本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及miipps303阻斷劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

背景技術(shù)：

核因子κb(nuclearfactor-kb,nf-κb)屬于rel家族的重要核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其普遍存在于組織細(xì)胞中。在靜息狀態(tài)下，這些蛋白通常以同二聚體或異二聚體形式與抑制蛋白結(jié)合，存在于胞質(zhì)中。nf-κb的激活主要有兩條通路，由iκb激酶β(iκbkinaseβ,ikkβ)介導(dǎo)的經(jīng)典通路和由ikkα依賴的非經(jīng)典通路。激活的nf-κb轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過調(diào)控一系列促炎靶基因的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡和代謝等生理病理過程中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，nf-κb與腫瘤的關(guān)系非常密切，可以通過調(diào)節(jié)各種靶基因，參與多種信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡并促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和放化療抵抗，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得“干細(xì)胞”特性表型。其中nf-κb與結(jié)直腸癌的關(guān)系一直頗受重視，可能成為結(jié)直腸癌患者療效監(jiān)測和預(yù)后預(yù)測的一個(gè)生物標(biāo)志物以及分子治療的靶點(diǎn)。

細(xì)胞遷移抑制蛋白(migrationandinvasioninhibitoryprotein,miip)也被稱為侵襲抑制蛋白45，最初在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miip基因可以通過結(jié)合胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2抗體與組蛋白取乙?；?，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。也有研究發(fā)現(xiàn)，miip基因與乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且該基因的表達(dá)情況可以影響非小細(xì)胞肺癌與食道癌的預(yù)后。

現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于針對磷酸化位點(diǎn)miipps303為靶點(diǎn)開發(fā)藥物，用于治療egfr/pkcε異?；罨@類惡性腫瘤，目前還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，研究發(fā)現(xiàn)egfr信號激活后pkcε磷酸化miip蛋白絲氨酸303位(s303)，磷酸化的miip能夠與nf-kb信號通路中重要功能分子rela結(jié)合，從而維持了egfr信號激活后rela的乙?；?，進(jìn)而促進(jìn)了rela介導(dǎo)的促轉(zhuǎn)移分子的表達(dá)，最終促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并證實(shí)了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后與miips303磷酸化相關(guān)，基于此提供miipps303阻斷劑和檢測miips303磷酸化水平的試劑的新用途。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供miipps303阻斷劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

作為一種具體實(shí)施方式，所述的腫瘤為egfr/pkcε異常活化的惡性腫瘤。

作為一種具體實(shí)施方式，所述腫瘤為結(jié)腸癌。

作為一種具體實(shí)施方式，所述藥物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供檢測miips303磷酸化水平的試劑在制備結(jié)腸癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供檢測miips303磷酸化水平的試劑在制備結(jié)腸癌預(yù)后試劑或試劑盒中的應(yīng)用

作為一種具體實(shí)施方式，所述的預(yù)后具體為預(yù)測生存期。

作為一種具體實(shí)施方式，所述檢測miips303磷酸化水平的試劑為磷酸化miips303特異性抗體。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)了egfr信號激活后pkcε磷酸化miip蛋白絲氨酸303位(s303)，磷酸化的miip能夠與nf-kb信號通路中重要功能分子rela結(jié)合，從而維持了egfr信號激活后rela的乙?；剑M(jìn)而促進(jìn)了rela介導(dǎo)的促轉(zhuǎn)移分子的表達(dá)，最終促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，可以針對此磷酸化位點(diǎn)(miipps303)為靶點(diǎn)開發(fā)藥物，用于治療臨床上egfr/pkcε異常活化這類惡性腫瘤。此外，本發(fā)明還證實(shí)了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后與miips303磷酸化相關(guān)，因此可以使用檢測miips303磷酸化水平的試劑來進(jìn)行結(jié)直腸癌的診斷或預(yù)后。

附圖說明

附圖1：egf誘導(dǎo)miip和rela之間的相互作用：a，hct116細(xì)胞用/不用egf處理。細(xì)胞提取物用抗flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀。b，用/不用表達(dá)miipshrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hct116細(xì)胞，并且一定時(shí)間內(nèi)用/不用egf處理。用/不用egf(100ng/ml)處理的條件下：用/不用表達(dá)miipshrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hct116細(xì)胞(c)；用表達(dá)野生型rela和relak310r的質(zhì)粒處理hct116細(xì)胞(d)。然后進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。e和f，用/不用egf(100ng/ml)處理的條件下：用/不用表達(dá)miipshrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hct116細(xì)胞；用表達(dá)野生型rela和relak310r的質(zhì)粒處理hct116細(xì)胞(e,f)。然后通過q-pcr分析相對mrna水平。g，hct116細(xì)胞用egf處理(100ng/ml)30分鐘之前先用bis-i(2μm)，u0126(20μm)預(yù)處理1小時(shí)。細(xì)胞提取物用抗flag抗體進(jìn)行免疫沉淀。將純化的gst-miip蛋白與用egf(100ng/ml)處理30分鐘的hct116細(xì)胞的有絲分裂提取物混合。進(jìn)行g(shù)st下拉分析(左圖)。純化的gst-rela蛋白與用egf(100ng/ml)處理30分鐘(右圖)的hct116細(xì)胞的有絲分裂提取物混合。在a，b，g和h中，使用指定的抗體進(jìn)行免疫印跡分析，數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。在c-f中，值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))，*p<0.05和**p<0.01。

附圖2：egf誘導(dǎo)miip和rela之間的相互作用。在a和c中，使用指定的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。(a)用/不用表達(dá)miipshrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞。(b)用/不用表達(dá)miipshrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hct116細(xì)胞，用/不用egf處理30分鐘。通過q-pcr分析相對mrna水平，其值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。*表示p<0.05，**表示指定組之間的p<0.01。(c)在egf處理30分鐘之前，用bis-1(10μm)預(yù)處理hct116細(xì)胞1小時(shí)。

附圖3：pkcε磷酸化miip并促進(jìn)miip-rela相互作用：a，hct116細(xì)胞用或不用egf處理。細(xì)胞提取物用抗flag抗體進(jìn)行免疫沉淀。b和c，通過在[γ-32p]atp存在下將純化的活性pkcε與所示純化的gst-miip蛋白混合來進(jìn)行體外磷酸化分析。miips303在指定物種中進(jìn)化保守(c，左圖)。d，用wtmiip或miips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞用或不用egf處理30分鐘。e，用wtmiip或miips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞用或不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。f，低表達(dá)miip的hct116細(xì)胞和wtrmiip或rmiips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。通過q-pcr分析twist和mmp2相對rela-k310水平。g，低表達(dá)miip的hct116細(xì)胞和wtrmiip或rmiips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。通過q-pcr分析twist和mmp2相對mrna水平。h，低表達(dá)miip的hct116細(xì)胞和wtrmiip或rmiips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理。進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。在a-d中，使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。在e-h中，值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))，*p<0.05和**p<0.01。

附圖4：pkcε磷酸化miip并促進(jìn)miip-rela相互作用。(a)對照shrna或miipshrna質(zhì)粒處理hct116細(xì)胞，并用wtrmiip(n)或rmiips303a的質(zhì)粒處理，使用指定的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。(b和c)用wtrela或relak310r的質(zhì)粒處理miip低表達(dá)的hct116細(xì)胞，wtrmiip或rmiips303a的重組表達(dá)的hct116細(xì)胞。而后用/不用egf處理細(xì)胞30分鐘。通過q-pcr分析相對mrna水平(b)。進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定(c)。

附圖5：pp1介導(dǎo)miip去磷酸化：a，sw480細(xì)胞用/不用egf處理。細(xì)胞提取物用抗miip進(jìn)行免疫沉淀。b，用或不用egf(100ng/ml)刺激用岡田酸(pp1和pp2a抑制劑)(30nm)預(yù)處理的sw480細(xì)胞30分鐘。c，用/不用表達(dá)pp1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞，而后用/不用egf(100ng/ml)處理30分鐘。d，通過存在/不存在na3vo4/岡田酸的情況下將純化的活性pp1與p38-磷酸化的gst-miip蛋白混合來進(jìn)行體外去磷酸化分析。e-g，用/不用表達(dá)pp1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞用或不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。用抗miip的抗體進(jìn)行細(xì)胞提取物免疫沉淀(e)。也進(jìn)行chip分析。將覆蓋rela結(jié)合位點(diǎn)的twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的引物用于q-pcr(f，g)。h，用/不用表達(dá)pp1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞，而后用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。通過q-pcr分析相對mrna水平。i，用/不用表達(dá)pp1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞，而后用/不用egf(100ng/ml)處理，進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。在a-e中，使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。在a-e中，使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析，數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。在f-i中，值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))，*p<0.05和**p<0.01。

附圖6：pp1介導(dǎo)miip去磷酸化。(a和b)用/不用egf處理所示細(xì)胞30分鐘。使用指定的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定，其值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。**表示指定組之間的p<0.01(b)。

附圖7：miip阻止hdac6介導(dǎo)的rela去乙?；篴，hct116細(xì)胞在用/不用4sc-202(0.6μm)，fk228(20nm)和nexturastata(5nm)預(yù)處理1小時(shí)，然后egf(100ng/ml)處理30分鐘。進(jìn)行免疫印跡分析。b，hct116細(xì)胞用或不用bis-1預(yù)處理1小時(shí)，然后egf(100ng/ml)處理30分鐘。細(xì)胞提取物用抗flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后用flag-beads洗滌和用抗miip抗體進(jìn)行第二次免疫沉淀(左側(cè)泳道1-4)。細(xì)胞提取物用抗flag抗體進(jìn)行免疫沉淀(左側(cè)泳道5-8)。c-e，用wtmiip或miips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞過表達(dá)或不過表達(dá)hdac6的情況下用/不用egf(100ng/ml)處理細(xì)胞10小時(shí)。進(jìn)行免疫印跡分析(c)。并進(jìn)行了chip分析。將覆蓋rela結(jié)合位點(diǎn)的twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的引物用于q-pcr(d)。通過q-pcr分析相對mrna水平(e)。在a-c中，使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析，數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。在d和e中，值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))，*p<0.05和**p<0.01。

附圖8：miip阻止hdac6介導(dǎo)的rela去乙?；?。用wtrmiip或rmiips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞用或不用egf處理。使用指定的抗體進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。

附圖9：miip-rela相互作用促進(jìn)啟動(dòng)子區(qū)域h3k9乙?；篴,wth3或h3k9r表達(dá)的hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。通過q-pcr分析相對mrna水平。b和d，wtrela或relak310r表達(dá)的hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。進(jìn)行了chip分析。將包含twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的rela結(jié)合位點(diǎn)的引物用于q-pcr。將包含twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的rela結(jié)合位點(diǎn)的引物用于q-pcr。c和e，wtmiip或miips303a表達(dá)的hct116細(xì)胞過表達(dá)用或不過表達(dá)hdac6，而后用/不用egf(100ng/ml)處理細(xì)胞10小時(shí)。進(jìn)行了chip分析。將包含twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的rela結(jié)合位點(diǎn)的引物用于q-pcr。f，用/不用表達(dá)p300shrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hct116細(xì)胞，用/不用egf(100ng/ml)處理10小時(shí)。進(jìn)行chip分析。將包含twist或mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的rela結(jié)合位點(diǎn)的引物用于q-pcr。在g中，使用指示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析，數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。在a-f中，值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。(n＝3獨(dú)立實(shí)驗(yàn))，*p<0.05和**p<0.01。

附圖10：miip-rela相互作用促進(jìn)啟動(dòng)子區(qū)域h3k9乙酰化。(a)用/不用egf處理wth3或h3k9r表達(dá)的hct116細(xì)胞。使用指定的抗體進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的1個(gè)。(b)用/不用egf處理用wth3或h3k9r表達(dá)的hct116細(xì)胞。進(jìn)行了chip分析。將包含rela結(jié)合位點(diǎn)的mmp2基因啟動(dòng)子區(qū)域的引物用于q-pcr。

附圖11：結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后與miipser303磷酸化相關(guān)。a,hct116細(xì)胞分別穩(wěn)定表達(dá)wtrmiip，rmiips303a和rmiips303a+hdac6shrna的細(xì)胞，將這些細(xì)胞經(jīng)由裸鼠經(jīng)脾內(nèi)注射，構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移小鼠模型。具有代表性的移植瘤(左列)，統(tǒng)計(jì)具有明顯肝轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量，數(shù)據(jù)表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10,右列)。b在182個(gè)結(jié)直腸癌患者標(biāo)本的切片中進(jìn)行了免疫組化染色分析，檢測miips303磷酸化在結(jié)腸直腸癌(轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移)及相鄰的正常結(jié)腸直腸組織中的表達(dá)(放大倍數(shù):100×and400×),標(biāo)尺:100μm。c在結(jié)腸直腸癌和相鄰的正常結(jié)腸直腸組織中miipps303磷酸化表達(dá)水平。d在轉(zhuǎn)移(m1)和非轉(zhuǎn)移(m0)結(jié)腸直腸癌中miipps303磷酸化表達(dá)水平，卡方檢驗(yàn)提示miipps303水平與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。e182例患者中低miips303磷酸化水平(評分<6,藍(lán)色曲線)與高miips303磷酸化水平(評分≥6,紅色曲線)的生存期(低表達(dá)組,73例患者；高表達(dá)組，109例患者)。kaplan-meier和log-ranktests提示miipps303磷酸化水平與生存期具有顯著相關(guān)性。*表示p<0.05,**表示p<0.01。

附圖12：顯示miip在pkcε激活的情況下誘導(dǎo)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的模型示意圖。pkcε在ser303磷酸化miip，并促進(jìn)其與rela的相互作用，其保護(hù)rela免受hdac6的去乙?；?；反過來，這導(dǎo)致rela轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)和與細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因表達(dá)的增加。pp1作為能夠通過pkcε去磷酸化miip的磷酸酯酶，在癌細(xì)胞中，pkcε活性是過度活躍的，而pp1蛋白水平下調(diào)；從而pkcε/miip/rela信號傳導(dǎo)被加強(qiáng)并且促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

1、egf誘導(dǎo)miip和rela相互作用

請參見圖1-圖2，基于nf-κb信號通路和miip基因在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要作用，我們首先研究miip基因是否參與了表皮生長因子(egf)誘導(dǎo)的nf-κb信號通路的激活。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染標(biāo)記了flag的miip基因的結(jié)腸癌細(xì)胞hct116后，通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在egf的刺激下，miip和rela在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合明顯增加，而這一現(xiàn)象細(xì)胞漿內(nèi)卻沒有發(fā)現(xiàn)。為了檢驗(yàn)細(xì)胞核內(nèi)miip在翻譯修飾水平對nf-κb活性的影響，我們用shrna敲低miip，有趣的是，miip的減少很大程度上廢除了egf誘導(dǎo)的rela蛋白310位賴氨酸的乙?；?，而不是536位絲氨酸的磷酸化，這兩個(gè)位點(diǎn)是rela在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)位點(diǎn)。我們接下來檢測了miip基因是否可以直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲以及相關(guān)下游基因的轉(zhuǎn)錄。與之前研究一致的是，miip表達(dá)不足可以導(dǎo)致腸癌細(xì)胞hct116侵襲能力水平下降。然而，miip不足可以導(dǎo)致egf誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲和相關(guān)基因twist和mmp2的轉(zhuǎn)錄。過表達(dá)對乙?；挚沟膔elak310r突變可以將這些效應(yīng)放大，而野生型的rela卻沒有這一效果，這些提示了egf誘導(dǎo)的rela活性在腫瘤侵襲中的重要性。此外，染色質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，egf誘導(dǎo)明顯增加了mmp2和twist基因啟動(dòng)子區(qū)的miip和relaack310的聚集，這一現(xiàn)象可以被miip的減少所抑制。

有報(bào)道pkcε與egf刺激下rela的活性有關(guān)，本研究中一致的是，pkc的抑制劑bis-i可以影響egf誘導(dǎo)的rela磷酸化和乙?；?。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)egf誘導(dǎo)的miip和rela的結(jié)合可以被pkc抑制劑阻斷，而不是mek/erkinhibitoru0126。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)由egf誘導(dǎo)的miip與rela的結(jié)合可被pkc抑制阻斷，而不是mek/erk抑制劑u0126。這些結(jié)果表明egf誘導(dǎo)的rela與miip之間的相互作用將歸因于增強(qiáng)的egfr-pkc信號傳導(dǎo)，并且驅(qū)使我們進(jìn)一步探索潛在的機(jī)制。如圖1h的左邊所示，將純化的重組miip蛋白與來自hct116細(xì)胞的核提取物孵育后，進(jìn)行g(shù)stpull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，不管egf是否處理，miip與rela不能結(jié)合。然而，另一種平行的gstpull-down實(shí)驗(yàn)顯示egf刺激顯著促進(jìn)核miip與純化的重組rela蛋白結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，egf誘導(dǎo)的miip和rela之間的相互作用以依賴于miip的狀態(tài)改變而不是rela。

2、pkcε磷酸化miip并促進(jìn)miip-rela相互作用

請參見圖3-圖4，我們進(jìn)一步研究了在egfr激活狀態(tài)下miip和rela之間相關(guān)性所需的關(guān)鍵調(diào)控信號。共免疫沉淀分析顯示egf誘導(dǎo)的miip和rela之間的相互作用被小牛腸磷酸酶(cip)消除，顯示這一相互作用是磷酸化依賴的。連同來自gstpull-down實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果，這一發(fā)現(xiàn)提出了細(xì)胞miip可能通過egfr-pkc途徑進(jìn)行翻譯后修飾的可能性。體外蛋白磷酸化測定證明重組miip蛋白被純化和激活的pkcε所磷酸化，但僅抗磷酸化絲氨酸抗體可以檢測到這一磷酸化(放射自顯影和免疫印跡分析證實(shí))。此外，scansite分析還顯示miip上的ser303和thr158是潛在的pkcε磷酸化殘基，放射自顯影分析進(jìn)一步顯示進(jìn)化上保守的ser303突變大大地消除了pkcε介導(dǎo)的miip磷酸化，這也在使用特異性miip-s303磷酸化抗體的免疫印跡分析中所證明。

為了確定pkcε介導(dǎo)的miip-s303磷酸化是否是egf誘導(dǎo)的miip-rela相互作用所必需的，我們耗盡了hct116細(xì)胞中的內(nèi)源性miip，并重建了rnai抗性野生型wtrmiip和重組rmiips303a的表達(dá)，然后進(jìn)行免疫沉淀分析。與其flag標(biāo)記的野生型對照相反，不受磷酸化的突變miips303a在egf刺激下大大失去其與rela的相互作用。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)rmiips303a，而不是wtrmiip導(dǎo)致由egf刺激誘導(dǎo)的relaack310增強(qiáng)水平和持續(xù)時(shí)間都降低。根據(jù)這些結(jié)果，與對照相比，在表達(dá)rmiips303a的hct116細(xì)胞中，mmp2和twist基因的啟動(dòng)子區(qū)域處的由egf誘導(dǎo)的miip募集和relaack310聚集顯著被阻斷。檢測mmp2和twistmrna水平也顯示egf誘導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄也受到在hct116細(xì)胞(圖3g)中的重建rmiips303a表達(dá)的影響，其鏡像，但沒有惡化relak310r表達(dá)的效應(yīng)。此外，transwell分析顯示rmiips303a表達(dá)顯著抑制egf誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲。并且，和對照相比，在hct116細(xì)胞中，relak310r和rmiips303a共表達(dá)后，沒有觀察到額外影響侵襲能力?？傊@些結(jié)果表明pkcε介導(dǎo)的miip-s303磷酸化促進(jìn)miip和rela之間的相互作用，這是egf誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲所需的。

3、pp1介導(dǎo)miip去磷酸化

請參見圖5-圖6，為了進(jìn)一步評估pkcε介導(dǎo)的miip磷酸化對腫瘤細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用，我們檢查了具有不同侵襲能力的多個(gè)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的miip-s303磷酸化水平。顯然，免疫印跡分析顯示egf的刺激可以導(dǎo)致crc細(xì)胞中miip-s303磷酸化增強(qiáng)和更強(qiáng)的侵襲能力，這意味著將存在抵抗pkcε介導(dǎo)的miip磷酸化和限制腫瘤細(xì)胞侵襲能力的某些分子。真核蛋白磷酸化的細(xì)胞通過磷酸酶介導(dǎo)的去磷酸化可逆地調(diào)節(jié)。磷酸蛋白磷酸酶超家族(pp)包括pp1，pp2a，并且參與不同的生物過程。我們想知道m(xù)iippser303是否是pp1的靶標(biāo)。有趣的是，在egf刺激后，共免疫沉淀分析顯示pp1的顯著增加，而不是pp2a。相反，egf僅適度誘導(dǎo)hct116細(xì)胞中的miip-pp1復(fù)合物形成，這將歸因于pp1的有限表達(dá)。此外，我們發(fā)現(xiàn)用岡田酸(oa)(pp1和pp2a的抑制劑)處理顯著增強(qiáng)sw480細(xì)胞中egf誘導(dǎo)的miip-s303磷酸化。并且pp1的過表達(dá)顯著下調(diào)egf刺激后hct116細(xì)胞中miips303磷酸化。為了支持這些發(fā)現(xiàn)，去磷酸化測定還顯示純化的pp1有效地消除了來自hct116細(xì)胞的純化miip-s303的磷酸化，這一現(xiàn)象可被抑制劑na3vo4和岡田酸逆轉(zhuǎn)。因此，這些數(shù)據(jù)證明pp1作為生理性miip磷酸酶的功能。通過共免疫沉淀和chip分析進(jìn)一步證明pp1對rela-miip復(fù)合物的影響，這表明rela和miip之間的相互作用以及在mmp2和twist的啟動(dòng)子區(qū)域miip和relak310乙?；木奂杀籶p1過表達(dá)所破壞。因此，mmp2和twist的轉(zhuǎn)錄也可被egf誘導(dǎo)的pp1阻斷。然而，transwell分析顯示，與miips303a的作用相比，hct116細(xì)胞中pp1的過表達(dá)減弱了egf誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲，表明pp1額外的功能涉及腫瘤細(xì)胞侵襲。

4、miip阻止hdac6介導(dǎo)的rela去乙?；?/p>

請參見圖7-圖8，miip減少對rela去乙?；挠绊懸馕吨鴐iip作用可能是維持rela去乙酰化而不是初始的激活。為了確定這一點(diǎn)，我們用一組hdac抑制劑處理hct116細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過用nexturastata(一種針對hdac6的選擇性抑制劑)處理，顯著逆轉(zhuǎn)了miips303a對egf誘導(dǎo)的relak310乙?；囊种疲皇莌daci類抑制劑4sc-202或fk228。一致地，已有研究報(bào)道m(xù)iip能夠與hdac6形成復(fù)合物參與rela乙?；恼{(diào)節(jié)。因此，我們想知道m(xù)iip是否通過抑制hdac6對rela去乙酰化來保護(hù)rela乙?；癄顟B(tài)。兩步法共免疫沉淀分析顯示hdac6能與flag-rela沉淀物中的miip相互作用，這些沉淀物來自egf處理過的hct116細(xì)胞。而這種相互作用可以被pkc抑制劑廢除。在另一次免疫共沉淀分析中，通過拉出來自egf處理的hct116細(xì)胞的等量的flag-rela，我們發(fā)現(xiàn)rela的水平和洗滌沉淀后與miip結(jié)合的hdac6的量相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)表明存在以rela-miip-hdac6的順序形成的復(fù)合物，其中miip可以防止hdac6直接結(jié)合rela，從而保護(hù)rela不受hdac6介導(dǎo)的去乙?；?。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，不與rela的結(jié)合后，miips303a仍保持與hdac6相互作用，并且不受egf影響，揭示miipser303磷酸化僅負(fù)責(zé)hdac6-miip-rela復(fù)合物形成，miip還可能額外參與hdac6其他方面功能的調(diào)節(jié)。重要的是，在egf處理的hct116細(xì)胞中，重建rmiips303a的表達(dá)所導(dǎo)致的relak310乙?；南抡{(diào)現(xiàn)象可以被shrna所介導(dǎo)的hdac6的減少而阻斷。據(jù)此，chip分析進(jìn)一步顯示，在egf處理過的hct116細(xì)胞中，hdac6的耗盡，可以大大逆轉(zhuǎn)由rmiips303a引起的mmp2和twist的啟動(dòng)子區(qū)域relaac310的聚集。一致地，q-pcr分析顯示hdac6的消耗消除了rmiips303a對egf誘導(dǎo)的mmp2和twist轉(zhuǎn)錄的抑制作用。這些結(jié)果表明磷酸化的miip保護(hù)rela免受hdac6介導(dǎo)的去乙?；?/p>

5、miip-rela相互作用促進(jìn)啟動(dòng)子區(qū)h3k9的乙酰化

請參見圖9-圖10，增加rela的k310乙酰化促進(jìn)下游基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活性，并且通常與基因啟動(dòng)子區(qū)的h3乙酰化的上調(diào)相關(guān)。過表達(dá)野生型h3或h3k9r的hct116細(xì)胞中，賴氨酸突變成精氨酸，chip分析顯示egf刺激h3k9乙?；趍mp2啟動(dòng)子區(qū)域的顯著增加，并可被h3k9r突變消除。同時(shí)，q-pcr分析顯示egf誘導(dǎo)的twist和mmp2上調(diào)被h3k9r表達(dá)極大地抑制。我們接下來檢查在mmp2啟動(dòng)子區(qū)域的miip和rela相互作用是否參與組蛋白h3乙?；恼{(diào)節(jié)。結(jié)果，與野生型對照相比，relak310r或rmiips303a阻斷了mmp2啟動(dòng)子處egf誘導(dǎo)的h3-k9乙酰化。此外，我們發(fā)現(xiàn)rmiips303a(而不是relak310r)誘導(dǎo)的mmp2啟動(dòng)子上組蛋白h3-k9乙?；抡{(diào)在hdac6缺失的hct116細(xì)胞中被阻斷，這表明維持miip介導(dǎo)rela乙?；菃?dòng)子區(qū)h3-k9乙?；奂年P(guān)鍵。

為了進(jìn)一步研究miip-rela調(diào)節(jié)的組蛋白h3乙酰化的機(jī)制，我們用針對p300的抗體進(jìn)行chip分析，p300是熟知的負(fù)責(zé)h3-k9乙?；囊阴＾D(zhuǎn)移酶。結(jié)果，與對照相比，egf促進(jìn)了hct116細(xì)胞中mmp2啟動(dòng)子處的p300聚集，而relak310r或miips303a的過表達(dá)可以抑制這種聚集。與其對h3賴氨酸9乙酰化的影響相一致的是，hdac6不足恢復(fù)了表達(dá)miips303a的hct116細(xì)胞中mmp2啟動(dòng)子處的p300積累。重要的是，p300的消耗大大消除了egf誘導(dǎo)的hct116細(xì)胞中mmp2啟動(dòng)子區(qū)域的h3-k9乙?；?。這些結(jié)果表明miip-rela相互作用是由啟動(dòng)子區(qū)p300介導(dǎo)的h3-k9乙?；璧?。

6、結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后與miipser303磷酸化相關(guān)

請參見圖11，為了確定miips303磷酸化是否促進(jìn)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，用表達(dá)有活化egfrviii突變體的hct116細(xì)胞為載體，分別穩(wěn)定表達(dá)wtrmiip，rmiips303a和rmiips303a+hdac6shrna的細(xì)胞，將這些細(xì)胞經(jīng)由裸鼠經(jīng)脾內(nèi)注射，構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移小鼠模型。結(jié)果，具有wtmiip表達(dá)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。相比之下，miips303a的表達(dá)顯著地廢除了其肝轉(zhuǎn)移能力。然而，miips303a抑制的肝轉(zhuǎn)移能力被降低hdac6的表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)。

為了檢查pkcε介導(dǎo)的miips303磷酸化的臨床作用，我們在182個(gè)結(jié)直腸癌患者標(biāo)本的切片中進(jìn)行了免疫組化染色分析。結(jié)果，miips303磷酸化在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中表達(dá)，但很少在相鄰的正常結(jié)腸直腸細(xì)胞中表達(dá)。此外，miips303磷酸化水平與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。值得注意的是miips303磷酸化表達(dá)高的腸癌患者具有比那些不表達(dá)或者低表達(dá)miips303磷酸化的患者總生存期更短。這些結(jié)果表明pkcε依賴性miips303磷酸化在人類結(jié)直腸癌的臨床生物學(xué)行為中重要的指示性作用。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。