背景技術(shù)：

可以使用例如基于熱循環(huán)的方法(例如聚合酶鏈反應(yīng)(pcr))或等溫方法(例如環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增)來擴(kuò)增核酸分子?？稍诤怂岱肿訑U(kuò)增的同時或之后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。這可以允許鑒定感興趣的核酸序列，如單核苷酸多態(tài)性(snp)、序列突變(包括例如缺失、插入、復(fù)制和易位)、罕見核酸分子/序列和樣品中其他感興趣的序列。此外，可以使用核酸擴(kuò)增來制備用于核酸測序的核酸分子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

盡管目前存在可用于核酸擴(kuò)增和序列鑒定的方法和系統(tǒng)，但各種限制與這類方法相關(guān)聯(lián)。一些核酸序列鑒定方法是昂貴的，并且可能不會在預(yù)期應(yīng)用所需的時間框架內(nèi)和/或準(zhǔn)確度下足夠快速地生成序列信息。在此認(rèn)識到對能夠進(jìn)行序列鑒定的用于鑒定核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的改進(jìn)方法存在需求。

本公開內(nèi)容提供了用于容易地測定生物樣品中靶核酸序列或分子的存在或不存在的系統(tǒng)和方法。在一些實施方案中，可以在不獲得靶核酸分子的核酸序列的情況下從信號(例如，電流或其變化)的連續(xù)測量檢測靶核酸分子。

本公開內(nèi)容的一方面提供了一種在具有或疑似具有靶核酸分子的樣品中測定靶核酸分子的存在的方法，該靶核酸分子在該靶核酸分子的末端與標(biāo)簽偶聯(lián)。所述方法包括(a)促使樣品流過鄰近或靠近電極而設(shè)置的膜中的至少一個納米孔，該電極適于在靶核酸分子移動穿過所述至少一個納米孔時檢測電流或其變化，其中所述移動花費的停留時間長于當(dāng)靶核酸分子不與所述標(biāo)簽偶聯(lián)時，靶核酸分子移動穿過所述至少一個納米孔所花費的停留時間；(b)在促使所述樣品流過所述至少一個納米孔時，用所述電極測量電流或其變化；以及(c)根據(jù)(b)中測得的電流或其變化檢測所述樣品中的靶核酸分子，從而測定所述樣品中靶核酸分子的存在。

在一些實施方案中，所述標(biāo)簽是核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少5個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少10個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少20個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。

在一些實施方案中，該標(biāo)簽是包含可檢測標(biāo)記的分子。例如，該標(biāo)簽分子可以選自熒光素亞酰胺(fam)和六氯熒光素(hex)。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是多肽。在一些實施方案中，該標(biāo)簽不是光學(xué)可檢測的。

在一些實施方案中，該標(biāo)簽在高于或等于80℃的溫度下是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，該溫度高于或等于約85℃。在一些實施方案中，該溫度高于或等于約90℃。在一些實施方案中，該溫度高于或等于約94℃。

在一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括，在上文提及的步驟(a)之前進(jìn)行以下步驟：(i)提供反應(yīng)混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作為靶核酸分子的前體的生物樣品，與該模板核酸分子互補(bǔ)的至少一種引物，和聚合酶，以及(ii)在產(chǎn)生所述樣品中的靶核酸分子的條件下使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實施方案中，所述標(biāo)簽與所述至少一種引物偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述樣品包含靶核酸分子，并且其中該靶核酸分子是作為所述擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的多個拷貝中的拷貝。在一些實施方案中，所述引物是通用引物、人工引物或肽核酸。在一些實施方案中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)。在一些實施方案中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是等溫擴(kuò)增。在一些實施方案中，該等溫擴(kuò)增是環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(lamp)。在一些實施方案中，所述至少一種引物包括至少兩種引物。

在一些實施方案中，上文提及的步驟(b)包括測量電流變化，該變化指示所述靶核酸分子的存在。在一些實施方案中，該電流變化是電流相對于時間的一階導(dǎo)數(shù)(firstmomentofcurrentwithtime)。

在一些實施方案中，在促使所述樣品流過所述至少一個納米孔之后測量電流。在一些實施方案中，所述標(biāo)簽與靶核酸分子不可逆地偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述至少一個納米孔具有約0.5納米(nm)至30nm的橫截面尺寸。在一些實施方案中，該橫截面尺寸為約2nm至15nm。

在一些實施方案中，所述膜是固態(tài)膜。在一些實施方案中，該固態(tài)膜包含半導(dǎo)體或非金屬。在一些實施方案中，該固態(tài)膜包含選自碳、硅、鍺和砷化鎵的材料。在一些實施方案中，該固態(tài)膜由石墨烯形成。

在一些實施方案中，所述膜是脂雙層。在一些實施方案中，所述至少一個納米孔是所述膜中的成孔蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，該成孔蛋白質(zhì)是α溶血素或mspa孔蛋白。在一些實施方案中，所述促使包括跨所述至少一個納米孔施加電位。在一些實施方案中，該電位是可逆的。在一些實施方案中，該電位相對于參比為約1v至10v。

在一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括跨所述至少一個納米孔施加至少一個電位脈沖，以將靶核酸分子引導(dǎo)至和/或穿過所述至少一個納米孔。在一些實施方案中，所述至少一個納米孔鄰近或靠近附加電極。在一些實施方案中，靶核酸分子通過以下步驟進(jìn)行檢測：(i)在所述樣品流過至少一個納米孔時測量電流或其變化，以及(ii)將該電流或其變化與參考值進(jìn)行比較。

在一些實施方案中，所述標(biāo)簽在所述標(biāo)簽與所述至少一個納米孔相互作用后增加停留時間。在一些實施方案中，所述至少一個納米孔包括多個納米孔。在一些實施方案中，所述多個納米孔是可單獨尋址的。在一些實施方案中，在所述樣品流過所述至少一個納米孔時，在沒有獲得靶核酸分子的核酸序列的情況下，根據(jù)電流或其變化的連續(xù)測量檢測靶核酸分子。在一些實施方案中，在指示存在靶核酸分子的停留時間時檢測電流或其變化。

在一些實施方案中，靶核酸分子包含至少5個連續(xù)的核苷酸堿基。在一些實施方案中，靶核酸分子包含至少10個連續(xù)的核苷酸堿基。在一些實施方案中，靶核酸分子包含至少20個連續(xù)的核苷酸堿基。

在一些實施方案中，靶核酸分子是單鏈的。在一些實施方案中，靶核酸分子是雙鏈的。在一些實施方案中，靶核酸分子是脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。

另一方面提供了一種用于在具有或疑似具有靶核酸分子的樣品中測定靶核酸分子的存在的系統(tǒng)，該靶核酸分子包含至少5個連續(xù)的核苷酸堿基。所述系統(tǒng)包含：鄰近或靠近電極而設(shè)置的膜中的至少一個納米孔，其中該電極適于在樣品流過所述至少一個納米孔時檢測電流；與所述至少一個納米孔流體連通且適于保持所述樣品的至少一個樣品支持體；以及計算機(jī)處理器，其可操作地耦合至所述電極并被編程為(i)促使所述樣品從所述至少一個樣品支持體流過所述至少一個納米孔，(ii)測量單個核酸分子在所述納米孔中或穿過所述納米孔的停留時間，以及(iii)當(dāng)所述停留時間落入?yún)⒖奸撝抵畠?nèi)時，將所述單個核酸分子鑒定為靶核酸分子。

在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為測量所述單個核酸分子在所述納米孔中或穿過所述納米孔的第一停留時間，并且如果第一停留時間長于當(dāng)靶核酸分子不與標(biāo)簽在靶核酸分子的末端偶聯(lián)時，靶核酸分子在所述至少一個納米孔中或穿過所述至少一個納米孔的第二停留時間，則將所述單個核酸分子鑒定為靶核酸分子。一些實施方案中，該標(biāo)簽是核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少5個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少10個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是具有至少20個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是選自fam和hex的分子。在一些實施方案中，該標(biāo)簽是多肽。在一些實施方案中，該標(biāo)簽不是光學(xué)可檢測的。在一些實施方案中，所述標(biāo)簽在高于或等于80℃的溫度下是穩(wěn)定的。

在一些實施方案中，靶核酸分子包含至少10個連續(xù)的核苷酸堿基。在一些實施方案中，靶核酸分子包含至少20個連續(xù)的核苷酸堿基。

在一些實施方案中，靶核酸分子是單鏈的。在一些實施方案中，靶核酸分子是雙鏈的。在一些實施方案中，靶核酸分子是dna或rna。

在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為在沒有獲得所述單個核酸分子的核酸序列的情況下，將所述單個核酸分子鑒定為靶核酸分子的至少一部分。

在一些實施方案中，所述樣品具有小于1摩爾/升(m)的mg²⁺濃度。在一些實施方案中，該濃度小于0.1m。在一些實施方案中，該濃度小于0.01m。在一些實施方案中，該濃度小于0.001m。

在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為(a)測量電流或其變化，以及(b)根據(jù)該電流或其變化確定停留時間。在一些實施方案中，相對于基線測量電流或其變化。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為在促使所述樣品流過所述至少一個納米孔之后測量電流或其變化。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為在將所述電流或其變化與參考值進(jìn)行比較后確定停留時間。

在一些實施方案中，所述至少一個納米孔具有約0.5納米(nm)至30nm的橫截面尺寸。在一些實施方案中，該橫截面尺寸為約2nm至15nm。

在一些實施方案中，所述膜是脂雙層。在一些實施方案中，所述膜是固態(tài)膜。在一些實施方案中，該固態(tài)膜包含半導(dǎo)體或非金屬。在一些實施方案中，該固態(tài)膜包含選自碳、硅、鍺和砷化鎵的材料。

在一些實施方案中，所述至少一個納米孔是所述膜中的成孔蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，該成孔蛋白質(zhì)是α溶血素或mspa孔蛋白。

在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器被編程為跨所述納米孔施加電位。在一些實施方案中，該電位是可逆的。在一些實施方案中，該電位相對于接地電極為約1v至10v。

在一些實施方案中，所述納米孔鄰近或靠近附加電極。在一些實施方案中，該附加電極是參比電極。

在一些實施方案中，所述至少一個納米孔包括多個納米孔。在一些實施方案中，所述多個納米孔是可單獨尋址的。

在一些實施方案中，所述至少一個納米孔是芯片的一部分。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器是具有所述電極的電路的一部分。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器與具有所述電極的電路分開。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器為專用集成電路(asic)。在一些實施方案中，所述計算機(jī)處理器是移動電子設(shè)備的一部分。

基于僅示出和描述了本發(fā)明的說明性實施方案的以下詳述，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將變得對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。將會認(rèn)識到，本發(fā)明能夠包括其他不同的實施方案，并且能夠在各個明顯的方面對其若干細(xì)節(jié)進(jìn)行更改，所有這些均不背離本公開內(nèi)容。相應(yīng)地，附圖和說明書將被視為在本質(zhì)上是說明性的，而非限制性的。

援引并入

本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均通過引用而并入本文，其程度猶如特別地且單獨地指出每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用而并入。

附圖說明

本發(fā)明的新穎特征在所附的權(quán)利要求書中具體闡述。通過參考以下對利用本發(fā)明原理的說明性實施方案加以闡述的詳細(xì)描述和附圖(本文中也稱為“圖”)，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解，在這些附圖中：

圖1示出了用于檢測靶核酸分子的一般工作流程。

圖2示出了包含具有納米孔的膜的納米孔傳感器。

圖3a示出了包含具有納米孔的膜的納米孔傳感器，以及鄰近該膜的、在其末端具有標(biāo)簽的靶核酸分子；圖3b示出了穿透圖3a的納米孔的靶核酸；圖3c示出了與納米孔或膜相互作用以減慢或停止靶核酸分子穿過該納米孔的流動的標(biāo)簽。

圖4示出了由納米孔傳感器測量的隨時間變化的電流(i)的圖。

圖5示出了被編程或以其他方式被配置用于實現(xiàn)本文提供的方法的計算機(jī)控制系統(tǒng)。

具體實施方式

盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的多個實施方案，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的情況下可想到多種變化、改變和替代。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用本文所述的本發(fā)明實施方案的各種替代方案。

本文所用的術(shù)語“膜”通常是指將至少兩個體積的流體隔開的結(jié)構(gòu)。膜的實例包括但不限于固態(tài)膜和脂雙層。膜可以是有機(jī)膜如脂雙層，或合成膜如由固態(tài)材料(例如，半導(dǎo)體、金屬、半金屬或非金屬)或聚合材料形成的膜。

本文所用的術(shù)語“納米孔”通常是指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。納米孔可設(shè)置成鄰近或靠近傳感電路或與傳感電路耦合的電極，例如，互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(cmos)或場效應(yīng)晶體管(fet)電路。在一些實例中，納米孔具有0.1納米(nm)至約1000nm數(shù)量級的特征尺寸(例如橫截面、寬度或直徑)。一些納米孔是蛋白質(zhì)。α溶血素是蛋白質(zhì)納米孔的一個實例。

本文所用的術(shù)語“核酸”通常是指包含一個或多個核酸亞單位的分子。核酸可包含一個或多個選自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鳥嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其變體的亞單位。核苷酸可包含a、c、g、t或u，或其變體，包括但不限于肽核酸(pna)。核苷酸可包含能夠摻入到生長中的核酸鏈內(nèi)的任何亞單位。這樣的亞單位可以是a、c、g、t或u，或?qū)τ谝粋€或多個互補(bǔ)a、c、g、t或u是特異性的或與嘌呤(即，a或g，或其變體)或嘧啶(即，c、t或u，或其變體)互補(bǔ)的任何其他亞單位。亞單位可以使單個核酸堿基或成組堿基(例如，aa、ta、at、gc、cg、ct、tc、gt、tg、ac、ca或其尿嘧啶對應(yīng)物)能夠得到解析。在一些示例中，核酸是脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，或其衍生物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。核酸可包含一種或多種修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。

本文所用的術(shù)語“聚合酶”通常是指能夠催化聚合反應(yīng)的任何酶。聚合酶的示例包括但不限于核酸聚合酶、轉(zhuǎn)錄酶或連接酶。聚合酶可以是聚合反應(yīng)酶。

本文所用的術(shù)語“標(biāo)簽”通常是指與核酸分子在其末端偶聯(lián)(例如，附接)的任何原子或分子物質(zhì)。標(biāo)簽可以與核酸分子的末端直接偶聯(lián)或通過連接體間接偶聯(lián)。標(biāo)簽可以是核酸分子(例如，多核苷酸)、多肽、蛋白質(zhì)(例如，酶)、聚合材料或可與納米孔或膜相互作用以減慢核酸分子穿過該納米孔的行進(jìn)的其他部分。例如，該標(biāo)簽可以是具有至少5、10或20個連續(xù)核苷酸堿基的核酸分子。該標(biāo)簽可以是質(zhì)量標(biāo)簽。該標(biāo)簽可以是熒光染料或熒光團(tuán)。標(biāo)簽的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、熒光素亞酰胺(fam)、六氯熒光素(hex)、生物素、四氯熒光素(tet)、四甲基羅丹明(tamra)、花青染料(例如cy3或cy5)、磺基羅丹明101酰氯(德克薩斯紅)、黑洞猝滅劑(bhq)和4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸(dabcyl)。該標(biāo)簽可以不是光學(xué)可檢測的。

所述標(biāo)簽的橫截面尺寸可以大于納米孔的橫截面尺寸。在一些情況下，標(biāo)簽與納米孔或膜相互作用以減慢核酸分子穿過該納米孔的行進(jìn)。該相互作用可以是可逆的或不可逆的。

本文所用的術(shù)語“受試者”通常是指動物或其他生物體，如哺乳動物物種(例如，人)、禽類(例如，鳥)物種或植物。哺乳動物包括但不限于鼠類、猿類、人類、農(nóng)場動物、運(yùn)動動物和寵物。受試者可以是患有或疑似患有某種疾病或有患該疾病的傾向的個體，或者需要治療或疑似需要治療的個體。受試者可以是患者。

本文所用的術(shù)語“樣品”通常是指含有或疑似含有核酸分子的任何樣品。例如，受試者樣品可以是含有一種或多種核酸分子的生物樣品。該生物樣品可從受試者的身體樣品獲得(例如，提取或分離)，該身體樣品可選自血液(例如，全血)、血漿、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、糞便和淚液。該身體樣品可以是受試者的體液或組織樣品(例如，皮膚樣品)。在一些示例中，該樣品獲自受試者的無細(xì)胞體液，如全血。在這樣的情況下，該樣品可包含無細(xì)胞dna和/或無細(xì)胞rna。在一些其他示例中，該樣品是環(huán)境樣品(例如，土壤、廢物、環(huán)境空氣等)、工業(yè)樣品(例如，來自任何工業(yè)過程的樣品)和食物樣品(例如，奶制品、植物產(chǎn)品和肉制品)。

本文所用的術(shù)語“基因組變異”通常是指受試者的核酸樣品或基因組中的變體或多態(tài)性。變體的實例包括單核苷酸多態(tài)性、單核苷酸變體、插入、缺失、置換、重復(fù)、可變長度串聯(lián)重復(fù)、側(cè)翼序列、結(jié)構(gòu)變體、顛換、重排和拷貝數(shù)變異。

測定靶核酸分子的存在

本公開內(nèi)容的一方面提供了用于測定樣品中靶核酸分子的存在的方法和系統(tǒng)。靶核酸分子可以具有用于預(yù)期應(yīng)用的感興趣的核酸序列，該應(yīng)用包括但不限于物種鑒定、環(huán)境測試、法醫(yī)分析以及一般研究和疾病表征。

可使用傳感器檢測樣品中靶核酸分子的存在。該傳感器可以具有被配置用于檢測電流或電流隨時間的變化的一個或多個納米孔的陣列?？梢酝ㄟ^測量電流(c)或電流隨時間的變化(或電流相對于時間的一階導(dǎo)數(shù)，dc/dt)，并且在一些情況下通過將這樣的測量值與參考值(或基線)進(jìn)行比較來檢測靶核酸分子。

樣品可以包含一種或多種分子，其中至少一些分子可以是靶核酸分子。任何分子在納米孔中或穿過納米孔的停留時間(或滯留時間)可以指示樣品中靶核酸分子的存在。在一些情況下，靶核酸分子具有可檢測的在納米孔中的停留時間，其可以大于樣品中的其他分子。通過測量電流或電流隨時間的變化并確定停留時間，可在樣品中檢測靶核酸分子(如果存在)。

可以使用在靶核酸分子的末端與靶核酸分子偶聯(lián)(例如附接)的標(biāo)簽來增加靶核酸分子的停留時間。該標(biāo)簽可以減慢靶核酸分子穿過納米孔的流動。該標(biāo)簽可以是蛋白質(zhì)如酶、多核苷酸或可與納米孔或膜相互作用以減少或停止靶核酸分子穿過該納米孔的流動的其他部分。該標(biāo)簽可以在該標(biāo)簽與納米孔或膜相互作用后增加停留時間。例如，該標(biāo)簽的橫截面尺寸可以大于納米孔的橫截面尺寸。偶聯(lián)有標(biāo)簽的靶核酸分子被引導(dǎo)穿過納米孔，并且無法流過該納米孔。這減少或停止了靶核酸分子穿過該納米孔的流動。。

標(biāo)簽與納米孔或膜之間的相互作用可以是可逆的，使得在施加刺激后，該相互作用可被打破或以其他方式解除，并且靶核酸分子可以離開納米孔。這樣的刺激可以是電壓，如電壓脈沖(例如，10v脈沖)或壓降。

靶核酸分子可以是脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其變體。例如，可以通過使靶核酸樣品斷裂成片段，對靶核酸樣品進(jìn)行處理。靶核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。

靶核酸分子可以包含連續(xù)的核苷酸。在一些實例中，靶核酸分子包含至少5、10、30、40、50、100、200、300、400、500或1000個核苷酸。

靶核酸分子可以是樣品中的模板核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些情況下，可以通過從受試者獲取生物樣品并使該樣品經(jīng)歷核酸擴(kuò)增以擴(kuò)增模板核酸分子的至少一部分來檢測靶核酸分子。如果存在感興趣的核酸序列，那么可在被選擇用于擴(kuò)增模板核酸分子或其一部分的條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。如果存在感興趣的核酸序列，那么核酸擴(kuò)增可以產(chǎn)生一種或多種擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物。這樣的產(chǎn)物可以包括靶核酸分子。

模板核酸分子可以是dna、rna或其變體。例如，可以通過使模板核酸樣品斷裂成片段，對模板核酸樣品進(jìn)行處理。模板核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。

一旦樣品經(jīng)歷了核酸擴(kuò)增，即可檢測到靶核酸分子。這可以使用本文其他地方描述的傳感器來進(jìn)行?？稍诓贿M(jìn)行核酸測序，例如不獲得樣品中靶核酸分子或其他核酸分子的核酸序列的情況下檢測靶核酸分子。例如，可以在不進(jìn)行合成測序技術(shù)(例如，illumina、pacificbiosciencesofcalifornia、genia或iontorrent)的情況下確定靶核酸分子的存在?？稍诓贿B續(xù)測量指示靶核酸分子的至少1、2、3、4或5個核苷酸的信號(例如，光信號或電流)的情況下確定靶核酸分子的存在。

圖1示出了樣品處理的工作流程。在第一操作101中，制備生物樣品以供檢測。例如，可從受試者的體液獲取生物樣品，并且可從體液中分離核酸分子。該核酸分子可以是用于后續(xù)分析的模板核酸分子。在一些情況下，對該核酸分子進(jìn)行處理以產(chǎn)生模板核酸分子，如進(jìn)行片段化以產(chǎn)生多個模板核酸分子。

模板核酸分子隨后可以經(jīng)受核酸擴(kuò)增條件以擴(kuò)增(即，生成一個或多個拷貝)模板核酸分子。模板核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物可以是用于后續(xù)分析的靶核酸分子。

在一些情況下，提供一種反應(yīng)混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作為靶核酸分子的前體的生物樣品。該反應(yīng)混合物還可以包含與模板核酸分子互補(bǔ)的至少一種引物和聚合酶。所述至少一種引物可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50種引物。每種引物可以具有為了特定類型的分析，如檢測受試者中的給定疾病或基因組變異而選擇的序列。

引物可以與一個標(biāo)簽或多個標(biāo)簽偶聯(lián)。這樣的偶聯(lián)可以采用直接附接或通過連接體附接的方式。例如，引物可以附接至生物素、fam或hex部分。這可以允許用引物擴(kuò)增模板核酸分子，以產(chǎn)生作為擴(kuò)增產(chǎn)物的靶核酸分子。靶核酸分子可在靶核酸分子的末端并入標(biāo)簽。然而，作為替代方案，引物不與標(biāo)簽偶聯(lián)，而是在隨后的時間點提供標(biāo)簽。在一些實例中，該引物是人工引物，如鎖定核酸(lna)或肽核酸(pna)。該引物可以是通用引物。

接下來，可在產(chǎn)生樣品中的靶核酸分子的條件下使反應(yīng)混合物經(jīng)歷核酸擴(kuò)增反應(yīng)。靶核酸分子可以是模板核酸分子的多個拷貝中的拷貝，該拷貝是該核酸擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述反應(yīng)混合物可以包含完成核酸擴(kuò)增(例如，dna擴(kuò)增、rna擴(kuò)增)所需的試劑，這類試劑的非限制性示例包括對靶rna或靶dna具有特異性的引物組、由rna的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的dna、dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，用于rna的逆轉(zhuǎn)錄)、合適的緩沖液(包括兩性離子緩沖液)、輔因子(例如，二價和單價陽離子)、dntp以及其他酶(例如，尿嘧啶-dna糖基化酶(ung)等)。在一些情況下，反應(yīng)混合物還可包含一種或多種報道劑(reporteragent)。該反應(yīng)混合物還可以包含適合于促進(jìn)核酸擴(kuò)增的酶，如聚合化酶(本文中也稱為“聚合酶”)。該聚合酶可以是用于擴(kuò)增dna的dna聚合酶?？梢允褂萌魏魏线m的dna聚合酶，包括可商購的dna聚合酶。dna聚合酶可以能夠以模板結(jié)合的方式將核苷酸摻入到dna鏈中。dna聚合酶的非限制性示例包括taq聚合酶、tth聚合酶、tli聚合酶、pfu聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、ex-taq聚合酶、la-taq聚合酶、expand聚合酶、sso聚合酶、poc聚合酶、pab聚合酶、mth聚合酶、pho聚合酶、es4聚合酶、tru聚合酶、tac聚合酶、tne聚合酶、tma聚合酶、tih聚合酶、tfi聚合酶、platinumtaq聚合酶、hi-fi聚合酶、tbr聚合酶、tfl聚合酶、pfutubo聚合酶、pyrobest聚合酶、pwo聚合酶、kod聚合酶、bst聚合酶、sac聚合酶、klenow片段，以及它們的變體、修飾的產(chǎn)物和衍生物。對于某種熱啟動聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分鐘至10分鐘的變性步驟，這根據(jù)不同的聚合酶可能會改變熱曲線。

在一些情況下，dna樣品可以由rna樣品生成。這可以采用逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)，該逆轉(zhuǎn)錄酶可以包括在與rna模板結(jié)合時能夠?qū)⒑塑账釗饺氲絛na鏈中的酶。可以使用任何合適的逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的非限制性示例包括hiv-1逆轉(zhuǎn)錄酶、m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶、amv逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，以及它們的變體、修飾的產(chǎn)物和衍生物。

核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以包括一個或多個用于生成擴(kuò)增產(chǎn)物的引物延伸反應(yīng)。在pcr中，例如，引物延伸反應(yīng)可以包括以下的循環(huán)：將反應(yīng)混合物在變性溫度下溫育一段變性持續(xù)時間，以及將反應(yīng)混合物在延伸溫度下溫育一段延伸持續(xù)時間。變性溫度可根據(jù)例如所分析的具體生物樣品、生物樣品中靶核酸的具體來源(例如，病毒顆粒、細(xì)菌)、所使用的試劑和/或所需的反應(yīng)條件而變化。例如，變性溫度可為約80℃至約110℃。在一些示例中，變性溫度可為約90℃至約100℃。在一些示例中，變性溫度可為約90℃至約97℃。在一些示例中，變性溫度可以為約92℃至約95℃。在另外其他的示例中，變性溫度可為至少約80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

作為替代方案，在等溫擴(kuò)增中，溫度可以是固定的(即，不循環(huán))，并且可以采用引物組和除了復(fù)制活性之外還具有較高鏈置換活性的聚合酶來生成擴(kuò)增產(chǎn)物?？赡苓m合用于等溫擴(kuò)增的聚合酶的示例為bst聚合酶。可以將溫度固定在約50℃至80℃，或60℃至65℃。在環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(lamp)中，例如，可以采用聚合酶和具有至少2、3、4或5種引物的引物組來擴(kuò)增模板核酸分子。

在核酸擴(kuò)增期間或之后，可向反應(yīng)混合物中提供標(biāo)簽。例如，在核酸擴(kuò)增中使用的引物可以與標(biāo)簽偶聯(lián)，例如在末端偶聯(lián)。例如，該標(biāo)簽可以通過直接附接而直接附接至或經(jīng)由連接體附接至引物的5’端。在一個實例中，引物的5’端附接至生物素、fam或hex部分。這可以允許用引物擴(kuò)增模板核酸分子，以產(chǎn)生作為擴(kuò)增產(chǎn)物的靶核酸分子，該靶核酸分子在該靶核酸分子的末端并入標(biāo)簽。該標(biāo)簽可以允許使用本公開內(nèi)容的納米孔傳感器來檢測靶核酸分子。在一些情況下，引物偶聯(lián)至多個標(biāo)簽，如至少2、3、4或5個標(biāo)簽。

繼續(xù)參見圖1，在第二操作102中，在使模板核酸分子經(jīng)歷核酸擴(kuò)增之后，可以確定作為擴(kuò)增產(chǎn)物的靶核酸分子的存在。這可以通過檢測指示存在靶核酸分子的一種或多種信號來實現(xiàn)，如在使用本文其他地方描述的傳感器測量電流或電流隨時間的變化時的靶核酸分子的停留時間。接下來，在第三操作103中，對所述一種或多種信號進(jìn)行分析以確定靶核酸分子是存在還是不存在。還可以對所述一種或多種信號進(jìn)行分析以確定靶核酸分子的相對量。

模板核酸分子的擴(kuò)增和靶核酸分子的檢測可以在同一系統(tǒng)如器皿中進(jìn)行。在一些情況下，該系統(tǒng)是配置用于核酸擴(kuò)增的管，如eppendorfpcr管。作為替代方案，擴(kuò)增和檢測在分開的系統(tǒng)中進(jìn)行。例如，擴(kuò)增在eppendorfpcr管中進(jìn)行，而檢測在具有納米孔傳感器的分開的芯片中進(jìn)行。

納米孔傳感器

本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于檢測靶核酸分子的納米孔傳感器。納米孔傳感器可以包含膜中的一個或多個納米孔的陣列。每個納米孔可設(shè)置成鄰近測量電極，該測量電極被配置用于檢測電流或電流隨時間的變化，在一些情況下參考參比電極進(jìn)行檢測。

所述陣列可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、1000、10000、100000或1000000個傳感器。每個傳感器可以包含至少1、2、3、4或5個納米孔。每個傳感器可以是可單獨尋址的。納米孔的密度可以是至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰或10¹¹個納米孔/平方毫米(mm²)。

圖2示出了納米孔傳感器200，其包含與導(dǎo)電溶液202(例如鹽溶液)接觸的第一電極201。傳感器200包含接近、鄰近或靠近膜205中的納米孔204的第二電極203。第二電極203與具有用于信號(例如電流或電流變化)測量的電路的電路元件206相鄰。膜205與至少部分由壁207限定的室208(例如阱(well))相鄰。壁207可由半導(dǎo)體如氧化硅或氧化鋁(例如sio2)形成。作為替代方案，壁207由聚合材料形成。在一些實例中，壁207是可用于核酸擴(kuò)增的管的一部分。

納米孔傳感器200可以在被配置用于核酸擴(kuò)增的容器(例如管)如eppendorfpcr管中。該容器可以包含用于模板核酸分子的核酸擴(kuò)增的頂部室和用于靶核酸分子的后續(xù)檢測的底部室。該容器可以是一次性的和/或可重復(fù)使用的。

作為替代方案，納米孔傳感器200可以是包含樣品支持體(sampleholder)的芯片的一部分。該樣品支持體可以包含具有或疑似具有靶核酸分子的樣品。該芯片可以具有用于信號檢測和處理的板上電子器件(例如計算機(jī)處理器)。作為替代方案，該板上電子器件可以是芯片外的，如在與芯片相鄰并與芯片通信的計算機(jī)系統(tǒng)中。該芯片可以是一次性的和/或可重復(fù)使用的。電路元件206可以包含使納米孔傳感器200與計算機(jī)系統(tǒng)通信的電流流動路徑。

例如，納米孔傳感器200是可插入閱讀器(未示出)中并可從閱讀器中移除的容器或芯片的一部分。閱讀器可以包含允許檢測具有或疑似具有靶核酸分子的樣品中的靶核酸分子的計算機(jī)處理器。作為替代方案，計算機(jī)處理器在與閱讀器分開并與其通信的計算機(jī)系統(tǒng)中。閱讀器可以包含將樣品引導(dǎo)至納米孔傳感器的流體流動系統(tǒng)(例如，泵和致動器)。

納米孔傳感器200可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、1000、10000、100000或1000000個傳感器的陣列。每個傳感器可以包含至少1、2、3、4或5個納米孔。

膜205可以是固態(tài)膜。膜205可由半導(dǎo)體或非金屬形成。在一些實例中，膜205由選自碳、硅、鍺和砷化鎵的材料形成。例如，膜205可由石墨烯形成。

作為替代方案，膜205可以是脂雙層。該脂雙層可以包含兩層脂質(zhì)分子。該脂雙層可以包含具有親水頭和各兩個疏水尾的磷脂。當(dāng)暴露于水時，這樣的磷脂可自身排列成兩層薄片(雙層)，并且其所有尾均指向薄片的中心。該雙層的中心可以含有少量水至無水，并排除分子。該脂雙層的外表面可以是親水性的，而該脂雙層的內(nèi)部可以是疏水性的。

納米孔204可以是提供穿過膜205的通道的孔。作為替代方案，納米孔204可以是膜205中的成孔蛋白質(zhì)。這樣的替代方案可在膜205為脂雙層的情況下使用。該成孔蛋白質(zhì)可以是α溶血素或mspa孔蛋白。

納米孔204可以具有允許流體流過納米孔204的橫截面尺寸。該橫截面尺寸可以允許核酸樣品流過納米孔204。該橫截面尺寸可以為約0.5納米(nm)至30nm，或1nm至20nm，2nm至15nm，3nm至10nm，或2.5nm至3.4nm。

納米孔204可以具有各種形狀和尺寸。例如，納米孔204可以具有矩形、計時沙漏形、凹形、凸形、圓錐形或部分形狀或其組合。納米孔204可以具有跨越膜205的長度。在一些情況下，納米孔204具有約10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的長度，并且膜205具有約10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的厚度。納米孔204的長度可與膜205的厚度相同或不同。例如，納米孔204可以跨越膜205厚度的至少約50％、60％、70％或80％。

膜205包含反側(cè)(transside)和順側(cè)(cisside)。順側(cè)鄰近第一電極201。在使用過程中，具有偶聯(lián)至末端的標(biāo)簽的靶核酸分子被從膜205的順側(cè)引導(dǎo)至反側(cè)。順側(cè)與反側(cè)相對。該標(biāo)簽可具有減慢或停止靶核酸分子穿過納米孔的流動的尺寸，或者被配置為與納米孔204或膜205相互作用以減慢或停止靶核酸分子穿過納米孔204的流動。例如，該標(biāo)簽大于納米孔204的橫截面尺寸。作為另一實例，該標(biāo)簽與納米孔204的通道或邊緣的一部分相互作用，以減慢或停止靶核酸分子穿過納米孔204的流動。

溶液202可以具有電解質(zhì)。該電解質(zhì)可以包括一種或多種鹽，如nacl、kcl或agcl。溶液202可以具有允許使用第一電極201和第二電極203檢測電流的鹽濃度。在一個實例中，該濃度可以為約0.1摩爾/升(m)至10m，或2m至8m。作為另一個實例，該濃度可以為0.1mm至10mm，或0.5mm至5mm。

溶液202可以包含用于pcr的緩沖液。例如，溶液202可以包含50mm至200mmtris-hcl(例如，100mmtris-hcl)、200mm至1000mmkcl(例如，500mmkcl)和0.5mm至5mmmgcl2。

第一電極201和第二電極203可由一種或多種金屬形成。在一些情況下，第一電極201和第二電極203由au、ag或pt形成。例如，第一電極201由pt形成，第二電極203由ag形成。作為替代方案，第一電極201由pt形成，第二電極203由agcl形成。

在一些情況下，第二電極203由允許在檢測期間電化學(xué)消耗電極203的材料形成。例如，第二電極203可由agcl形成。在傳感器200的操作期間，agcl→ag⁺+cl^-?？梢酝ㄟ^對第二電極203施加反電位以使agcl沉積到第二電極203上從而逆轉(zhuǎn)消耗來逆轉(zhuǎn)這一情況。

在一些情況下，通過相對于第一電極201對第二電極203施加直流(dc)電壓來操作傳感器200。電壓范圍可以為0.5伏(v)至20v，或1v至10v。在這樣的直流操作中，電壓可以逆轉(zhuǎn)(即，v→-v→v)。作為替代方案，通過相對于第一電極201對第二電極203施加交流(ac)電壓來操作傳感器。電壓范圍可以為0.5v至20v，或1v至10v。

在傳感器200的操作期間，可在第一電極201與第二電極203之間施加電壓時跨納米孔204提供電場。該電場可被配置為將溶液202中的靶核酸分子引導(dǎo)至納米孔204。該電場可以幫助靶核酸分子靠近并穿過納米孔204。作為替代方案或除此之外，可以跨納米孔204提供壓降，這可以幫助靶核酸分子靠近并穿過納米孔204。在一些情況下，壓力衍生的力超過相對的電壓衍生的力。可以使用壓降和電場的組合來調(diào)節(jié)靶核酸分子的運(yùn)動。例如，可通過在從膜205的反側(cè)到順側(cè)施加電場、同時從順側(cè)到反側(cè)施加壓降，使靶核酸分子的運(yùn)動減慢。作為替代方案，可通過在從膜205的順側(cè)到反側(cè)施加電場、同時從順側(cè)到反側(cè)施加壓降，使靶核酸分子的運(yùn)動加速。

在一些情況下，對壓力衍生的力和電壓衍生的力進(jìn)行平衡，以調(diào)節(jié)(例如，增加或減少)靶核酸分子穿過納米孔204的移位時間(或停留時間)?？梢越?jīng)由關(guān)系式qe＝fmech從分子上的力平衡推導(dǎo)出電荷，其中“e”是納米孔204中的電場，其可以是施加在電極201與203之間的電壓的函數(shù)，而fmech是來自所施加的壓力和/或穿過納米孔204的流體流動在靶核酸分子上的機(jī)械力的總和。

在傳感器200的使用期間，電路206提供跨第一電極201和第二電極203的電位。溶液202中的電解質(zhì)可以通過納米孔204轉(zhuǎn)運(yùn)溶液202中的離子。在使用期間，第二電極203可以經(jīng)歷氧化反應(yīng)以在溶液202中產(chǎn)生第二電極203的離子，該離子可被引導(dǎo)穿過納米孔移向第一電極201?？梢允褂萌芤?02中的離子，在第一電極201處發(fā)生還原反應(yīng)。

在溶液202流過納米孔204時，可以使用第一電極201和第二電極203檢測可測量的電流。該電流可以隨流過納米孔204的流速的變化而變化。例如，在用靶核酸分子阻塞納米孔204后，流速可以改變，這可以導(dǎo)致由第一電極201和第二電極203所測得的電流的變化。這樣的電流變化可與阻塞的尺寸和時間相關(guān)。阻塞納米孔204更長時間段的分子可在更長的時間段產(chǎn)生電流變化，這可與分子在納米孔中的停留時間成比例。電流變化的強(qiáng)度可與阻塞的尺寸直接相關(guān)。例如，與在納米孔204中或流過納米孔204的較小分子相比，在納米孔204中或流過納米孔204的較大分子可以產(chǎn)生更大的電流變化。

如果靶核酸分子存在于溶液中，它可以以某種方式制備成具有與之偶聯(lián)的標(biāo)簽，這增加了靶核酸分子在納米孔204中的停留時間。停留時間的這種增加可賦予電流(c)或電流變化(dc/dt)隨時間的變化，這可以通過電極201和203來檢測。

電路206可以逆轉(zhuǎn)跨第一電極201和第二電極203的電位的方向。這可以幫助逆轉(zhuǎn)第二電極203的任何消耗。例如，為了在第二電極上沉積來自溶液202的離子，可以逆轉(zhuǎn)跨第一電極201和第二電極203的電位，這可在第二電極203處提供還原反應(yīng)(例如，ag⁺+cl^-→agcl)。

本公開內(nèi)容的納米孔傳感器可用于檢測靶核酸分子。通過增加靶核酸分子在納米孔傳感器的納米孔中、與之鄰近或靠近的停留時間，從而影響流體穿過納米孔的流動，可以促進(jìn)這樣的檢測。這可在納米孔傳感器的電極處生成可測量的電流或電流變化?？梢允褂门c靶核酸分子的末端偶聯(lián)的標(biāo)簽來增加靶核酸分子的停留時間。

圖3a-3c示意性地示出了使用納米孔傳感器300對靶核酸分子的檢測。參見圖3a，納米孔傳感器300包含具有納米孔302的膜301。標(biāo)簽303附接至連接體304，連接體304附接至靶核酸分子305。靶核酸分子305被設(shè)置在膜301的順側(cè)處靠近膜301。靶核酸分子305包含連續(xù)的核酸亞單位306(或核苷酸)。納米孔傳感器300包含電極(未示出)，該電極可如本文其他地方所述。通過在電極之間施加電位(v)——這可以提供將靶核酸分子305引導(dǎo)至納米孔302的電場，靶核酸分子305可被引導(dǎo)至納米孔302。

標(biāo)簽303可以是被選擇為以降低靶核酸分子蛋白質(zhì)穿過納米孔302的流速的方式與納米孔302相互作用的部分。例如，標(biāo)簽303是生物素、fam或hex部分?？梢赃x擇溶液的條件，使得該部分的活性基本不受影響。標(biāo)簽303可以在高于或等于80℃、85℃、90℃或94℃的溫度下是穩(wěn)定的。在一些情況下，標(biāo)簽303在高于或等于80℃、85℃、90℃或94℃的溫度下與靶核酸分子305穩(wěn)定地偶聯(lián)。

具有標(biāo)簽303、連接體304和靶核酸分子305的溶液可以具有經(jīng)選擇使得標(biāo)簽303和連接體304的活性基本不受影響的條件。例如，標(biāo)簽303和連接體304在擴(kuò)增條件下可以不具有降低的或大幅減弱的活性。

在一些實例中，標(biāo)簽303是蛋白質(zhì)，例如酶。該酶可以是聚合酶或分子馬達(dá)。該酶可以具有降低的活性或不具有酶促活性?？梢赃x擇溶液的條件，使得該酶具有降低的活性或不具有酶促活性。該條件可以選自樣品的鹽(或離子)濃度和溫度。

連接體304可以是包含一個或多個核酸或氨基酸部分的分子，如多核苷酸或多肽。連接體304可以是聚合物。在一些情況下，連接體304是聚合物，如肽、核酸、聚乙二醇(peg)。連接體304可以具有任何合適的長度。例如，連接體304可以具有至少約1nm、5nm或10nm的長度。連接體304可以是剛性的或柔性的。

納米孔302可具有約0.5納米(nm)至30nm，或1nm至20nm，2nm至15nm，3nm至10nm，或2.5nm至3.4nm的橫截面尺寸(例如直徑)。標(biāo)簽303可具有比納米孔302的橫截面尺寸更大的橫截面尺寸(例如直徑或有效直徑)。作為替代方案，標(biāo)簽303具有比納米孔302更小的橫截面尺寸，但標(biāo)簽303被配置為與納米孔302相互作用，以減少或停止靶核酸分子305穿過納米孔302的流動。例如，該標(biāo)簽可以小于納米孔302，但包括與膜301或納米孔302中的攜帶電荷的基團(tuán)相互作用的攜帶電荷的基團(tuán)，這些基團(tuán)被類似地極化(例如，均帶正電荷或帶負(fù)電荷)，使得這些攜帶電荷的基團(tuán)之間的相互作用提供了減少或停止靶核酸分子305穿過納米孔302的流動的排斥相互作用。

在圖3b中，如通過在電極之間施加電位，靶核酸分子305被引導(dǎo)穿過納米孔302。因為靶核酸分子305的橫截面尺寸小于納米孔302的橫截面尺寸，所以靶核酸分子305從膜301的順側(cè)向該膜的反側(cè)(或反之亦然，在某些情況下)流過納米孔302。在圖3c中，標(biāo)簽303與膜301或納米孔302相互作用。這樣的相互作用可以減慢或停止靶核酸分子305穿過納米孔302的流動，這增加了靶核酸分子305在納米孔302中的停留時間?？梢酝ㄟ^電極將增加的停留時間檢測為可測量的電流(c)或電流變化(dc/dt)隨時間的變化。在標(biāo)簽303的幫助下，靶核酸分子305可以被卡在納米孔302中，這可以生成可測量的電流，該電流可以使得能夠從沒有與標(biāo)簽偶聯(lián)的其他核酸分子中檢測靶核酸分子305。

在樣品流過納米孔302時，可在沒有獲得靶核酸分子305的核酸序列的情況下，從電流或其變化的連續(xù)測量檢測靶核酸分子305?？稍谥甘敬嬖诎泻怂岱肿?05的停留時間時檢測電流或其變化。例如，從1毫秒(ms)至10ms測得的電流可以指示靶核酸分子305的存在，而在小于1ms時測得的電流可以指示溶液中可能不是靶核酸分子305的其他分子或物質(zhì)。

可以通過在具有或疑似具有靶核酸分子305的樣品流過納米孔302時測量電流或其變化來檢測靶核酸分子305。所測得的電流或其變化可與參考值(例如，基線電流或電流變化)進(jìn)行比較。作為時間的函數(shù)相對于這種參考值的任何差異可以指示靶核酸分子305的存在。

在檢測靶核酸分子305之后，可以提供刺激以從納米孔302移除靶核酸分子305。該刺激可以是壓力脈沖、熱脈沖、電壓脈沖、施加剪切力(sheerforce)或其組合。在一些情況下，該刺激打破了標(biāo)簽303與膜301或納米孔302之間的相互作用。例如，該刺激打破了標(biāo)簽303與靶核酸分子305之間的相互作用，例如，通過破壞連接體304。作為替代方案，該刺激是流動方向的逆轉(zhuǎn)，諸如在施加負(fù)壓降或電壓時。這誘導(dǎo)靶核酸分子305逆轉(zhuǎn)流動方向，并從反側(cè)向順側(cè)離開納米孔302。

在一些實例中，所述刺激是由納米孔傳感器的電極之間提供的電壓脈沖。該電壓脈沖可以包括約0.5v至20v或1v至10v的電壓，并提供約500納秒(ns)至2ms或500ns至1ms的時間段。例如，該電壓脈沖是約1ms時間段的5v電位。在一些情況下，脈沖持續(xù)時間小于或等于約5ms、4ms、3ms、2ms或1ms。該電壓可具有與用來將靶核酸分子305引導(dǎo)至納米孔302中的極性相反的極性。

可對膜301和/或納米孔302施加刺激。可在使得膜301和/或納米孔302不被破壞的條件下將刺激引導(dǎo)至膜301和/或納米孔302。

例如，如果使用電壓v(例如，0.5mv)將靶核酸分子305沿著從膜301的順側(cè)到反側(cè)的方向引導(dǎo)至納米孔302，則可使用電壓-v引導(dǎo)靶核酸分子305從膜301的反側(cè)到順側(cè)離開該納米孔。

作為另一示例，如果使用跨納米孔302的壓降δp(例如，1個大氣壓)將靶核酸分子305沿著從膜301的順側(cè)到反側(cè)的方向引導(dǎo)至納米孔302，則可使用壓降-δp引導(dǎo)靶核酸分子305從膜301的反側(cè)到順側(cè)離開納米孔。

一旦靶核酸分子305從納米孔302中移除，就可使用納米孔302來檢測溶液中另一靶核酸分子的存在。例如，可以跨納米孔302提供壓降(例如，δp)和/或電壓(v)，以將偶聯(lián)有標(biāo)簽303的另一靶核酸分子305引導(dǎo)至納米孔302中。

靶核酸分子305可與一個標(biāo)簽或多個標(biāo)簽偶聯(lián)。在一些情況下，多個標(biāo)簽(例如，2、3、4或5個標(biāo)簽)可以提供靶核酸分子305在納米孔302中的某種停留時間，該停留時間可以提供更高的檢測靈敏度(例如，大于90％)。多個標(biāo)簽可以與靶核酸分子305直接偶聯(lián)，或者通過一個或多個連接體間接偶聯(lián)。

圖4示出了使用本公開內(nèi)容的納米孔傳感器測得的電流測量值(y軸)與時間(x軸，毫秒(ms))的示例圖。納米孔傳感器包含具有納米孔的膜。在檢測時間段內(nèi)，溶液穿過納米孔的流動減慢或以其他方式被破壞三次，從而產(chǎn)生電流信號401、402和403。電流401-403的每個變化均有停留時間(τ)。將停留時間與參考值進(jìn)行比較可以導(dǎo)致確定電流信號403與靶核酸分子相關(guān)，而信號401和402與靶核酸分子不相關(guān)?？梢酝ㄟ^測量指示存在被標(biāo)簽停止或停滯在納米孔中的靶核酸分子的電流變化(例如，δc相對于時間，或dc/dt相對于時間)來進(jìn)行這種確定。例如，根據(jù)參考測量值(即，利用具有已知靶核酸分子的樣品)，大于或等于5ms的任何停留時間可以歸因于靶核酸分子。信號401和402具有約1ms的停留時間，而信號403具有大于5ms的停留時間。

信號403可以持續(xù)到對納米孔和/或膜施加刺激以從納米孔去除靶核酸分子。在圖示的實例中，在時間404時對納米孔和/或膜施加電壓脈沖。

與靶核酸分子不相關(guān)的信號401和402可以各自獨立于刺激持續(xù)給定的時間段。信號403可以持續(xù)到在時間404時施加刺激。

信號401、402和403的振幅可以相同或不同。在一些情況下，信號403的振幅與信號401和402的振幅不同。

納米孔傳感器可以連續(xù)地或周期性地測量電流。在一些情況下，納米孔傳感器在促使含有具有或疑似具有靶核酸分子的樣品的溶液流過納米孔之后測量電流。

用于形成納米孔的方法

本公開內(nèi)容的納米孔可以經(jīng)由多種方法形成。例如，可以使用光刻法形成一個或多個納米孔的陣列，其中在光致抗蝕劑(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯))中限定一個或多個孔的圖案，并使用光刻法將該圖案轉(zhuǎn)移到基底(例如，硅基底)，該方法可以包括將一個或多個孔的圖案暴露于各向異性化學(xué)蝕刻劑。

在一些情況下，提供基底并且鄰近該基底提供光致抗蝕劑層。該光致抗蝕劑層可由例如聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(甲基戊二酰亞胺)(pmgi)、酚醛樹脂或基于環(huán)氧樹脂的負(fù)性光致抗蝕劑(例如su-8)形成。該光致抗蝕劑可在暴露于光如紫外(uv)線后得以顯影(developed)。

接下來，可使光致抗蝕劑暴露于電磁輻射或顆粒(例如，光或電子束)的圖案，以在暴露基底的光致抗蝕劑中限定孔。曝光可以導(dǎo)致化學(xué)變化，該化學(xué)變化允許通過洗滌液去除一些光致抗蝕劑，從而留下孔。正性光致抗蝕劑在曝光時可以變得可溶于洗滌液中，而在負(fù)性光致抗蝕劑中，未曝光區(qū)可溶于洗滌液中。接下來，孔可以暴露于化學(xué)蝕刻劑。該化學(xué)蝕刻劑可以提供各向異性蝕刻。例如，該化學(xué)蝕刻劑可以是氫氧化鉀(koh)。在一些情況下，聚焦離子束和/或時間緩沖氧化物蝕刻(boe)可用于提供精細(xì)蝕刻，如去除殘留氧化物。

所述基底可以是半導(dǎo)體或聚合物基底。例如，該基底可由硅、鍺、碳(例如石墨烯)或砷化鎵或其氧化物或氮化物形成。作為一個實例，該基底由硅、氧化硅或氮化硅形成。作為另一實例，該基底可由諸如銅、鎳或鋁的金屬形成。該基底可以具有約10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的厚度。在一個實例中，該基底具有約50nm至150nm的厚度。

根據(jù)本文提供的方法形成的納米孔可以具有各種電導(dǎo)率。例如，具有約5nm至15nm的橫截面尺寸的納米孔可以具有約20納西門子(ns)至150ns、50ns至120ns或60ns至110ns的電導(dǎo)率。這樣的電導(dǎo)率可以相對于電解質(zhì)如kcl的流動進(jìn)行測量。

計算機(jī)控制系統(tǒng)

本公開內(nèi)容提供了被編程為實現(xiàn)本公開內(nèi)容的方法的計算機(jī)控制系統(tǒng)。圖5示出了計算機(jī)系統(tǒng)501，其被編程或以其他方式被配置用于檢測溶液中靶核酸樣品的存在。計算機(jī)系統(tǒng)501可以調(diào)節(jié)本公開內(nèi)容的納米孔傳感器的各個方面，例如，檢測電流或電流隨時間的變化。計算機(jī)系統(tǒng)501可與可作為芯片的一部分的納米孔傳感器進(jìn)行通信。計算機(jī)系統(tǒng)501可以是固定的或可移動的。在一些實例中，計算機(jī)系統(tǒng)501是移動電子設(shè)備的一部分。

計算機(jī)系統(tǒng)501包括中央處理單元(cpu，本文中也稱為“處理器”和“計算機(jī)處理器”)505，其可以是單核或多核處理器，或者用于并行處理的多個處理器。計算機(jī)系統(tǒng)501還包括存儲器或存儲位置510(例如，隨機(jī)存取存儲器、只讀存儲器、閃速存儲器)、電子存儲單元415(例如，硬盤)、用于與一個或多個其他系統(tǒng)通信的通信接口520(例如，網(wǎng)絡(luò)適配器)以及外圍設(shè)備525，諸如高速緩沖存儲器、其他存儲器、數(shù)據(jù)存儲和/或電子顯示適配器。存儲器510、存儲單元515、接口520和外圍設(shè)備525通過諸如主板等通信總線(實線)與cpu505相通信。存儲單元515可為用于存儲數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲單元(或數(shù)據(jù)存儲庫)。計算機(jī)系統(tǒng)501可借助于通信接口520可操作地耦合至計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)(“網(wǎng)絡(luò)”)530。網(wǎng)絡(luò)530可為因特網(wǎng)、互聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)，或與因特網(wǎng)相通信的內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)。在一些情況下，網(wǎng)絡(luò)530為電信和/或數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)530可包括一個或多個計算機(jī)服務(wù)器，該計算機(jī)服務(wù)器可支持分布式計算，諸如云計算。網(wǎng)絡(luò)530，在一些情況下借助于計算機(jī)系統(tǒng)501，可實現(xiàn)對等網(wǎng)絡(luò)，這可使與計算機(jī)系統(tǒng)501耦合的設(shè)備能夠起到客戶端或服務(wù)器的作用。

cpu505可執(zhí)行一系列機(jī)器可讀指令，該計算機(jī)可讀指令可體現(xiàn)在程序或軟件中。該指令可存儲在諸如存儲器510等存儲位置中。該指令可針對cpu505，隨后可編程或以其他方式配置cpu505以實現(xiàn)本公開內(nèi)容的方法。由cpu505執(zhí)行的操作的示例可包括提取、解碼、執(zhí)行和回寫。

cpu505可以是諸如集成電路等電路的一部分。系統(tǒng)501的一個或多個其他組件可包括在電路中。在一些情況下，該電路為專用集成電路(asic)。

存儲單元515可存儲文件，諸如驅(qū)動程序、庫和保存的程序。存儲單元515可存儲用戶數(shù)據(jù)，例如，用戶偏好和用戶程序。在一些情況下，計算機(jī)系統(tǒng)501可包括一個或多個附加數(shù)據(jù)存儲單元，所述附加數(shù)據(jù)存儲單元位于計算機(jī)系統(tǒng)501外部，諸如位于通過內(nèi)聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng)與計算機(jī)系統(tǒng)501相通信的遠(yuǎn)程服務(wù)器上。

計算機(jī)系統(tǒng)501可通過網(wǎng)絡(luò)530與一個或多個遠(yuǎn)程計算機(jī)系統(tǒng)相通信。例如，計算機(jī)系統(tǒng)501可與用戶(服務(wù)提供者)的遠(yuǎn)程計算機(jī)系統(tǒng)相通信。遠(yuǎn)程計算機(jī)系統(tǒng)的示例包括個人計算機(jī)(例如，便攜式pc)、平板或平板型pc(例如，ipad、galaxytab)、電話、智能電話(例如，iphone、支持android的設(shè)備、)或個人數(shù)字助理。用戶可經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)530訪問計算機(jī)系統(tǒng)501。

如本文所述的方法可通過機(jī)器(例如，計算機(jī)處理器)可執(zhí)行代碼的方式來實現(xiàn)，該機(jī)器可執(zhí)行代碼存儲在計算機(jī)系統(tǒng)501的電子存儲位置上，例如在存儲器510或電子存儲單元515上。機(jī)器可執(zhí)行代碼或機(jī)器可讀代碼可以以軟件的形式提供。在使用期間，該代碼可由處理器505執(zhí)行。在一些情況下，可從存儲單元515檢索該代碼并將其存儲于存儲器510上以備由處理器505獲取。在一些情況下，可排除電子存儲單元515，而將機(jī)器可執(zhí)行指令存儲于存儲器510上。

所述代碼可被預(yù)編譯并配置用于與具有適于執(zhí)行該代碼的處理器的機(jī)器一起使用，或可在運(yùn)行期間被編譯。該代碼可以以編程語言提供，可選擇編程語言以使該代碼能夠以預(yù)編譯或即時編譯(as-compiled)的方式執(zhí)行。

本文提供的系統(tǒng)和方法的各方面，諸如計算機(jī)系統(tǒng)501，可體現(xiàn)在編程中。本技術(shù)的多個方面可以被認(rèn)為是“產(chǎn)品”或“制品”，其一般為在一種類型的機(jī)器可讀介質(zhì)上攜帶或體現(xiàn)的機(jī)器(或處理器)可執(zhí)行代碼和/或關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)的形式。機(jī)器可執(zhí)行代碼可存儲在諸如存儲器(例如，只讀存儲器、隨機(jī)存取存儲器、閃速存儲器)等電子存儲單元或硬盤上?！按鎯Α毙徒橘|(zhì)可包括計算機(jī)的任何或全部有形存儲器、處理器等，或其關(guān)聯(lián)模塊，諸如各種半導(dǎo)體存儲器、磁帶驅(qū)動器、磁盤驅(qū)動器等，其可在任何時間為軟件編程提供非暫時性存儲。該軟件的全部或部分有時可以通過因特網(wǎng)或各種其他電信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通信。這樣的通信，例如，可使軟件能夠從一個計算機(jī)或處理器加載到另一計算機(jī)或處理器中，例如，從管理服務(wù)器或主機(jī)加載到應(yīng)用服務(wù)器的計算機(jī)平臺中。因此，可承載軟件元素的另一類型的介質(zhì)包括光波、電波和電磁波，諸如跨本地設(shè)備之間的物理接口、通過有線和光學(xué)陸線網(wǎng)絡(luò)以及通過各種空中鏈路而使用的。攜帶這類波的物理元件，諸如有線或無線鏈路、光學(xué)鏈路等，也可以被認(rèn)為是承載軟件的介質(zhì)。如本文所用的，除非受限于非暫時性有形“存儲”介質(zhì)，否則諸如計算機(jī)或機(jī)器“可讀介質(zhì)”等術(shù)語是指參與向處理器提供指令以供執(zhí)行的任何介質(zhì)。

機(jī)器可讀介質(zhì)，諸如計算機(jī)可執(zhí)行代碼，可采取許多形式，包括但不限于：有形存儲介質(zhì)、載波介質(zhì)或物理傳輸介質(zhì)。非易失性存儲介質(zhì)包括例如光盤或磁盤，諸如任何計算機(jī)中的任何存儲設(shè)備等，例如可用于實現(xiàn)如附圖中所示的數(shù)據(jù)庫等。易失性存儲介質(zhì)包括動態(tài)存儲器，諸如這樣的計算機(jī)平臺的主存儲器。有形傳輸介質(zhì)包括同軸電纜；銅線和光纖，包括導(dǎo)線，該導(dǎo)線包括計算機(jī)系統(tǒng)內(nèi)的總線。載波傳輸介質(zhì)可采取電信號或電磁信號或者聲波或光波的形式，諸如在射頻(rf)和紅外(ir)數(shù)據(jù)通信過程中生成的那些電信號或電磁信號或者聲波或光波。因此，計算機(jī)可讀介質(zhì)的常見形式包括例如：軟盤、柔性盤、硬盤、磁帶、任何其他磁性介質(zhì)、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光學(xué)介質(zhì)、穿孔卡片紙帶、任何其他具有孔洞圖案的物理存儲介質(zhì)、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存儲器芯片或匣盒、傳送數(shù)據(jù)或指令的載波、傳送這樣的載波的電纜或鏈路，或者計算機(jī)可從中讀取編程代碼和/或數(shù)據(jù)的任何其他介質(zhì)。這些計算機(jī)可讀介質(zhì)形式中的許多可以參與將一個或多個指令的一個或多個序列載送至處理器以供執(zhí)行。

計算機(jī)系統(tǒng)501可包括電子顯示器535或與之通信，電子顯示器535包含用于隨時間提供例如來自納米孔傳感器的信號的用戶界面(ui)540。ui的實例包括但不限于圖形用戶界面(gui)和基于網(wǎng)絡(luò)的用戶界面。

本公開內(nèi)容的方法和系統(tǒng)可通過一種或多種算法來實現(xiàn)。算法可在由中央處理單元505執(zhí)行時通過軟件實現(xiàn)。

實施例1

在處理室中用高能粒子輻射半導(dǎo)體基底(例如硅)。該高能粒子可以是氬離子(例如ar⁺)。使用光刻和蝕刻在半導(dǎo)體基底中生成至少一個納米孔。例如，可在半導(dǎo)體附近提供掩模，并且暴露與納米孔相對應(yīng)的掩模的位置，并去除此位置的掩模以暴露半導(dǎo)體基底的一部分。使半導(dǎo)體基底的暴露部分與蝕刻溶液(例如，hf和hno3的混合物)接觸，以在半導(dǎo)體基底中蝕刻出納米孔。半導(dǎo)體基底中的蝕刻阻斷層可以終止蝕刻?？稍陔姌O附近提供具有納米孔的半導(dǎo)體基底，以提供納米孔傳感器。

可在effendorfpcr管中，包括用于pcr反應(yīng)和用于檢測的室中，提供納米孔傳感器。具有納米孔的半導(dǎo)體可以是使兩個阱(順式阱和反式阱)分開的膜。將用于核酸擴(kuò)增(例如等溫擴(kuò)增)的試劑加入到順式阱中。用于核酸擴(kuò)增的試劑可以包括pcr緩沖液、引物、dna聚合酶和模板核酸樣品。lamp和內(nèi)切核酸酶可在約65℃的溫度下進(jìn)行，以生成雙鏈靶核酸分子作為模板核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。接下來，內(nèi)切核酸酶與納米孔共價交聯(lián)。在順式阱與反式阱之間施加電壓，并用納米孔傳感器測量電流。

阱之間(跨順側(cè)和反側(cè))的電壓誘導(dǎo)帶負(fù)電荷的靶核酸分子進(jìn)入并電泳穿過納米孔。靶核酸分子在其末端具有標(biāo)簽，該標(biāo)簽增加靶核酸分子在納米孔中的停留時間?；谒黾拥耐Ａ魰r間，確定靶核酸分子的存在?；谕Ａ魰r間可以將具有標(biāo)簽的靶核酸分子與不具有標(biāo)簽的其他核酸分子區(qū)分開來。

實施例2

將2μm濕熱氧化硅薄膜和100nm低壓化學(xué)氣相沉積(lpcvd)低應(yīng)力(富硅)氮化硅沉積在1-20ohm·cm電阻率的500μm厚p摻雜<100>si晶片上。通過晶片的各向異性koh(33％，80℃)蝕刻(其中已通過反應(yīng)性離子蝕刻在光刻圖案化區(qū)域中去除薄膜)形成獨立的20μm膜。使用聚焦離子束(micrion9500)去除獨立膜中心的1μm平方面積中的約1.5μm氧化硅。隨后的boe去除約600nm的剩余氧化物，從而在獨立氧化物/氮化物膜的中心留下2μm獨立氮化硅微膜。在用koh和boe處理之后，如通過橢偏測量術(shù)和橫截面透射電子顯微術(shù)(tem)所測量的，該氮化物膜的厚度約為80nm。使用來自jeol2010f場發(fā)射tem(jeolusa，peabody，ma)的聚焦200kev電子束在該氮化物微膜的中心形成大致沙漏形的納米孔。納米孔直徑約為10nm。

盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本文并不打算通過說明書中提供的具體實例來限制本發(fā)明。盡管已經(jīng)參考前述說明書描述了本發(fā)明，但本文實施方案的描述和圖示不應(yīng)以限制性的意義來解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的情況下現(xiàn)將想到多種變化、改變和替代。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的所有方面并不限于本文闡述的具體描繪、配置或相對比例，而是取決于多種條件和變量。應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述的本發(fā)明實施方案的各種替代方案可用于實施本發(fā)明。因此可以設(shè)想，本發(fā)明還應(yīng)當(dāng)覆蓋任何這樣的替代、修改、更改或等同物。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，因此覆蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。