(jìn)行，其再次為與磁性顆粒結(jié)合的來(lái)自NatuTec的嗎啡-3抗體。清楚地證實(shí)熱切割從第一捕獲部分釋放靶標(biāo)。

本發(fā)明描述的裝置、方法和系統(tǒng)可以用于快速、穩(wěn)健和容易地使用醫(yī)療點(diǎn)生物傳感器。反應(yīng)室可以為一次性物品，與包含一種或多種檢測(cè)方法的緊湊型讀數(shù)器一起使用。而且，本發(fā)明的裝置、方法和系統(tǒng)可以用于自動(dòng)化高通量測(cè)試。在這種情況下，反應(yīng)室為例如裝入自動(dòng)化儀器的孔板或小杯。

雖然本發(fā)明已在附圖和前文的描述中詳細(xì)說(shuō)明和描述，但是這樣的說(shuō)明和描述應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是說(shuō)明性或示例性而不是限制性的；本發(fā)明并不限于公開(kāi)的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)施所要求保護(hù)的發(fā)明中從附圖、公開(kāi)和所附權(quán)利要求的研究可以理解和實(shí)施公開(kāi)的實(shí)施方案的其他變化。在權(quán)利要求中，詞語(yǔ)“包含”不排除其他元件或步驟，并且不定冠詞“一個(gè)(a)”或“一個(gè)(an)”不排除復(fù)數(shù)。某些測(cè)量在互相不同的從屬權(quán)利要求中列舉的事實(shí)不表示這些測(cè)量的組合不可以有利地使用。權(quán)利要求中的任何參考符號(hào)不應(yīng)當(dāng)理解為限制范圍。

實(shí)施例2

捕獲效率通過(guò)如上文圖10中解釋的捕獲過(guò)程擬合來(lái)確定。結(jié)果如表1所總結(jié)的，洗脫效率可以推導(dǎo)自方程II。圖11用來(lái)確定表1所述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后富集效率推導(dǎo)自來(lái)自圖11的劑量反應(yīng)曲線的斜率，并且導(dǎo)出洗脫效率。

表1：對(duì)應(yīng)于圖11的富集測(cè)定表。富集效率為富集劑量反應(yīng)曲線的斜率比參考的劑量反應(yīng)曲線的斜率的比值。捕獲效率計(jì)算自方程I。從體積濃縮、富集效率和捕獲效率確定洗脫效率。

這清楚地表明取決于方法所應(yīng)用的限制，富集效率依賴于時(shí)間或樣品體積或洗脫效率。對(duì)于短捕獲時(shí)間(t<<τ)，富集效率與捕獲時(shí)間、洗脫效率和洗脫體積直接結(jié)合。對(duì)于大于或等于τ的捕獲時(shí)間，富集效率與樣品體積和洗脫效率直接結(jié)合。如表1所示，對(duì)于900s，富集效率取決于樣品體積和洗脫效率。捕獲效率與樣品體積成比例改變。結(jié)果對(duì)于約30％的各富集因子，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)出的洗脫效率可以在相同范圍中。對(duì)于這套數(shù)據(jù)，顆粒的量保持不變。因此，認(rèn)為洗脫效率與生物學(xué)樣品體積中顆粒的量直接結(jié)合。這通過(guò)兩個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：洗脫在凝膠上進(jìn)行，并且洗脫還在較小量的顆粒上進(jìn)行。在凝膠上沒(méi)有珠的第一嘗試中，在10分鐘內(nèi)洗脫相同比例的DNA接頭，為98％(±5％)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，少10倍的顆粒用于富集?？紤]到捕獲效率的變化(從100％至92％)，在那種情況下發(fā)現(xiàn)洗脫效率為70％。結(jié)果，在洗脫期間加入越多顆粒，洗脫效率越低。這導(dǎo)致認(rèn)為兩種現(xiàn)象在洗脫期間競(jìng)爭(zhēng)：化學(xué)反應(yīng)和擴(kuò)散?？傊?，該過(guò)程是穩(wěn)定和可重復(fù)的。然而，如果改善擴(kuò)散因子，可以改善富集測(cè)定。

總結(jié)附圖和實(shí)實(shí)施例，證實(shí)本發(fā)明的方法可以用來(lái)濃縮生物學(xué)靶標(biāo)例如以用于免疫測(cè)定檢測(cè)。與樣品制備中的傳統(tǒng)方法相比，這種測(cè)定表現(xiàn)出相似或更好的回收率以及更有利的對(duì)免疫測(cè)定檢測(cè)的適應(yīng)性。測(cè)定斜率表現(xiàn)出18倍增加，并且具有80倍的體積濃縮的優(yōu)化參數(shù)。所述方法可以在檢測(cè)之前30分鐘完成，并且注意到仍然可以有15倍提高。該過(guò)程在全血漿中也是有效的。良好的回收率與富集以達(dá)到高靈敏度的潛力的這種組合使得這種方法成為小型化形式的蛋白分析的非常有希望的方法，包括純化、富集和檢測(cè)。