專利名稱：C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)用試劑盒，尤其涉及到一種用于測(cè)定人血清中C-反應(yīng)蛋白 (CRP)含量的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒。
背景技術(shù)：
近年研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病患者體內(nèi)常常伴有持續(xù)的低水平的炎癥，CRP為急性期 蛋白的一種，在機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí)，CRP在數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速升高，CRP含量愈多，表明病變活動(dòng)度 愈高，炎癥恢復(fù)過程中，若CRP呈陽性，預(yù)示仍有突然出現(xiàn)臨床癥狀的可能性，病變消退時(shí) 又迅速降到正常水平，臨床實(shí)驗(yàn)表明，CRP作為一種炎癥標(biāo)記物和心血管疾患的相關(guān)性要遠(yuǎn) 遠(yuǎn)高于其他已知的項(xiàng)目，因此對(duì)低水平的CRP的檢測(cè)已經(jīng)發(fā)展成為衡量患者心血管疾病危 險(xiǎn)性的重要指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種采用膠乳微粒增強(qiáng)技術(shù)，改造傳統(tǒng)的免疫透射法試劑的C-反 應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，適用于各種類型的半自動(dòng)、全自動(dòng)臨床生化分析儀，用于測(cè) 定人血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)含量，具有檢測(cè)靈敏度高、穩(wěn)定性高等優(yōu)異性能。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下C_反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，主要流程包 括CRP抗體檢驗(yàn)，純化蛋白，蛋白修飾，膠乳的合成，包被與封閉，增濁劑配置，分裝；首先 采用抗體制備技術(shù)，篩選出高特異高親和力的CRP抗體，然后采用膠乳微粒增強(qiáng)技術(shù)，通過 特殊的化學(xué)交聯(lián)劑把該抗體連接到自己合成的聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，制備成體積擴(kuò)大 了近百倍具有免疫活性的免疫膠乳，從而提高反應(yīng)的靈敏度及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。本發(fā)明試制的關(guān)鍵步驟如下1、純化蛋白1. 1將血清用0.2M醋酸溶液1 1稀釋；緩慢攪拌下滴加血清和醋酸總體積 X0. 025ml的辛酸，室溫下攪拌30min ；緩慢攪拌下滴加上清和PBS總體積X0. 818ml的飽和 硫酸銨，室溫?cái)嚢?0min ； IOOOOrpm離心lOmin，棄上清，以沉淀形式保存于_20°C。1. 2在進(jìn)行層析純化之前，先將上述沉淀物取出，用生理鹽水復(fù)溶，測(cè)定蛋白含量， 以280nm波長(zhǎng)比色，讀出OD值，除以IgG的消光系數(shù)1. 4后得到蛋白含量，單位為mg/ml。1.3將蛋白用生理鹽水稀釋到10mg/ml左右后方能上柱；打開用于層析的 sephacryls-300柱，把上面的生理鹽水吸凈后，將蛋白溶液沿壁輕輕加入；待蛋白溶液全 部進(jìn)入柱床后，用生理鹽水洗凈壁上殘留，然后輕輕加入生理鹽水至高于柱床表面3cm處， 蓋上層析柱上蓋，擰緊并打開進(jìn)水管道，用分部收集器收集；將收集到的蛋白溶液在紫外分 光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)讀取OD值。1. 4整個(gè)蛋白分離過程呈現(xiàn)第一個(gè)為小峰，第二個(gè)為大峰(主峰)，主峰高度與二 峰之間的谷底高度OD值的比值彡2為正常；合并主峰(IgG峰)≥2的部分，混勻，用生理 鹽水做適當(dāng)倍數(shù)稀釋，測(cè)定計(jì)算蛋白含量，計(jì)算公式為0D值*稀釋倍數(shù)/1. 4，計(jì)算結(jié)果即為該溶液的IgG濃度。2、蛋白修飾根據(jù)蛋白含量20mg，用分析天平稱取EDC66mg，將EDC加入到待修飾 的蛋白溶液中。3、膠乳的合成水浴箱內(nèi)加入純化水1500ml，加入過硫酸鉀1. 65g，SDS16ml，攪拌 器內(nèi)充氮，攪拌溶解不少于6小時(shí)，再加入150ml苯乙烯，用脫脂棉過濾。4、包被、封閉4. 1量取膠乳400ml (16膠乳)，置高速離心機(jī)上離心:12000rpm離心，35分鐘；4. 2棄上清，留沉淀，沉淀物用生理鹽水分散至800ml ；4. 3將已修飾的蛋白溶液加入到膠乳溶液中混勻，置磁力攪拌器攪拌；4. 4將已包被好的膠乳，置告高速離心機(jī)，12000rpm離心，25分鐘；4. 5棄上清，留沉淀，沉淀物用1 %牛血清白蛋白2000ml，封閉，重復(fù)1次，2 8 °C保存待用，用PB4000ml清洗，重復(fù)4次，12000rpm離心，取沉淀用膠乳稀釋液稀釋到 2000ml ；4. 6調(diào)整靈敏度，加膠乳稀釋液，稀釋成膠乳工作液；4. 7置冷庫2-8 °C保存。5、增濁劑配置5. 1配置0. 02M的磷酸緩沖溶液；5. 2在IOOOml磷酸緩沖溶液中加入Iml吐溫-20。6、分裝用灌裝恒流泵按包裝規(guī)格分裝。本發(fā)明所采用的檢測(cè)技術(shù)原理是將抗體定向錨定在膠乳表面，血清中的CRP與 試劑中相應(yīng)抗體在液相中結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，產(chǎn)生濁度變化，膠乳試劑可以特異的增 大該濁度變化，增大試劑的靈敏度，該濁度變化的高低與樣本中CRP的含量成正比，測(cè)定該 濁度，與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，即能得出樣本血清中CRP的含量。本發(fā)明由于采用了以上獨(dú)特的技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下的有益效果1、采用了膠乳增強(qiáng)技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)新，解決了傳統(tǒng)的免疫透射比濁法不夠靈敏和精 確的問題，靈敏度更高；2、進(jìn)行了工藝方法的創(chuàng)新，生產(chǎn)制備工藝更加簡(jiǎn)單，解決了傳統(tǒng)方法在分離抗體 的過程中無法完全去除蛋白酶的問題，使試劑的穩(wěn)定性大大提高；3、檢測(cè)范圍更寬，檢測(cè)的線性范圍達(dá)到0. 1 30mg/L, r彡0. 99。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明參照附圖1，C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，由PBS緩沖液、PEG、抗體致敏膠 乳、穩(wěn)定劑、表面活性劑組成，其制備主要流程包括CRP抗體檢驗(yàn)，純化蛋白，蛋白修飾，膠 乳的合成，包被與封閉，增濁劑配置，分裝；首先采用抗體制備技術(shù)，篩選出高特異高親和力 的CRP抗體，然后采用膠乳微粒增強(qiáng)技術(shù)，通過特殊的化學(xué)交聯(lián)劑把該抗體連接到自己合
4成的聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，制備成體積擴(kuò)大了近百倍具有免疫活性的免疫膠乳，從而 提高反應(yīng)的靈敏度及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。本發(fā)明試制的主要步驟如下1、純化蛋白1. 1將血清用0.2M醋酸溶液1 1稀釋；緩慢攪拌下滴加血清和醋酸總體積 X0. 025ml的辛酸，室溫下攪拌30min ；緩慢攪拌下滴加上清和PBS總體積X0. 818ml的飽和 硫酸銨，室溫?cái)嚢?0min ； IOOOOrpm離心lOmin，棄上清，以沉淀形式保存于_20°C。1. 2在進(jìn)行層析純化之前，先將上述沉淀物取出，用生理鹽水復(fù)溶，測(cè)定蛋白含量， 以280nm波長(zhǎng)比色，讀出OD值，除以IgG的消光系數(shù)1. 4后得到蛋白含量，單位為mg/ml。1.3將蛋白用生理鹽水稀釋到10mg/ml左右后方能上柱；打開用于層析的 sephacryls-300柱，把上面的生理鹽水吸凈后，將蛋白溶液沿壁輕輕加入；待蛋白溶液全 部進(jìn)入柱床后，用生理鹽水洗凈壁上殘留，然后輕輕加入生理鹽水至高于柱床表面3cm處， 蓋上層析柱上蓋，擰緊并打開進(jìn)水管道，用分部收集器收集；將收集到的蛋白溶液在紫外分 光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)讀取OD值。1. 4整個(gè)蛋白分離過程呈現(xiàn)第一個(gè)為小峰，第二個(gè)為大峰(主峰)，主峰高度與二 峰之間的谷底高度OD值的比值彡2為正常；合并主峰(IgG峰)彡2的部分，混勻，用生理 鹽水做適當(dāng)倍數(shù)稀釋，測(cè)定計(jì)算蛋白含量，計(jì)算公式為0D值*稀釋倍數(shù)/1. 4，計(jì)算結(jié)果即 為該溶液的IgG濃度。2、蛋白修飾根據(jù)蛋白含量20mg，用分析天平稱取EDC66mg ；將EDC加入到待修飾 的蛋白溶液中。3、膠乳的合成水浴箱內(nèi)加入純化水1500ml，加入過硫酸鉀1. 65g，SDS 16ml，攪 拌器內(nèi)充氮，攪拌溶解不少于6小時(shí)，再加入150ml苯乙烯，用脫脂棉過濾。4、包被、封閉4. 1量取膠乳400ml (16膠乳)，置高速離心機(jī)上離心12000rpm離心，35分鐘；4. 2棄上清，留沉淀，沉淀物用生理鹽水分散至800ml ；4. 3將已修飾的蛋白溶液加入到膠乳溶液中混勻，置磁力攪拌器攪拌；4. 4將已包被好的膠乳，置告高速離心機(jī)，12000rpm離心，25分鐘；4. 5棄上清，留沉淀，沉淀物用牛血清白蛋白2000ml，封閉，重復(fù)1次。2 8°C保存待用，用PB4000ml清洗，重復(fù)4次，12000rpm離心，取沉淀用膠乳稀釋液稀釋到 2000ml ；4. 6調(diào)整靈敏度，加膠乳稀釋液，稀釋成膠乳工作液；4. 7置冷庫2-8 °C保存。5、增濁劑配置5. 1配置0. 02M的磷酸緩沖溶液；5. 2在IOOOml磷酸緩沖溶液中加入Iml吐溫-20。6、分裝用灌裝恒流泵按包裝規(guī)格分裝。本發(fā)明試劑盒使用日立7060生化分析儀檢測(cè)的性能評(píng)估分別見表1 (曲線及質(zhì) 控)、表2(線性)、表3(重復(fù)性)
表 1 表 3下面就本發(fā)明試劑盒與日本協(xié)和同類試劑盒通過羅式COBUS全自動(dòng)生化分析儀
使用情況作性能比較，比較參數(shù)見表4 由上表可知本發(fā)明的試劑盒4與進(jìn)口試劑相關(guān)性良好，且非常穩(wěn)定。本試劑盒的計(jì)算方法為多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)法，以第一管吸光度值作為試劑空白值，每 一樣本的最終ABS值計(jì)算公式為吸光度值-試劑空白值；要坐標(biāo)紙上繪制“濃度-吸光度” 標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣本測(cè)得的最終ABS值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出最終濃度值。
本試劑盒的正常參考值正常人群< 2. lmg/L，危險(xiǎn)人群> 3mg/L，2. 1 3mg/L為 臨界水平。本發(fā)明制備的試劑盒的主要技術(shù)指標(biāo)線性范圍0. 1 30mg/L，r ^ 0. 99 ；準(zhǔn)確 度X士2SD;精密度批內(nèi)精密度CV彡5%批間相對(duì)極差彡10%。本發(fā)明制備的試劑盒的儲(chǔ)存方式2 8°C試劑避光儲(chǔ)存，夏季運(yùn)輸注意冷藏，不 得冷凍。
權(quán)利要求
C 反應(yīng)蛋白(Hs CRP)測(cè)定試劑盒，由PBS緩沖液、PEG、抗體致敏膠乳、穩(wěn)定劑、表面活性劑組成，其特征在于采用抗體制備技術(shù)，篩選出高特異高親和力的CRP抗體，然后采用膠乳微粒增強(qiáng)技術(shù)，通過特殊的化學(xué)交聯(lián)劑把該抗體連接到自己合成的聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，制備成體積擴(kuò)大了近百倍具有免疫活性的免疫膠乳，其制備的主要步驟包括純化蛋白，蛋白修飾，膠乳的合成，包被、封閉，增濁劑配置，分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的純 化蛋白，其步驟為將血清用0.2M醋酸溶液1 1稀釋，緩慢攪拌下滴加血清和醋酸總體 積X0. 025ml的辛酸，室溫下攪拌30min，緩慢攪拌下滴加上清和PBS總體積X0. 818ml的飽 和硫酸銨，室溫?cái)嚢?0min，IOOOOrpm離心lOmin，棄上清，以沉淀形式保存于_20°C ；將沉 淀物用生理鹽水復(fù)溶，測(cè)定蛋白含量，以280nm波長(zhǎng)比色，讀出OD值，除以IgG的消光系數(shù) 1.4后得到蛋白含量；將蛋白用生理鹽水稀釋到10mg/ml左右后方能上柱，打開用于層析的 sephacryls-300柱，把上面的生理鹽水吸凈后，將蛋白溶液沿壁輕輕加入，待蛋白溶液全 部進(jìn)入柱床后，用生理鹽水洗凈壁上殘留，然后輕輕加入生理鹽水至高于柱床表面3cm處， 蓋上層析柱上蓋，擰緊并打開進(jìn)水管道，用分部收集器收集，將收集到的蛋白溶液在紫外分 光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)讀取OD值，整個(gè)蛋白分離過程呈現(xiàn)第一個(gè)為小峰，第二個(gè) 為大峰(主峰)，主峰高度與二峰之間的谷底高度OD值的比值>2為正常，合并主峰(IgG 峰)>2的部分，混勻，用生理鹽水做適當(dāng)倍數(shù)稀釋，測(cè)定計(jì)算蛋白含量，計(jì)算公式為0D值 *稀釋倍數(shù)Λ. 4，計(jì)算結(jié)果即為該溶液的IgG濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的蛋 白修飾，其步驟為根據(jù)蛋白含量20mg，用分析天平稱取EDC66mg，將EDC加入到待修飾的蛋 白溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的膠 乳的合成，其步驟為水浴箱內(nèi)加入純化水1500ml，加入過硫酸鉀1.65g，SDS16ml，攪拌器 內(nèi)充氮，攪拌溶解不少于6小時(shí)，再加入150ml苯乙烯，用脫脂棉過濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的增 濁劑配置，其步驟為配置0. 02M的磷酸緩沖溶液，在IOOOml磷酸緩沖溶液中加入Iml吐 溫 _20o
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的包 被、封閉，其步驟為量取膠乳400ml (16膠乳)，置高速離心機(jī)上離心12000rpm離心，35分 鐘；棄上清，留沉淀，沉淀物用生理鹽水分散至800ml ；將已修飾的蛋白溶液加入到膠乳溶 液中混勻，置磁力攪拌器攪拌；將已包被好的膠乳，置告高速離心機(jī)，12000rpm離心，25分 鐘；棄上清，留沉淀，沉淀物用牛血清白蛋白2000ml，封閉，重復(fù)1次，2 8°C保存待用， 用PB4000ml清洗，重復(fù)4次，12000rpm離心，取沉淀用膠乳稀釋液稀釋到2000ml ；調(diào)整靈敏 度，加膠乳稀釋液，稀釋成膠乳工作液；置冷庫2-8°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種C-反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)測(cè)定試劑盒，屬于試劑盒及其檢測(cè)方法領(lǐng)域，由PBS緩沖液、PEG、抗體致敏膠乳、穩(wěn)定劑、表面活性劑組成，首先采用抗體制備技術(shù)，篩選出高特異高親和力的CRP抗體，然后采用膠乳微粒增強(qiáng)技術(shù)，通過特殊的化學(xué)交聯(lián)劑把該抗體連接到自己合成的聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，制備成體積擴(kuò)大了近百倍具有免疫活性的免疫膠乳，本發(fā)明試劑盒能快速有效穩(wěn)定的檢測(cè)出人血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)的含量，及時(shí)發(fā)現(xiàn)人體中的心血管疾病和炎癥。
文檔編號(hào)G01N33/542GK101893625SQ200910051498
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者吳建華 申請(qǐng)人:上海捷門生物技術(shù)合作公司