本發(fā)明涉及一種用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用、光纖探頭及其制備方法，屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

超氧陰離子屬于氧自由基一種，生物體內(nèi)的氧自由基有其特定的生理功能，也有一定致病作用。很多疾病的病理生理過程均有超氧陰離子介導(dǎo)。腎臟是一個(gè)高血流量器官，在腎臟攝氧中只有25％氧為腎臟組織細(xì)胞生存所需要，其余氧主要供腎小管重吸收用，腎小管重吸收越多，耗氧約多。正常情況下，腎臟的抗氧化能力與不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡。腎臟疾病患者機(jī)體清除自由基能力降低，如果氧自由基產(chǎn)生異常增多，導(dǎo)致腎臟組織損傷，腎臟細(xì)胞就會(huì)缺血缺氧。

超氧陰離子能引起蛋氨酸、組氨酸、半胱氨酸等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變。帶單電子的氧自由基和生物膜上的多不飽和脂肪酸作用，使得多不飽和脂肪酸與蛋白質(zhì)之間比例失衡,細(xì)胞膜的液體性、通透性及流動(dòng)性發(fā)生改變，因而造成多種細(xì)胞膜體系的損傷。溶酶體膜通透性升高，會(huì)導(dǎo)致溶酶體酶的外漏、加速細(xì)胞自身的溶解；線粒體膜能損傷腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮和通透性與流動(dòng)性發(fā)生改變可造成氧化磷酸化障礙。腎小球毛細(xì)血管基底膜和腎小管上皮細(xì)胞膜受損可致腎小球?yàn)V過性增大，出現(xiàn)蛋白尿、血尿；腎小管重吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)及分泌功能障礙，出現(xiàn)糖尿、多尿、尿崩、低鉀低鈉及代謝性酸中毒等。

希夫堿是指含有亞胺或甲亞胺特性基團(tuán)(-rc＝n-)的一類化合物，其雜化軌道上的n原子具有孤對(duì)電子，易與有空軌道的金屬離子配位，故其是一類性能優(yōu)良的配體。甲亞胺特性基團(tuán)(-rc＝n-)在超氧陰離子作用下，會(huì)發(fā)生氧化斷鍵，使化合物結(jié)構(gòu)改變，造成熒光性能的變化。因此，使用此類化合物對(duì)超氧陰離子進(jìn)行有效、快速、簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)，對(duì)于人類生活和自然環(huán)境都有著極其重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，該探針具有針對(duì)超氧陰離子的熒光敏感性，可與超氧陰離子作用，并導(dǎo)致熒光淬滅，通過探測(cè)熒光即可快速識(shí)別超氧陰離子，檢測(cè)靈敏度高。

本發(fā)明還提供了一種上述用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針的制備方法及其應(yīng)用、光纖探頭及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針?biāo)捎玫募夹g(shù)方案是：

用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，具有式ⅰ所示的結(jié)構(gòu)：

式ⅰ中，ar與ar’為熒光基團(tuán)。ar和ar’分別獨(dú)立地選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨(dú)立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基，r1為碳原子數(shù)為1～4的烷基，r2為羥基或氫。

優(yōu)選的，所述稠環(huán)基選自萘基，蒽基，苝基或芘基。

優(yōu)選的，ar和ar’獨(dú)立地選自萘基、苯基、芘基或甲基取代的苯基。

優(yōu)選的，ar與ar’為熒光基團(tuán)。

本發(fā)明的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針的制備方法所采用的技術(shù)方案為：

上述用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：在酸性催化劑的催化作用下，將式ⅱ、式ⅲ所示的化合物在溶劑a中反應(yīng)，即得；

式ⅱ中，ar為熒光基團(tuán)。ar選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨(dú)立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基。

式ⅲ中，ar’為熒光基團(tuán)。ar’選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨(dú)立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基，r1為碳原子數(shù)為1～4的烷基，r2為羥基或氫。

所述酸性催化劑選自甲酸、乙酸、硫酸、鹽酸、sio2-al2o3、b2o3-al2o3中的一種或多種。

所述溶劑a選自苯、甲苯、乙醇、丙醇、乙醚、四氫呋喃、氯仿中的一種或多種。

所述反應(yīng)的方程式如下：

所述酸性催化劑與式ⅱ化合物的摩爾比為1:1～100。

所述式ⅱ、式?；衔锏哪柋葹?:0.3～2.7。

所述溶劑a的加入量為：每克式ⅱ化合物對(duì)應(yīng)加入5～100ml溶劑a。

所述反應(yīng)的溫度為55～85℃，時(shí)間4～15h。

反應(yīng)完畢后，先蒸發(fā)溶劑，然后濃縮溶液，采用冰水混合物冷卻后，收集沉淀，純化，即得。純化可采用重結(jié)晶或?qū)游龇蛛x的方法。重結(jié)晶所用溶劑可與溶劑a相同，如采用氯仿、甲醇、乙醇等。

本發(fā)明的修飾纖維探頭所采用的技術(shù)方案為：采用上述用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針修飾的光纖探頭。

上述光纖探頭的制備方法，包括如下步驟：

1)將錐形化的光纖進(jìn)行表面羥基化處理，得到羥基化錐形光纖；

2)將步驟1)所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入醇類化合物中浸泡，然后在反應(yīng)體系中加入氨水繼續(xù)進(jìn)行浸泡，干燥，得預(yù)處理光纖；

3)將上述熒光探針、縮合劑和步驟2)所得的預(yù)處理光纖加入溶劑b中反應(yīng)，即得。

所采用的光纖為石英材質(zhì)。

步驟1)中，所述錐形化的光纖可以采用包括如下步驟的方法制備：將光纖先用濃硫酸浸泡1～2h，然后將光纖插入氫氟酸和氟化銨的混合溶液中浸泡，即得。所述混合溶液是將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30～50％的氫氟酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15～30％的氯化銨溶液按照體積比為75～85:15～25進(jìn)行混合得到的。

可以采用依次在piranha溶液、氫氟酸、piranha溶液中浸泡的方法將錐形化的光纖進(jìn)行表面羥基化處理。所述piranha溶液是將h2o2溶液和濃硫酸混合得到的。優(yōu)選的，h2o2溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％。濃硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3％。h2o2溶液和濃硫酸的體積比為3:7。

將錐形化的光纖進(jìn)行表面羥基化處理時(shí)，采用的氫氟酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30～50％。對(duì)錐形化的光纖進(jìn)行表面羥基化處理后，依次采用水和乙醇進(jìn)行清洗。

步驟2)中，所述醇類化合物為甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。

步驟2)中，在醇類化合物中浸泡的時(shí)間為10～30min，在反應(yīng)體系中加入氨水后浸泡的時(shí)間為1h～3h。氨水中nh3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％～28％。氨水可以提供堿性條件促進(jìn)水解。加入的氨水和醇類化合物的體積比為1～3:7～9。

步驟3)中，所述溶劑b選自甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮、水中的一種或多種。

步驟3)中，所述縮合劑選自edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)+nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)；或者dcc(二環(huán)己基碳二亞胺)中的一種或多種。

步驟3)中，所述反應(yīng)的溫度為室溫，時(shí)間為8～16h。

本發(fā)明的技術(shù)方案還在于：上述熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中熒光探針具有針對(duì)超氧陰離子的熒光敏感性，可與超氧陰離子反應(yīng)，并導(dǎo)致熒光淬滅，通過探測(cè)熒光即可快速識(shí)別超氧陰離子，檢測(cè)靈敏度較高，適用于超氧陰離子的便捷檢測(cè)。同時(shí)，該熒光探針也可用于制備超氧陰離子探測(cè)用熒光傳感器。

本發(fā)明中用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針和光纖探頭，能快速識(shí)別溶液中的超氧陰離子，靈敏度較高，適于超氧陰離子的便捷檢測(cè)。

本發(fā)明中熒光探針及光纖探頭的制備工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

附圖說明

圖1為是實(shí)施例1中的熒光探針的紅外光譜圖；

圖2為實(shí)施例1中熒光探針對(duì)不同濃度超氧陰離子自由基(從上至下，超氧陰離子自由基的濃度分別為：0μmol/l，2μmol/l，4μmol/l，6μmol/l，8μmol/l，10μmol/l，15μmol/l，20μmol/l，25μmol/l)的熒光光譜識(shí)別圖；

圖3為實(shí)施例1中的光纖探頭的紫外照射成像圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。

各實(shí)施例中采用的氫氟酸和氟化銨混合溶液是將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％的氫氟酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的氟化銨溶液按照體積為8：2進(jìn)行混合得到的；在將錐形化的光纖進(jìn)行羥基化的過程中采用的氫氟酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％；piranha溶液是將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的h2o2溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3％的濃硫酸按照體積比為3:7進(jìn)行混合得到的；所采用的氨水中nh3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％；所采用的光纖的材質(zhì)為石英。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.5g對(duì)氨基苯甲酸溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含0.65g香草醛的25ml無水乙醇中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，60℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡1h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進(jìn)行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡20min，然后在反應(yīng)體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡1.5h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預(yù)處理光纖；

4)將上述熒光探針、預(yù)處理光纖、edc+nhs加入甲醇中，在室溫反應(yīng)8h，即得。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

將本實(shí)施例的熒光探針進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，測(cè)試所得的紅外光譜圖見圖1。由圖1可知，～1628cm^-1附近的紅外振動(dòng)峰表明熒光探針分子結(jié)構(gòu)中存在席夫堿結(jié)構(gòu)。

采用熒光法對(duì)本實(shí)施例的熒光探針的熒光光譜進(jìn)行檢測(cè)：將本實(shí)施例的熒光探針配制成10μmol/l的溶液，然后加入鄰苯三酚產(chǎn)生超氧陰離子，當(dāng)溶液中超氧陰離子自由基的濃度(單位：μmol/l)不同時(shí)，熒光探針對(duì)超氧陰離子自由基的熒光光譜識(shí)別如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著超氧陰離子濃度的增加，溶液的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

對(duì)本實(shí)施例的光纖探頭進(jìn)行超氧陰離子顯微熒光成像測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見圖3。在接觸超氧陰離子之前呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，接觸后，熒光消失。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.5g8-氨基-3-喹啉羧酸溶于15ml甲苯，用滴液漏斗滴加到含0.17g8-羥基-4-甲氧基-2-萘甲醛的20ml甲苯中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，85℃回流攪拌15h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡2h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進(jìn)行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡10min，然后在反應(yīng)體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡1h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預(yù)處理光纖；

4)將上述熒光探針、預(yù)處理光纖、dcc加入甲醇中，在室溫反應(yīng)12h，即得。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.5g10-羥基-8-甲氧基蒽-2-甲醛溶于20ml苯，用滴液漏斗滴加到含3.1g9-氨基苝-3甲酸的150ml苯中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，85℃回流攪拌4h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水甲醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡1.5h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進(jìn)行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡30min，然后在反應(yīng)體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡2.5h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預(yù)處理光纖；

4)將上述熒光探針、預(yù)處理光纖、dcc加入甲醇中，在室溫反應(yīng)12h，即得。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.6g6-氨基2-芘甲酸溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含1.7g4-甲基-3甲氧基-5-羥基苯甲醛的100ml無水乙醇中，再加入0.2gb2o3-al2o3作為催化劑，75℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法同實(shí)施例1。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例5

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.8g6甲氧基-9-羥基-2芘甲醛溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含2.0g(6-氨基-7-羥基)萘基甲基酮的50ml無水乙醇中，再加入0.2gsio2-al2o3作為催化劑，85℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法同實(shí)施例1。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例6

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.5g(6-氨基-9-羥基)蒽基甲基酮溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含6g5-羥基-12-甲氧基-2苝甲醛的100ml無水乙醇中，再加入0.4ml甲酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98％)作為催化劑，85℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法同實(shí)施例1。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例7

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.3g3-氨基-4甲基苯甲酸溶于30ml無水甲醇，用滴液漏斗滴加到含1.0g2-羥基-6甲氧基喹啉-3甲醛的100ml無水甲醇中，再加入0.1ml硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98％)作為催化劑，85℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法同實(shí)施例1。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。

實(shí)施例8

本實(shí)施例的用于識(shí)別超氧陰離子的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.3g3-氨基-4甲基苯甲酸溶于30ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含1.0g6甲氧基喹啉-3甲醛的100ml無水乙醇中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，85℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進(jìn)行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結(jié)晶，即得；反應(yīng)方程式如下：

本實(shí)施例的光纖探頭采用上述用于識(shí)別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法同實(shí)施例1。

本實(shí)施例的熒光探針在識(shí)別或檢測(cè)超氧陰離子方面的應(yīng)用。