專利名稱：一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種陰離子自由基的測定方法，更具體的說是一種測定苦草葉片中超 氧陰離子自由基的方法。
背景技術(shù)：
活性氧(ROS)是外源性氧化劑或細(xì)胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活 性的含氧自由基的總稱，包括超氧陰離子(02·_)、羥自由基(·0Η)、氫過氧基(Η02_·)、 過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)等。植物組織的光合作用、呼吸作用、氧化磷酸化、脂肪酸 的-β -氧化以及許多氧化酶的代謝過程均可產(chǎn)生R0S。愈來愈多的研究證實，ROS是植物體 代謝的正常部分，可作為信號分子誘導(dǎo)植物體對環(huán)境脅迫的應(yīng)激響應(yīng)，而特定條件(如污 染物的脅迫)下能造成ROS的積累，進而導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化、蛋白分子的氧化修飾或降解， 以及DNA分子的氧化損傷等。因此，研究自由基的產(chǎn)生、積累和代謝的變化，能夠反映植物 體在逆境條件下的氧化脅迫和應(yīng)激響應(yīng)水平，可為環(huán)境污染物的早期診斷提供預(yù)警信號。 因此，準(zhǔn)確測定植物組織ROS的產(chǎn)生和積累水平具有十分重要的理論意義和應(yīng)用前景。O2 ·_是各種ROS中產(chǎn)生最早的自由基，由氧分子接受一個電子而形成。雖然O2 *_在 生物體內(nèi)的氧化能力和危害性不如· 0Η，但卻是非常重要的一種自由基。它作為前驅(qū)物可 以轉(zhuǎn)化為各種自由基，比如O2 ·_可以發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2 ；而O2 ·_和H2O2可通過Fenton 反應(yīng)、Haber-Weiss反應(yīng)、Winterbourn反應(yīng)以及光解反應(yīng)等過程轉(zhuǎn)換成· 0Η。因此對植物 組織中O2 ·_的定量檢測尤其顯得意義重大。但由于自由基的半衰期十分短暫，且在植物體 內(nèi)存在濃度極低，直接測定十分困難。目前研究學(xué)者常采用間接方法去檢測植物體內(nèi)產(chǎn)生 的O2 · _。比如通過分光光度法測定特定化合物與植物勻漿液中O2 · _發(fā)生羥胺反應(yīng)產(chǎn)生的 中間產(chǎn)物，推算植物體內(nèi)O2 · _的產(chǎn)生速率，但必須注意影響間接方法的干擾因素很多。另 外，植物組織的O2 -也能夠直接捕獲，比如通過氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法實現(xiàn)O2 -在植物葉 片上的直接顯色，從而獲得O2 ·_在葉片組織上分布信息，但是該法在準(zhǔn)確定量上存在明顯 不足，而且跟間接法一樣，該法的干擾因素多，且能應(yīng)用的植物種類很受限制。目前，尋找一種快速、準(zhǔn)確、高效、直接的自由基檢測方法已成為研究自由基生物 學(xué)作用的關(guān)鍵。電子順磁共振(EPR)結(jié)合自旋捕獲技術(shù)是當(dāng)前研究自由基最直接、最有效 的方法，近來已廣泛應(yīng)用于動物毒理、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究。此方法的基本原理是利用捕 獲劑與活潑自由基反應(yīng)形成較穩(wěn)定的自由基，即自旋加合物，然后再用Era進行檢測。目前 比較常用的自旋捕捉劑有5，5_二甲基-1-卩比咯啉-N-氧化物(DMP0)、亞硝基特丁烷(NtB)、 α-苯基-N-叔丁基甲亞胺-N-氧化物(PBN)等。其中由于PBN相對較穩(wěn)定，自旋加合物壽 命長，在測定動物體內(nèi)自由基含量方面應(yīng)用較為廣泛，但該捕獲劑并不適用于多種植物特 別是水生植物組織中自由基的檢測，且不能穩(wěn)定提供其與O2 · _自旋加合物的特征譜線，限 制了其推廣。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，水生高等植物是保持水體穩(wěn)定的關(guān)鍵生態(tài)群，且沉水植物完 全水生的特點使得其對水體污染脅迫的反應(yīng)最為直接。苦草(Vallisnerianatans (Lour.)
3Hara)是水鱉科苦草屬的多年生無莖沉水草本植物，廣泛分布于我國低海拔地區(qū)的河流和 淺水湖泊等水域。目前已成為毒理學(xué)實驗中經(jīng)常采用的水生植物物種，相關(guān)研究較多集中 于各種污染物對其產(chǎn)生氧化脅迫方面，但污染物脅迫誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生的直接證據(jù)鮮見報 道。尹穎等(2007)曾將冷凍干燥后的苦草葉片剪碎，用Era直接檢測葉片自由基含量，獲 得的Era譜峰為一單峰，但是該方法未能使用特征捕獲劑直接捕獲活體自由基，測定的自 由基難以準(zhǔn)確定量，獲得的譜峰也缺乏特異性，影響了其推廣。因此，研發(fā)一種高效直接且 特異性強的自由基捕獲技術(shù)顯得意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
1、要解決的技術(shù)問題本發(fā)明主要是針對現(xiàn)有自由基測定方法的不足，提供了一種測定常見大型沉水植 物苦草葉片中超氧陰離子自由基強度的方法，采用1，2-二羥基苯-3，5-二磺酸鈉(Tiron) 作為自旋捕獲劑，應(yīng)用Era技術(shù)測定苦草葉片中超氧陰離子自由基，可以實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、 直接的進行自由基檢測，為污染物脅迫誘導(dǎo)植物葉片產(chǎn)生自由基提供直接證據(jù)，該方法也 可應(yīng)用于實驗室內(nèi)外其它水生和陸生植物類群葉片中O2 · _的定量研究。2、技術(shù)方案3、一種測定苦草葉片超氧陰離子自由基的方法，包括如下幾個步驟第一步；采集充分暴露的苦草幼嫩葉片的尖端部位，清洗；第二步自由基的Tiron捕獲；第三步=EI3R測定。其中的第一步驟，葉片采集，清洗迅速剪取經(jīng)暴露的苦草幼嫩葉片的尖端部分， 經(jīng)純水清洗，用濾紙快速吸干葉片表面殘余水分。第二步驟，自由基的Tiron捕獲迅速稱取0. 1 0. 3g的植物葉片，置于瓷制研 缽內(nèi)，澆上液氮使其迅速冷卻，用研杵快速敲碎葉片并研磨成粉末狀，待殘余液氮揮發(fā)干凈 后，立即按葉片重量g 捕獲劑溶液體積HiL為1 8 1 10的比例加入Tiron捕獲劑溶 液(內(nèi)含 10 20mM 鄰苯二酚-3，5-二磺酸鈉(Tiron, CAS 149-45-1，Sigma，美國)，50mM 2_環(huán)己胺基乙磺酸(CHES)和0. 5% (ν/ν)吐溫-20，ρΗ 8. 4 8. 6)并充分勻漿。此勻漿 液在10，000 12，OOOrpm, 4°C，離心15 20min。取上清液注入3mm石英管中，迅速放入液 氮中保持，以備Era測定。在捕獲前半個小時，在密閉操作箱中導(dǎo)入氮氣以徹底去除氧氣， 以防止產(chǎn)生甲氧基對結(jié)果進行干擾。以上整個操作過程在氮氣環(huán)境的密閉操作箱中進行。第三步驟，EPR測定Era測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。 EI3R操作參數(shù)測試溫度室溫；中心磁場3476G ；掃瞄寬度50G ；調(diào)制頻率100KHz ；微波 功率:20mff ；調(diào)制幅度1. OG ；receiver gain :2X IO4 ；掃瞄次數(shù)1次。獲得的信號強度用 于表征自由基含量。4、有益效果本發(fā)明采用Era結(jié)合自旋捕獲技術(shù)，公開了一種直接測定苦草葉片組織超氧陰離 子自由基的方法，與以往的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)快速、高效。本發(fā)明操作較為簡單，容易掌握，并能在很短的時間內(nèi)測得苦草葉 片中的超氧陰離子自由基。
(2)直接、準(zhǔn)確。根據(jù)Era波譜圖的超精細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)可確定所測定的自由基是超 氧陰離子自由基，而不像化學(xué)法和色譜法那樣專一性不強。(3)敏感且具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果多種污染物在低濃度下既能顯著 誘導(dǎo)超氧陰離子產(chǎn)生，其強度與暴露物在一定濃度范圍內(nèi)存在著較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系， 顯示自由基可以作為敏感的指示污染物脅迫的生物標(biāo)志物。(4)實用性較廣。本發(fā)明對其它水生植物和陸生植物種屬也同樣適用，并可適用于 根部組織。對于不同的污染物暴露都能直接測出超氧陰離子自由基，同時可應(yīng)用于野外原 位實驗。


圖1為不同濃度微囊藻毒素MC-LR脅迫下苦草葉片超氧陰離子自由基的EI5R波譜圖2為MC-LR暴露濃度和超氧陰離子自由基強度的關(guān)系。數(shù)值表示為平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤(η = 3)廣和〃分別表示處理組相對于對照組有顯著性(ρ < 0. 05)和極顯著性差 異(P < 0.01)圖3為不同濃度銨態(tài)氮脅迫下苦草葉片超氧陰離子自由基的EI5R波譜圖4為銨態(tài)氮暴露濃度和超氧陰離子自由基強度的關(guān)系。數(shù)值表示為平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤(η = 3)廣表示處理組相對于對照組有顯著性差異(ρ < 0. 05)圖5為底泥中Cd2+濃度和苦草葉片超氧陰離子自由基強度的關(guān)系。數(shù)值表示為平 均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(η = 3) ； μ表示處理組相對于對照組有極顯著性差異(ρ < 0. 01)圖6為經(jīng)SOD酶預(yù)處理苦草葉片后超氧陰離子自由基強度的變化。數(shù)值表示為平 均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(η = 3)廣表示處理組相對于對照組有顯著性差異(ρ < 0. 05)
具體實施例方式以下通過實例進一步說明本發(fā)明的實施應(yīng)用實施例1微囊藻毒素MC-LR脅迫下苦草葉片超氧陰離子自由基的測定選擇我國淡水環(huán)境常見沉水植物苦草(Vallisneria natans (Lour. ) Hara)為受試 生物。植株由商業(yè)苦草種子培育得到，培養(yǎng)液采用改進的Hoagland營養(yǎng)液(0. IX)，用曝 氣后的自來水配置。培養(yǎng)溫度為25°C，光照強度為40001UX，光周期為12/12h。選取長勢 良好的高約IOcm的植株幼苗移入含5cm石英砂的玻璃缸，內(nèi)含Hoagland稀釋液，馴養(yǎng)數(shù) 天后，添加不同濃度MC-LR，暴露濃度為0，0. 1,0. 5，1. 0,5. 0，10. 0μ g廠1，每個濃度組3個 平行，暴露14d，隔天換水并補加營養(yǎng)液和MC-LR。暴露完成后剪取苦草幼嫩葉片的尖端部 分，經(jīng)純水清洗，用濾紙快速吸干葉片表面殘余水分。迅速稱取約0. 2g的植物葉片，置于瓷 制研缽內(nèi)，澆上液氮使其迅速冷卻，用研杵快速敲碎葉片并研磨成粉末狀，加入2mL捕獲劑 溶液(內(nèi)含IOmM Tiron (Sigma，美國)，50mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸(CHES)禾Π 0. 5% (ν/ν)吐 溫-20，ρΗ 8.6)并充分勻漿。此勻漿液在10，500rpm，4°C，離心20min。上清液用于EI3R測 定。以上整個操作過程在氮氣環(huán)境的密閉操作箱中進行。 EPR測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EI3R操作參數(shù)測試 溫度室溫；中心磁場:3476G ；掃瞄寬度:50G ；調(diào)制頻率=IOOKHz ；微波功率:20mff ；調(diào)制幅 度1. OG receiver gain :2 X IO4 ；掃瞄次數(shù)1次。獲得的信號強度用于表征自由基含量。
圖1是不同濃度微囊藻毒素MC-LR脅迫14d后苦草葉片超氧陰離子自由基的信號 圖譜。說明苦草經(jīng)MC-LR誘導(dǎo)可產(chǎn)生R0S，被Tiron捕獲生成Tiron加合物，并且能被EI3R 光譜檢測到。根據(jù)譜圖的超精細(xì)結(jié)構(gòu)常數(shù)和譜圖的形狀分析，證實本實驗中捕獲到的活性
氧是O2 · _。從圖2中可看出，MC-LR誘導(dǎo)苦草葉片O2 ·_強度隨著暴露的濃度增加而增加，不過 IOyg L—1暴露濃度下信號強度略有下降。當(dāng)暴露濃度為1. Oyg L—1時，O2 ·_的信號強度是 對照組的181%，與對照組相比具有極顯著性差異(ρ < 0. 01)，當(dāng)暴露濃度是5. 0-10. 0 μ g Γ1時，O2 ·_的信號強度是對照組的182% -173%，與對照組相比具有顯著性差異(ρ <0. 05, P <0. 01)。結(jié)合掃描和透射電鏡觀察，較高濃度(5. 0-10. Oyg LlMC-LR暴露對苦草葉 肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)造成了明顯的破壞，因此推測O2 -信號強度沒有明顯上升與細(xì)胞結(jié)構(gòu)破 壞有關(guān)。經(jīng)線性回歸分析表明，在沒有造成葉片顯著病理損傷的MC-LR暴露濃度下，其和誘 導(dǎo)產(chǎn)生的自由基強度之間呈明顯的線性劑量_效應(yīng)關(guān)系:y =1.21* 104x+3. 12 * IO4, R2 = 0. 944，y代表O2 · _自由基信號強度，χ代表MC-LR暴露濃度。研究結(jié)果說明MC-LR暴露會 造成O2 · _在苦草葉片的累積從而有可能造成植株氧化損傷。實施例2銨態(tài)氮脅迫下苦草葉片超氧陰離子自由基的測定選擇沉水植物苦草(Vallisneria natans (Lour. ) Hara)為受試生物。苦草植株 的發(fā)芽和培養(yǎng)同實施例1，選取長勢良好的高約IOcm的植株幼苗移入含5cm石英砂的玻璃 缸，內(nèi)含無氮Hoagland稀釋液，添加不同濃度氯化銨，使NH4+_N暴露濃度達到0，0. 05，0. 1， 3. Omg L—1，每個濃度組3個平行，暴露14d，每天換水并補加氯化銨母液。暴露完成后剪取苦 草幼嫩葉片的尖端部分，經(jīng)純水清洗，用濾紙快速吸干葉片表面殘余水分。迅速稱取約0. 3g 的植物葉片，置于瓷制研缽內(nèi)，澆上液氮使其迅速冷卻，用研杵快速敲碎葉片并研磨成粉末 狀，加入2. 4mL Tiron捕獲劑溶液(內(nèi)含15mM Tiron (Sigma，美國)，50mM 2-環(huán)己胺基乙磺 酸(CHES)和0.5% (ν/ν)吐溫-20，ρΗ 8.5)并充分勻漿。此勻漿液在12，OOOrpm，4°C，離 心15min。上清液用于EI3R測定。以上整個操作過程在氮氣環(huán)境的密閉操作箱中進行。EI3R 測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EI3R操作參數(shù)同實施例1。圖3是不同濃度銨態(tài)氮MC-LR脅迫14d后苦草葉片超氧陰離子自由基的信號圖 譜。說明苦草經(jīng)銨態(tài)氮誘導(dǎo)可產(chǎn)生R0S，被Tiron捕獲生成Tiron加合物，并且能被EI5R光 譜檢測到。根據(jù)譜圖的超精細(xì)結(jié)構(gòu)常數(shù)和譜圖的形狀分析，證實本實驗中捕獲到的活性氧 是 O2 ·-。從圖4中可看出，0. 05mg Γ1銨態(tài)氮暴露下O2 · _強度有所降低，這是因為N是植 物必須的營養(yǎng)元素，低濃度N能維持植株正常的生長。之后苦草葉片O2 ·_強度隨著暴露濃 度開始增加，銨態(tài)氮當(dāng)暴露濃度為3. Omg Γ1時，O2 · _的信號強度是對照組的152%，與對 照組相比具有顯著性差異(P < 0. 05)。研究結(jié)果說明銨態(tài)氮一旦超過植株正常的生長所需 要的濃度，會造成O2 -在苦草葉片的累積從而有可能造成植株氧化損傷。實施例3鎘脅迫下苦草葉片超氧陰離子自由基的測定選擇沉水植物苦草(Vallisneria natans (Lour. ) Hara)為受試生物?？嗖葜仓甑?發(fā)芽和培養(yǎng)同實施例1，培養(yǎng)液采用改進的Hoagland營養(yǎng)液(0. 1 X)，用曝氣后的自來水配 置。培養(yǎng)溫度為25°C，光照強度為40001UX，光周期為12/12h。選取長勢良好的高約IOcm 的植株幼苗移入添加不同Cd2+濃度底泥的玻璃缸，上覆水為平衡IOd的曝氣自來 (試驗用底泥采自太湖某湖區(qū)，人為添加不同濃度氯化隔并老化60d)；每個濃度組3個平行，暴露 14d。暴露完成后剪取苦草幼嫩葉片的尖端部分，經(jīng)純水清洗，用濾紙快速吸干葉片表面殘 余水分。迅速稱取約0. Ig的植物葉片，置于瓷制研缽內(nèi)，澆上液氮使其迅速冷卻，用研杵快 速敲碎葉片并研磨成粉末狀，加入ImL Tiron捕獲劑溶液(內(nèi)含20mM Tiron (Sigma，美國)， 50mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸(CHES)和0.5% (ν/ν)吐溫_20，ρΗ 8.4)并充分勻漿。此勻漿液 在10，000印111，41，離心201^11。上清液用于EI3R測定。以上整個操作過程在氮氣環(huán)境的密 閉操作箱中進行。EI3R測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EI3R操作參 數(shù)同實施例1。圖5為底泥中Cd2+濃度和苦草葉片超氧陰離子自由基強度的關(guān)系。由圖可知，底 泥中添加Img kg—1的重金屬Cd脅迫即能極顯著誘導(dǎo)苦草葉片中O2 · _的產(chǎn)生，且脅迫濃度 和誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基強度之間呈明顯的線性劑量_效應(yīng)關(guān)系y = 2.87 * 104x+4. 58 * IO4, R2 = 0. 970。O2 ·_在苦草葉片的累積有可能會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等， 從而對植株帶來傷害。實施例4超氧化物歧化酶SOD對苦草葉片超氧陰離子自由基含量的影響選擇沉水植物苦草(Vallisneria natans (Lour. ) Hara)為受試生物。苦草植株 的發(fā)芽和培養(yǎng)同實施例1，選取長勢良好的高約IOcm的植株幼苗進行研究。剪取苦草新 鮮葉片，立即浸入0，10，1000U mL—1的SOD酶溶液(含IOmMMnCl2)，溶液置于自制可抽真 空的玻璃容器內(nèi)。抽真空(5分鐘X3次)，促使溶液滲透進入葉片組織細(xì)胞，真空度以葉 片表面出現(xiàn)明顯微小氣泡為宜。黑暗下靜止15min后，取葉片尖端部分，經(jīng)純水清洗，用濾 紙快速吸干葉片表面殘余水分。迅速稱取約0. 2g的植物葉片，置于瓷制研缽內(nèi)，澆上液氮 使其迅速冷卻，用研杵快速敲碎葉片并研磨成粉末狀，加入2mL Tiron捕獲劑溶液(內(nèi)含 12mMTiron (Sigma，美國)，50mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸(CHES)和 0. 5 % (ν/ν)吐溫-20，ρΗ 8.6)并充分勻漿。此勻漿液在10，500rpm，4°C，離心20min。上清液用于EI3R測定。以上整 個操作過程在氮氣環(huán)境的密閉操作箱中進行。EI3R測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電 子順磁共振儀。Era操作參數(shù)同實施例1。圖6表明經(jīng)1000U HiL-1SOD酶溶液處理后，葉片自由基含量顯著下降，從另一角度 證實了 Tiron捕獲劑捕獲的自由基信號確實來源于超氧陰離子。由于短時間處理和抽真 空使SOD進入葉肉細(xì)胞的效率有限，故處理后仍然能捕獲到一定量的超氧陰離子自由基信號。
權(quán)利要求
一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法，包括如下幾個步驟第一步；采集充分暴露的苦草幼嫩葉片的尖端部位，清洗；第二步自由基的Tiron捕獲；第三步EPR測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法，其特征在 于在第二步自由基捕獲前半個小時，在自制密閉操作箱中導(dǎo)入氮氣以徹底去除氧氣，以防 產(chǎn)生甲氧基對結(jié)果進行干擾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法，其特征在于 第二步自由基的Tiron捕獲，具體為迅速稱取0. 1 0. 3 g的植物葉片，置于瓷制研缽內(nèi)， 澆上液氮使其迅速冷卻，用研杵快速敲碎葉片并研磨成粉末狀，待殘余液氮揮發(fā)干凈后，立 即按葉片重量g:捕獲劑溶液體積mL為1 :8 1 10的比例加入捕獲劑溶液并充分勻漿；將獲 得的勻漿液在10，000^12, 000rpm，4°C，離心15 20 min，取上清液注入3 mm石英管中，迅 速放入液氮中保持，以備Era測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方 法，其特征在于測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀，EPR操作參 數(shù)測試溫度室溫；中心磁場3476 G ；掃瞄寬度50 G ；調(diào)制頻率100 KHz ；微波功率20 mff ；調(diào)制幅度1. 0 G ；receiver gain :2X104 ；掃瞄次數(shù)1次；其中獲得的信號強度用于表 征自由基含量。
5.根據(jù)權(quán)利3中所述的一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法，其特征在于捕 獲劑溶液為每1 mL捕獲劑，內(nèi)含10 20 mM鄰苯二酚_3，5-二磺酸鈉，50 mM 2-環(huán)己胺基 乙磺酸和體積百分比0. 5%的吐溫-20，pH值為8. 4 8. 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定苦草葉片中超氧陰離子自由基的方法，屬于陰離子自由基的測定領(lǐng)域。首先采集充分暴露的苦草幼嫩葉片的尖端部位，清洗；在密閉的氮氣環(huán)境中的密閉操作箱中進行自由基的Tiron捕獲，最后用EPR技術(shù)進行測定。本發(fā)明的優(yōu)點在于操作較為簡單，容易掌握，并能在很短的時間內(nèi)測得苦草葉片的超氧陰離子自由基；根據(jù)EPR譜圖的超精細(xì)結(jié)構(gòu)常數(shù)和譜圖的形狀分析，結(jié)合SOD酶預(yù)處理后葉片自由基強度顯著降低，發(fā)現(xiàn)所測定的自由基是超氧陰離子自由基，是目前測定超氧陰離子自由基最直接、最準(zhǔn)確有效的方法；超氧陰離子對污染物響應(yīng)敏感并具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；本發(fā)明同樣適用于其它水生植物和陸生植物種屬，并可適用于植物根部組織的自由基測定。
文檔編號G01N24/10GK101936930SQ201010250960
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者任靜華, 姜錦林, 宋睿, 楊柳燕, 王曉蓉, 顧雪元 申請人:南京大學(xué)