本發(fā)明涉及用于核酸序列確定的核酸分子的構(gòu)建方法。更具體而言，涉及適合于利用納米孔測序進行解析的單鏈核酸分子的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

近年來，以遺傳性疾病致病基因的檢測、藥物的有效性、副作用的評價、癌癥等相關(guān)的基因突變的檢測等為目的，核酸堿基序列解析的需求變得非常大。因此，解析結(jié)果得到的信息精度必須高。

作為高精度讀取核酸分子堿基序列的方法，例如，提出了模板核酸片段中核苷酸的共有序列的確定方法，包括將模板核酸片段的正義鏈和反義鏈配置于連續(xù)核酸分子的階段，以及通過利用聚合酶進行的依賴模板的測序方法對正義鏈和反義鏈雙方進行測序的階段(專利文獻1)。專利文獻1中記載了“利用模板的環(huán)狀構(gòu)成，能夠進行同一分子的多次重復(fù)測序。換句話說，測序方法沿著完全連續(xù)的序列進行，通過重復(fù)對來自互補序列的各片段進行測序，可以重復(fù)獲得該片段的序列數(shù)據(jù)和各片段內(nèi)的序列數(shù)據(jù)。這樣的序列數(shù)據(jù)的全部或一部分在之后衍生模板與其各種片段的共有序列中是有用的?！?段落編號[0055])。

此外，專利文獻2公開了含有雙鏈核酸區(qū)域的、可以為了制作用于序列確定目的的核酸單鏈構(gòu)建物而使用的接頭。專利文獻2中記載了“構(gòu)建物被確定序列時，確保雙鏈核酸中的各個位置并非僅檢查1次，實際上是檢查2次。這在對核酸的各位置進行檢查的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了較高的可靠性，將通過一次檢查來實現(xiàn)，從而對于各位置中的兩種堿基，給予分?jǐn)?shù)(score)更高的綜合性識別(call)?！?段落編號[0038])，進而還記載了“對各位置檢查2次的能力對于使用隨機感應(yīng)對甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶進行區(qū)別也是有用的。這兩種堿基在通過跨膜細(xì)孔或者與跨膜細(xì)孔相互作用時，具有非常類似的電流痕跡。因此，這會使對兩者進行區(qū)別變得困難?？墒牵ㄟ^對核酸各位置檢查2次，將能夠進行那樣的區(qū)別，因為，針對甲基胞嘧啶的互補堿基為鳥嘌呤，而針對胸腺嘧啶的互補堿基為腺嘌呤。毋庸置疑，甲基胞嘧啶與包括癌癥的各種疾病有關(guān)聯(lián)?！?段落編號[0042])。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1:日本特表2011－515102號公報

專利文獻2:日本特表2012－516146號公報

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

專利文獻1中記載的技術(shù)是將雙鏈核酸的一個末端用發(fā)夾環(huán)連接的分子、或?qū)蓚€末端用發(fā)夾環(huán)連接的環(huán)狀分子。一個末端連接的分子使用每次讀取互補鏈(正義鏈和反義鏈)各自的序列而得的兩個結(jié)果來提高堿基的判斷精度。然而，關(guān)于該方法，在一個核酸鏈中存在錯配堿基對那樣的突變的情況下、發(fā)生了測序錯誤的情況下，僅對互補鏈序列各讀取一次則互補鏈序列間的結(jié)果會產(chǎn)生差異。

產(chǎn)生了這樣的差異的情況下，無法判斷是該位置存在突變還是發(fā)生了測序錯誤，存在僅對互補鏈的堿基各檢查1次則無法進行具有高可靠性的解析的課題。此外，使兩個末端用發(fā)夾環(huán)連接的環(huán)狀分子中，有可能如現(xiàn)有技術(shù)文獻那樣通過多次反復(fù)測序來解決測序錯誤的問題，但在對單鏈核酸進行解析的納米孔測序方法中，存在無法對環(huán)狀分子進行解析的課題。

專利文獻2中也同樣存在下述問題：由于其為將雙鏈核酸的一個末端用發(fā)夾環(huán)連接的分子，僅通過同樣地對互補鏈各檢查1次，無法判斷是存在突變還是發(fā)生了測序錯誤。進而，為了形成發(fā)夾環(huán)而進行連接反應(yīng)等，因而發(fā)夾環(huán)正確結(jié)合而成的核酸分子的構(gòu)建效率低。雖然為了提高效率可以進行一晚上(例如8小時以上)的反應(yīng)，但也存在預(yù)處理花費時間的課題。

用于解決課題的方法

為了解決上述課題，本發(fā)明人等對構(gòu)建在單鏈核酸(單分子)內(nèi)僅作為目標(biāo)的單方堿基序列重復(fù)的序列結(jié)構(gòu)的核酸分子的方法進行了研究，從而完成了本發(fā)明。通過設(shè)為單鏈結(jié)構(gòu)，能夠利用納米孔測序進行解析，此外僅重復(fù)對不含互補鏈信息的目標(biāo)核酸序列進行解析，因此能夠應(yīng)對測序錯誤的問題，同時進行精度更高的解析。分子內(nèi)序列重復(fù)的次數(shù)越多，則判斷精度越高。

即，本發(fā)明包括以下方案。

[1]一種單鏈核酸分子的構(gòu)建方法，所述單鏈核酸分子用于利用納米孔測序儀的核酸序列確定，所述單鏈核酸分子的構(gòu)建方法包括：

使用3’側(cè)含有單鏈區(qū)域的至少一個發(fā)夾引物、以及與該發(fā)夾引物配對的引物合成包含目標(biāo)序列的模板dna的互補鏈的工序，以及

合成的互補鏈在分子內(nèi)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并以自身為模板進行延伸反應(yīng)的工序；

得到的核酸分子序列中包含目標(biāo)序列及其互補鏈雙方。

[2]根據(jù)[1]中記載的方法，上述發(fā)夾引物的莖部具有比上述單鏈部的tm值高的tm值。

[3]根據(jù)[1]中記載的方法，在發(fā)夾引物由于反應(yīng)的進行而減少的同時，合成的互補鏈序列以自身為模板進行延伸反應(yīng)。

[4]根據(jù)[1]中記載的方法，進一步包括下述工序：在使用前對發(fā)夾引物的5’端進行磷酸化、構(gòu)建目的核酸分子后使5’末端磷酸化的dna鏈分解。

[5]根據(jù)[4]中記載的方法，使用λ外切核酸酶進行上述分解。

[6]根據(jù)[4]中記載的方法，5’末端磷酸化的dna鏈分解后，從其互補鏈的3’末端介由發(fā)夾結(jié)構(gòu)自身退火進行延伸反應(yīng)。

[7]根據(jù)[1]中記載的方法，進一步包括使具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭與上述生成物連接，進行鏈置換反應(yīng)而使核酸分子延伸的工序。

[8]根據(jù)[6]中記載的方法，使具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭與上述生成物連接，進行鏈置換反應(yīng)而使核酸分子延伸。

[9]根據(jù)[1]中記載的方法，將由上述配對的引物形成的末端固定，使互補鏈dna解離后，進行延伸反應(yīng)。

[10]根據(jù)[7]或[8]中記載的方法，上述接頭的環(huán)結(jié)構(gòu)部含有延伸反應(yīng)抑制分子。

[11]根據(jù)[1]中記載的方法，上述配對的引物具有dna與rna的嵌合結(jié)構(gòu)，延伸反應(yīng)后進一步包括使rna分解的工序。

[12]一種核酸堿基序列確定方法，包括利用納米孔測序儀對通過[1]中記載的方法得到的核酸分子的堿基序列進行解析。

[13]根據(jù)[12]中記載的方法，序列確定工序中，以由核酸分子中所含的已知堿基序列得到的信號為基礎(chǔ)進行檢測器的校正。

[14]根據(jù)[12]中記載的方法，序列確定工序中，以由核酸分子中所含的已知堿基序列得到的信號為基礎(chǔ)進行解析。

[15]根據(jù)[12]中記載的方法，使用形成了雙鏈的反應(yīng)物來控制反應(yīng)物通過納米孔的速度。

[16]根據(jù)[1]中記載的方法，上述發(fā)夾引物具有隨機序列。

[17]根據(jù)[16]中記載的方法，上述發(fā)夾引物具有上述目標(biāo)序列的突變數(shù)量以上種類的隨機序列。

本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的國際申請pct/jp2015/055529號的說明書和/或附圖中記載的內(nèi)容。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的核酸分子構(gòu)建方法具有下文所示的效果。

通過本發(fā)明的方法構(gòu)建的核酸分子在被確定測序時，目標(biāo)序列并非僅檢查1次，而是利用目標(biāo)序列與以其序列自身為模板合成的互補鏈序列連接而成的單鏈核酸(單分子)檢查多次。這使得在檢查核酸的目標(biāo)序列時能夠進行高精度分析。更詳細(xì)而言，通過重復(fù)檢查單分子內(nèi)無基因組結(jié)構(gòu)上的互補鏈序列信息地僅以單鏈序列為模板合成的序列，能夠?qū)κ峭蛔儗?dǎo)致的堿基不同還是測序錯誤導(dǎo)致的堿基不同進行識別，能夠進行高精度的核酸序列分析。

單分子堿基序列的判斷精度高，則能夠檢測大量的來自正常細(xì)胞的基因組dna中少量含有的來自異常細(xì)胞的突變。例如，檢測來自血中少量含有的癌細(xì)胞的具有突變的dna的情況下，從一定量的血液提取dna，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)法等，對包含欲檢測的堿基序列位置的核酸分子進行擴增，確定其核酸分子堿基序列，從而對是否包含突變進行解析(courauds.clincancerres.2014sep1；20(17):4613-24.)。

使用納米孔測序儀解析單分子dna堿基序列的情況下，一次讀取獲得的堿基序列的判斷精度為90％時，例如檢測來自正常細(xì)胞中以1％左右少量含有的癌細(xì)胞的具有突變的dna是困難的。為了檢測1％左右的突變而檢測通過pcr法僅擴增目標(biāo)序列而得的1,000個單分子dna(解讀堿基序列)的情況下，各單分子在堿基序列中無突變位置每1堿基檢測1,000次。該1,000次內(nèi)，堿基序列判斷精度為90％，因此“約100次”檢測到錯誤的堿基信息(但錯誤頻率有某一定程度偏差)。由于堿基序列中有突變的位置為10％錯誤的判定、以及1％的突變，因此會判定出“約110次”與1,000次中主要被判定的堿基不同的堿基。該與主要判定不同的“100次”和“110次”之差的出現(xiàn)頻率有偏差(分布)，因此以該次數(shù)為基礎(chǔ)來檢測、判斷突變的有無是困難的。

然而，本發(fā)明的方法中，即使1次檢測獲得的單分子dna的堿基序列判斷精度為90％，通過僅以單鏈序列為模板在單分子內(nèi)重復(fù)檢查，例如單分子的最終判斷精度達到99.9％，從而能夠檢測少量含有的突變dna。例如最終判斷精度為99.9％時，如果檢測1,000個單分子dna，在無突變位置和有突變位置，與主要判定不同的堿基的出現(xiàn)頻率為1次和11次，該出現(xiàn)頻率差大有不同，因此具有出現(xiàn)頻率之差而容易檢測突變有無。這樣檢測少量含有的突變也與疾病的早期發(fā)現(xiàn)相關(guān)。

此外，本發(fā)明的方法進行使用了發(fā)夾引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此，與例如利用連接使發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接的情況相比，能夠以更高的效率構(gòu)建具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸分子。此外，重復(fù)擴增工序中的錯誤幾率與測序錯誤相比大幅降低，因此能夠使采用了本發(fā)明的方法的解析方法的精度與現(xiàn)有方法相比非常高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的方法中能夠使用的納米孔拉曼(nanoporeraman)dna測序裝置的構(gòu)成圖例子。

圖2是本發(fā)明的方法中能夠使用的納米孔拉曼dna測序裝置的檢測部和觀察容器的截面圖的例子。

圖3是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖4是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖5是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖6是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖7是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖8a是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖8b是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖8c是顯示本發(fā)明的方法中的核酸分子構(gòu)建工序的例子。

圖9是對目標(biāo)序列進行比較的結(jié)果。

具體實施方式

以下，使用附圖更詳細(xì)地對本發(fā)明的方法進行說明。

本發(fā)明涉及用于利用納米孔測序儀確定核酸序列的核酸分子的構(gòu)建方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于利用納米孔測序儀確定核酸序列的單鏈核酸分子的構(gòu)建方法，其包括：使用3’側(cè)含有單鏈區(qū)域的至少一個發(fā)夾引物、以及與該發(fā)夾引物配對的引物合成包含目標(biāo)序列的模板dna的互補鏈的工序；以及合成的互補鏈在分子內(nèi)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并以自身為模板進行延伸反應(yīng)的工序，得到的核酸分子序列中包含目標(biāo)序列及其互補鏈雙方。

需要說明的是，對本發(fā)明的方法進行記載時，所謂“目標(biāo)序列”，貫穿本說明書的記載，在雙鏈核酸分子的情況下意思是僅一條鏈的序列，對象核酸分子形成了雙鏈的情況下，對于“目標(biāo)序列”的互補鏈，不記載為“目標(biāo)序列”。本發(fā)明的構(gòu)建方法中基于“目標(biāo)序列”形成了互補鏈的情況下，對于該互補鏈，有時表述為“目標(biāo)序列”或者“目標(biāo)序列信息”。

納米孔測序儀是公知的技術(shù)，可以適當(dāng)使用例如wo2013/021815a1中記載的裝置。

圖1中，對使用了下述裝置100的例子的方法進行說明：使核酸進入內(nèi)徑約2nm的納米孔，利用照射于納米孔的激發(fā)光以及納米孔附近存在的導(dǎo)電性薄膜使通過納米孔的生物聚合物(例如dna)的拉曼散射光增大后檢測拉曼光譜。

這里，雖然以檢測拉曼光譜的納米孔測序儀為例進行表示，但能適用于所有的解析單鏈單分子的方法。例如為能夠適用于檢測通過納米孔時的封閉電流或隧道電流的dna測序儀、檢測熒光的納米孔dna測序儀的核酸分子構(gòu)建方法。

圖1中，作為顯示適用于以正置顯微鏡為基本構(gòu)成的拉曼光觀察的情況的一例，對裝置的構(gòu)成和動作進行說明。裝置構(gòu)成并不特別限定于正置顯微鏡的基本構(gòu)成，也可以是以倒置顯微鏡為基本構(gòu)成的顯微鏡等能夠檢測照射光產(chǎn)生的試樣信號的構(gòu)成。

光源是照射能夠產(chǎn)生熒光或拉曼散射光的波長的外部光(激發(fā)光)?？梢允褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域公知的光源101?？梢允褂美绲幌抻冢喊雽?dǎo)體激光、氪(kr)離子激光、釹(nd)激光、氬(ar)離子激光、yag激光、氮激光、藍寶石激光等。

將來自該光源的外部光照射于多個納米孔的情況下，使用多重照射機構(gòu)113。非限定性地，多重照射機構(gòu)113可以使用微透鏡陣列、衍射光柵型分光器或lcos(liquidcrystalonsilicon，硅基液晶)等。使用它們使多個外部光照射于納米孔。

為了由光源將外部光照射于顯微鏡觀察容器并使其匯聚，優(yōu)選將共聚焦透鏡和物鏡102與光源組合使用。顯微鏡觀察容器103架設(shè)于xy平臺104上，利用xy平臺調(diào)整水平面上的位置。對于垂直方向位置，利用z軸調(diào)節(jié)機構(gòu)105，以測定對象試樣位于通過物鏡聚焦的區(qū)域的方式進行調(diào)整。根據(jù)情況，也可以使xy平臺具有z軸調(diào)節(jié)機構(gòu)。作為定位機構(gòu)，除了這些平臺以外，還可以利用θ軸平臺、測角儀平臺精密地進行調(diào)整。這些定位機構(gòu)以驅(qū)動控制部115來控制，使用者通過計算機116進行操作。

此外，作為裝置構(gòu)成，還可以組合針對測定波長區(qū)域等測定目標(biāo)的陷波濾波器、短通濾波器、長通濾波器等濾波器106、分光器107、衍射光柵108等。另外，根據(jù)光學(xué)部件配置的需要，也可以使用反光鏡112、針孔、透鏡114、nir(近紅外)反光鏡117。這樣的用于檢測熒光或拉曼散射光的裝置構(gòu)成在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇優(yōu)選的構(gòu)成要素。檢測器只要是能夠檢測熒光或拉曼散射光的檢測器109，就可以使用任意的分光檢測器。此外，根據(jù)所使用的顯微鏡觀察容器中試樣的數(shù)量和配置，可以使用1個或多個一維或二維檢測器。作為那樣的分光檢測器，可列舉ccd(電荷耦合元件)或電子倍增(electronmultiplying)ccd圖像傳感器、cmos(互補型金屬氧化膜半導(dǎo)體)圖像傳感器、其他高靈敏度元件(雪崩光電二極管等)圖像傳感器等。為了防止靈敏度隨著檢測的高速化而降低，檢測器優(yōu)選具有光電倍增機構(gòu)、例如圖像增強器。此外，優(yōu)選檢測器具備能夠直接記錄拉曼散射光等圖像信息的大容量存儲器，由此能夠不介由電纜、平板、計算機等而高速進行解析。例如，本發(fā)明的解析裝置可以進一步具備記錄來自檢測器的測量值的幀緩沖存儲器。此外，本發(fā)明的解析裝置可以與用于將來自上述檢測器的測量值數(shù)字化、運算處理、輸出的計算機116相連接。

此外，還可以不只是具有拉曼散射光、熒光檢測，還具有能夠進行明場圖像觀察的功能。因此，如圖1所示，作為明場照射光源，使用led110；作為明場圖像拾取元件，使用二維檢測器111。作為二維檢測器，可列舉ccd或emccd圖像傳感器、cmos圖像傳感器等。

圖2顯示納米孔基板和配置有納米孔基板的觀察容器的截面構(gòu)成。觀察容器201由隔著具有納米孔202的基板203(納米孔基板)的2個封閉空間、即試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205構(gòu)成。但試樣導(dǎo)入分區(qū)204與試樣流出分區(qū)205通過納米孔202是連通的。在構(gòu)建了通過后述本發(fā)明的方法構(gòu)建的、重復(fù)包含目標(biāo)序列的核酸分子后，將分子放入觀察容器201?；蛘撸部梢灾苯釉谟^察容器內(nèi)構(gòu)建核酸分子。

觀察容器具有腔室部和配置于其內(nèi)部的基板203?；?03具有基材、面向基材形成的薄膜、以及設(shè)于薄膜的、使試樣(核酸分子)導(dǎo)入分區(qū)204與試樣流出分區(qū)205連通的納米孔202，配置于腔室的試樣導(dǎo)入分區(qū)204與試樣流出分區(qū)205之間。基板203可以具有絕緣層?；?03優(yōu)選為固體基板。

基板203可以由電絕緣體材料、例如無機材料和有機材料(包括高分子材料)形成。作為構(gòu)成基板203的電絕緣體材料的例子，可列舉硅(silicon)、硅化合物、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚苯乙烯、聚丙烯等。作為硅化合物，可列舉氮化硅、氧化硅、碳化硅等氮氧化硅。尤其是構(gòu)成基板203的支撐部的基底(基材)，可以由它們中的任意材料制作，例如可以是硅或硅化合物。

關(guān)于基板203的尺寸和厚度，只要能夠設(shè)置納米孔202就沒有特別限定。基板203可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法制作，或者也可以作為市售品獲得。例如，基板203可以使用光刻或電子束光刻、以及蝕刻、激光消融、注塑成型、鑄造、分子束外延、化學(xué)蒸鍍(cvd)、介質(zhì)擊穿、電子射線或者會聚粒子束等技術(shù)制作。基板203也可以為了避免目標(biāo)以外的分子向表面吸附而進行涂覆。

基板203至少具有1個納米孔202。具體而言，納米孔202設(shè)于薄膜，根據(jù)情況，也可以同時設(shè)于基底(基材)、絕緣體。本發(fā)明中“納米孔”和“孔”是納米(nm)尺寸(即直徑1nm以上、小于1μm)的孔，是貫穿基板203而使試樣導(dǎo)入分區(qū)204與試樣流出分區(qū)205連通的孔。

基板203優(yōu)選具有用于設(shè)置納米孔202的薄膜。即，通過在基板上形成材料和厚度適合形成納米尺寸的孔的薄膜，可以簡便且有效地在基板203上設(shè)置納米孔202。從形成納米孔方面出發(fā)，薄膜的材料優(yōu)選為例如氧化硅(sio2)、氮化硅(sin)、氮氧化硅(sion)、金屬氧化物、金屬硅酸鹽等。此外，薄膜(以及根據(jù)情況為基板整體)可以是實質(zhì)上透明的。這里“實質(zhì)上透明”意思是能夠使約50％以上、優(yōu)選80％以上的外部光透過。此外，薄膜可以是單層也可以是多層。薄膜的厚度為1nm～200nm，優(yōu)選為1nm～50nm，更優(yōu)選為1nm～20nm。薄膜可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)形成在基板203上，例如減壓化學(xué)氣相生長(lpcvd)。

薄膜上優(yōu)選設(shè)有絕緣層。絕緣層的厚度優(yōu)選為5nm～50nm。絕緣層可以使用任意絕緣體材料，優(yōu)選使用例如硅或硅化合物(氮化硅、氧化硅等)。本發(fā)明中納米孔或孔的“開口部”是指納米孔或孔與試樣溶液相接部分的納米孔或孔的開口圈。分析生物高分子時，試樣溶液中的生物高分子、離子等從一個開口部進入納米孔，從相同或相反側(cè)的開口部出到納米孔外。

納米孔202的尺寸可以根據(jù)分析對象生物高分子的種類選擇適當(dāng)?shù)某叽?。納米孔可以具有均勻的直徑，也可以根據(jù)部位的不同而具有不同直徑。納米孔也可以與具有1μm以上直徑的孔相連接?；?03的薄膜中設(shè)置的納米孔中，最小直徑部、即該納米孔所具有的最小直徑為直徑100nm以下，例如為1nm～100nm，優(yōu)選為1nm～50nm，例如優(yōu)選為1nm～10nm，具體而言為1nm以上5nm以下、3nm以上5nm以下等。

ssdna(單鏈dna)的直徑約為1.5nm，適合用于分析ssdna的納米孔直徑范圍為1.5nm～10nm程度，優(yōu)選為1.5nm～2.5nm程度。dsdna(雙鏈dna)的直徑約為2.6nm，適合用于分析dsdna的納米孔直徑的范圍為3nm～10nm程度，優(yōu)選為3nm～5nm程度。以其他生物高分子、例如蛋白質(zhì)、多肽、糖鏈等為分析對象的情況下，也同樣可以選擇針對生物高分子外徑尺寸的納米孔直徑。

納米孔202的深度(長度)可以通過調(diào)整基板203或基板203的薄膜的厚度來調(diào)整。納米孔202的深度優(yōu)選設(shè)為構(gòu)成分析對象生物高分子的單體單元。例如選擇核酸作為生物高分子的情況下，納米孔202的深度優(yōu)選設(shè)為1個堿基以下的大小、例如約0.3nm以下。納米孔202的形狀基本為圓形，也可以設(shè)為橢圓形、多邊形。

可以在基板203上至少設(shè)置1個納米孔202，設(shè)置多個納米孔202的情況下，可以有規(guī)律地排列。納米孔202可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法、例如通過照射透射型電子顯微鏡(tem)的電子束、通過使用納米光刻技術(shù)或離子束光刻技術(shù)等來形成。

腔室部具有試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205、基板203、電壓施加機構(gòu)、以及用于使試樣212通過納米孔202的電極213、214等。在優(yōu)選的例子中，腔室部具有試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205、設(shè)于試樣導(dǎo)入分區(qū)204的第一電極213、設(shè)于試樣流出分區(qū)205的第二電極214、針對第一、第二電極的電壓施加機構(gòu)等。設(shè)于試樣導(dǎo)入分區(qū)204的第一電極213、設(shè)于試樣流出分區(qū)205的第二電極214之間可以配置有電流計。第一電極213與第二電極214之間的電流從確定試樣212通過納米孔的速度方面考慮適當(dāng)確定即可，例如，使用不含試樣212的離子液體的情況下，如果為dna，則優(yōu)選為100mv～300mv程度，但不限于此。

電極213、214可以由金屬例如鉑、鈀、銠、釕等鉑族、金、銀、銅、鋁、鎳等；石墨例如石墨烯(單層或多層均可)、鎢、鉭等制作。

通過施加電壓，通過納米孔202的核酸分子由于激發(fā)光而發(fā)出拉曼光，可以在納米孔附近準(zhǔn)備導(dǎo)電性薄膜215，產(chǎn)生近場而增強。如從薄膜的定義可知，設(shè)于納米孔附近的導(dǎo)電性薄膜215形成為平面狀。導(dǎo)電性薄膜215的厚度根據(jù)所采用的材料設(shè)為0.1nm～10nm，優(yōu)選設(shè)為0.1nm～7nm。導(dǎo)電性薄膜215的厚度越小，則越能夠限制產(chǎn)生的近場，能夠進行高分辨率且高靈敏度的解析。此外，導(dǎo)電性薄膜215的大小沒有特別限定，可以根據(jù)所使用的固體基板203和納米孔202的大小、所使用的激發(fā)光的波長等適當(dāng)選擇。需要說明的是，如果導(dǎo)電性薄膜215不是平面狀卻是存在彎曲等，則在該彎曲部，激發(fā)近場的光能漏出，在目標(biāo)外位置產(chǎn)生拉曼散射光。即背景光增大，信噪比(s/n)降低。因此，導(dǎo)電性薄膜215優(yōu)選為平面狀，換言之，截面形狀優(yōu)選為無彎曲的直線狀。使導(dǎo)電性薄膜215形成平面狀不僅對背景光的降低、s/n比的增大有效果，而且從薄膜的均勻性、制作中的再現(xiàn)性等觀點出發(fā)也是優(yōu)選的。

試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205中，充滿了介由分別連接于兩個分區(qū)的流入路徑206、207導(dǎo)入的液體210、211。液體210、211從連接于試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205的流出路徑208、209流出。流入路徑206和207可以設(shè)于夾著基板相對的位置，但不限于此。流出路徑208和209可以設(shè)于夾著基板相對的位置，但不限于此。

液體210優(yōu)選為含有作為分析對象的試樣212的試樣溶液。液體210優(yōu)選大量含有作為電荷的承載者的離子(以下稱為離子液體)。優(yōu)選液體210除了含有試樣以外僅含有離子液體。作為離子液體，優(yōu)選為使電離度高的電解質(zhì)溶解而得的水溶液，可以優(yōu)選使用鹽類溶液、例如氯化鉀水溶液等。優(yōu)選試樣212在離子液體中具有電荷。典型地，試樣212為核酸分子。

試樣導(dǎo)入分區(qū)204和試樣流出分區(qū)205中設(shè)有以夾著納米孔202相對的方式配置的電極213、214。本實施方式中，腔室部還具備針對電極213、214的電壓施加機構(gòu)。通過施加電壓，具有電荷的試樣212通過納米孔202從試樣導(dǎo)入分區(qū)204向試樣流出分區(qū)205轉(zhuǎn)移。試樣212通過以激發(fā)光照射的納米孔202時，對于利用導(dǎo)電性薄膜215增強的拉曼散射光譜，利用浸液介質(zhì)216有效地使拉曼光聚焦，通過物鏡217到達檢測器109而被解析。

圖2中，將上部設(shè)為試樣導(dǎo)入分區(qū)，將下部設(shè)為試樣流出分區(qū)，也可以將下部設(shè)為試樣導(dǎo)入分區(qū)、將上部設(shè)為試樣流出分區(qū)，檢測流出納米孔的試樣。

以下，以實施例的形式具體地對本發(fā)明的方法進行說明，但其用意并非是本發(fā)明的方法限定于以下的實施例。

實施例1

將本發(fā)明的方法的一個實施方式示于圖3。本發(fā)明的核酸分子的構(gòu)建方法的特征之一在于，擴增作為對象的核酸的目標(biāo)序列，目標(biāo)序列重復(fù)的單鏈(單分子)來構(gòu)建。

如圖3(1)所示，所準(zhǔn)備的引物對中，至少一方設(shè)為具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物300。引物300的3'末端側(cè)是具有與包含目標(biāo)序列的模板dna的序列互補序列的單鏈區(qū)域的引物序列結(jié)構(gòu)，呈從莖部突出的結(jié)構(gòu)。這種情況下，用于擴增目標(biāo)序列的引物300是發(fā)夾引物，用于擴增目標(biāo)序列互補鏈的引物303可以是發(fā)夾引物，也可以是不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物?；蛘?，還可以：為了擴增目標(biāo)序列，使用引物303；為了擴增目標(biāo)序列互補鏈，使用發(fā)夾引物300。以雙鏈核酸中任一方序列為目標(biāo)序列進行解析的本發(fā)明的方法可以根據(jù)實施方式使用上述任何方式。任何情況下，在與發(fā)夾引物300的對比中，在本說明書中均將引物303記載為“配對的引物”。

模板dna可以直接使用來自其本身包含目標(biāo)序列的試樣的dna，也可以以能夠更合適地用于本發(fā)明的方法的方式，在以包含能夠完全與發(fā)夾引物形成互補鏈的序列的方式合成的序列上連接目標(biāo)序列。

具有包含環(huán)部和莖部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物是已知的，作為其序列例，例如通過i.a.nazarenko.etal.2516-2521nucleicacidsresearch,1997,vol.25,no.12，可以給出具有下述表1所示發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列例。只要確定了包含目標(biāo)序列的作為擴增對象的模板dna，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能夠適當(dāng)設(shè)計、制作用于其擴增的合適的發(fā)夾引物。

[表1]

如圖3所示，使具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物300變性并與對象核酸(例如人類基因組)的目標(biāo)序列退火。

作為一例，在圖3的步驟(1)中，準(zhǔn)備作為反應(yīng)溶液混合物的含有對象核酸的溶液、夾有目標(biāo)序列的引物組(一側(cè)或兩側(cè)為上述發(fā)夾引物300)、以及聚合酶和對應(yīng)于聚合酶的鹽組合溶液。所使用的dna聚合酶沒有限定，可以使用例如作為taqdna聚合酶所代表的從嗜熱菌分離的聚合酶的、分類為家族a(poli型)的酶、作為koddna聚合酶所代表的從超嗜熱古細(xì)菌分離的聚合酶的、分類為家族b(α型)的酶。此外，作為催化鏈置換型互補鏈合成反應(yīng)的dna聚合酶，通常已知bstdna聚合酶、bca(exo-)dna聚合酶、dna聚合酶i的klenow片段、φ29噬菌體dna聚合酶、ventdna聚合酶、vent(exo-)dna聚合酶(從ventdna聚合酶將外切核酸酶活性去除而得)、deepventdna聚合酶、deepvent(exo-)dna聚合酶(從deepventdna聚合酶將外切核酸酶活性去除而得)、ms-2噬菌體dna聚合酶、z-taqdna聚合酶(寶生物公司制)等，可以適當(dāng)使用。

此外，也可以使用具有作為上述dna聚合酶所需的催化劑活性并且僅將結(jié)構(gòu)等一部分功能去掉的物質(zhì)、通過氨基酸突變等改變了催化劑活性、穩(wěn)定性或者耐熱性的各種突變體。只要具有序列依賴型的互補鏈合成活性、鏈置換活性等，各種dna聚合酶突變體就能夠在本發(fā)明中利用，并非限于上述例子。

本發(fā)明的方法是多次讀取通過合成而制作的序列從而提高測序儀的讀取精度的方法，因此優(yōu)選合成精度高的聚合酶。例如，已知合成精度高的酶primestar(注冊商標(biāo))max、primestar(注冊商標(biāo))hs等(寶生物公司制)的合成精度為99.995％以上。它們具有為了檢測1～0.1％的突變，擴增階段的合成錯誤不會對突變檢測產(chǎn)生影響程度的充分的精度。

在圖3的步驟(2)中，將該(1)的混合物加熱至適當(dāng)?shù)淖冃詼囟?，使各引物與對象核酸退火，進行延伸反應(yīng)(步驟(3))。延伸的雙鏈擴增產(chǎn)物在變性條件下解離后，再次與各引物退火、延伸。重復(fù)進行該工序。這里，發(fā)夾引物的環(huán)部也全部形成堿基對包含于延伸的雙鏈擴增產(chǎn)物中(步驟(4))。

如(5b)所示，在這一時刻，延伸的單鏈核酸的分子內(nèi)包含發(fā)夾引物的序列，因此能夠通過其分子內(nèi)退火而形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。該反應(yīng)與通過與未反應(yīng)的發(fā)夾引物300的分子間退火進行形成新的互補鏈的反應(yīng)競爭。這里，為了優(yōu)先獲得重復(fù)包含(5b)所示那樣的目標(biāo)序列、且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補鏈序列部301(莖部)與3’末端的退火比與未反應(yīng)的發(fā)夾引物300的退火優(yōu)先發(fā)生是優(yōu)選的。因此，通過例如以競爭退火的發(fā)夾引物300的發(fā)夾引物中的互補鏈序列部302(單鏈部)退火所需的溫度(tm值)比形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補鏈序列部301(莖部)的tm值低的方式設(shè)計、且以使從變性工序向退火和延伸工序的溫度降低的方式設(shè)置溫度梯度，互補鏈序列部301(莖部)能夠優(yōu)先退火，能夠優(yōu)先獲得具有目標(biāo)序列重復(fù)而得的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。即，這種情況下，發(fā)夾引物的莖部具有比單鏈部的tm值高的tm值。在上下文中，tm(meltingtemperature，熔解溫度)值記載的是對應(yīng)于引物內(nèi)部分序列的值。

例如，進行將發(fā)夾引物的單鏈部的tm值設(shè)為60℃的序列設(shè)計的情況下，如果將莖部的tm值設(shè)為70℃，則互補鏈序列部301能夠優(yōu)先退火，能夠優(yōu)先獲得具有目標(biāo)序列重復(fù)而得的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。

一般而言，雙鏈dna的狀態(tài)在tm值的±5℃內(nèi)發(fā)生變化。只要是具有容差地設(shè)置tm值之差，就可以將單鏈部與莖部的tm值之差設(shè)定為15℃以上。但是，具有極端差異的tm值設(shè)定還會影響擴增的反應(yīng)效率，因此可以設(shè)為15℃以下、更優(yōu)選約10℃的溫度差。因此，作為本發(fā)明方法的一個實施方式，以發(fā)夾引物300的莖部具有比發(fā)夾引物300單鏈部的tm值高5℃以上、10℃以上、或15℃以上的tm值的方式設(shè)定?；蛘咭园l(fā)夾引物300的莖部具有比發(fā)夾引物300單鏈部的tm值高約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、約15℃的tm值的方式設(shè)定。

此外，如果使用調(diào)節(jié)dna的熔解溫度的甜菜堿(n,n,n-三甲基甘氨酸)，則能夠使雙鏈dna的狀態(tài)在更窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生變化(williama.rees等，biochemistry1993,32,137-144)，因此可以在反應(yīng)溶液中添加。

tm值或各溫度下雙鏈dna的狀態(tài)根據(jù)ph和鹽濃度等條件的變動而變動、此外也依賴于堿基序列、長度的值，但在一定條件下的tm值可以基于堿基序列的長度和gc含有率等來計算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在引物的設(shè)計中適當(dāng)設(shè)定各部的tm值，設(shè)計、制作最適的引物，此外也可以適當(dāng)進行反應(yīng)溫度的設(shè)計。

或者，如果不進行上述工序，因為發(fā)夾引物300的濃度隨著反應(yīng)循環(huán)的進行而減少，因此可以以由于引物300用盡而互補鏈序列部301優(yōu)先退火的方式適當(dāng)調(diào)整引物300的濃度。這種情況下，在發(fā)夾引物由于反應(yīng)的進行而減少的同時，合成的互補鏈序列以自身為模板進行延伸反應(yīng)。

更具體而言，為了進行上述反應(yīng)，例如將具有表1所示那樣的序列結(jié)構(gòu)的發(fā)夾引物與聚合酶和鹽組合溶液設(shè)為100μl時的組成調(diào)制為：

20mmtris-hcl(ph8.5)

50mmkcl

2mmmgcl2

200μm各dntp

5upfu^exo-dna聚合酶(不具有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)，在以下的溫度條件下進行合成反應(yīng)。

通過在94℃加熱5分鐘，使發(fā)夾與對象核酸(例如人類基因組)的高級結(jié)構(gòu)解開。然后使95℃30秒、60℃45秒、72℃90秒的溫度循環(huán)重復(fù)例如20至40次，然后進行72℃5分鐘的延伸反應(yīng)。溫度循環(huán)中的時間、溫度不限于此處所示的反應(yīng)條件。溫度、時間、循環(huán)等可以根據(jù)作為目標(biāo)的序列、引物的序列、得到的產(chǎn)物量等而改變。

通過重復(fù)這些步驟的圖3的工序，能夠獲得(5b)所示那樣的具有目標(biāo)序列重復(fù)而得的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸，能夠迅速構(gòu)建確定堿基序列前的試樣。

此外，圖3中，將配對的引物中的一個設(shè)為發(fā)夾引物300，但也可以是配對的引物雙方使用具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行同樣的反應(yīng)工序。用來構(gòu)建核酸分子的時間依賴于合成反應(yīng)中的溫度、反應(yīng)時間、循環(huán)、熱循環(huán)儀(thermal-cycler)性能，大體上，圖3所示的反應(yīng)在30分鐘至90分鐘以內(nèi)結(jié)束。反應(yīng)溶液中含有未反應(yīng)的引物等，利用凝膠過濾樹脂填充離心柱chromaspincolumn(寶生物公司制)，可以用10分鐘左右將未反應(yīng)的引物除去、僅將合成的目標(biāo)序列重復(fù)的核酸分子取出，進入堿基序列確定工序。

通過本發(fā)明的方法得到的生成物具有互補鏈序列，因此形成雙鏈的(5a)與具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸分子(5b)混合存在。為了利用使用了使單鏈dna通過、每次檢測一個堿基的納米孔(例如直徑2nm以下)的測序儀進行序列解析，在序列解析時，雙鏈核酸分子的存在是不優(yōu)選的。因此，也可以例如在圖3所示合成工序中，將使用了兩條的引物中的一條設(shè)為不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物303，使引物303的序列為互補鏈序列容易解離的富含at的序列?；蛘?，也可以在生成物通過納米孔時進行熱、堿等導(dǎo)致的互補鏈序列的解離，形成容易以單鏈dna形式通過納米孔的結(jié)構(gòu)。

或者，可以使引物303在使用以dna-rna構(gòu)成的雜合嵌合引物，將rna序列設(shè)于5’末端之后進行圖3所示反應(yīng)。這種情況下，也可以使用rnaseh酶等將形成了dna-rna雜合雙鏈的rna切斷，形成反應(yīng)生成物的末端為單鏈dna的位置，容易地從納米孔中單鏈dna的位置通過。使從形成單鏈dna的位置的序列至雙鏈dna序列的位置通過納米孔時，帶負(fù)電荷的dna經(jīng)過納米孔，由于帶電而被吸引至陽極側(cè)。雙鏈dna具有氫鍵地形成，也可以一邊使氫鍵解離一邊吸引。這種情況下，通過納米孔的速度變慢，可以經(jīng)過充分的時間通過作為充分的檢測場的位置。也就是說，還可以通過熱、堿或引力分別調(diào)整形成雙鏈的氫鍵的力，控制dna通過納米孔的速度。

本發(fā)明的方法是，僅以目標(biāo)序列(雙鏈的一側(cè)的一條dna鏈)為基礎(chǔ)合成互補鏈序列，隨后合成該合成序列的互補鏈序列，構(gòu)建單鏈核酸分子，使用其，利用納米孔測序儀進行檢測。這使得僅通過解析目標(biāo)序列的單鏈難以解讀堿基序列的情況下、例如得到的信號由于堿基間具有類似信號的情況等而不確定的情況下，能夠獲得來自具有不同序列的互補鏈序列的信號。也就是說，并非讀取包含錯配可能性的本來的雙鏈分子雙方，而是僅讀取相同目標(biāo)序列的單鏈序列信息2次，因此表現(xiàn)為，能夠在讀取到的2次信息的基礎(chǔ)上進行高精度的核酸序列分析。即使檢測裝置(例如檢測器、透鏡等)并非昂貴且高精度的裝置，也能夠通過多次讀取成為獲得充分精度程度的裝置，即能夠降低裝置的負(fù)擔(dān)(例如功能上)，本發(fā)明的方法也是能夠使用于測序的裝置為廉價或小型化的裝置的方法。

利用納米孔測序儀進行的解析在為單鏈核酸分子的情況下，從5'側(cè)解析、從3'側(cè)解析均可。使用通過上述工序生成的反應(yīng)產(chǎn)物進行納米孔測序的情況下，如果從5'側(cè)讀取，則圖3(5b)所示發(fā)夾擴增產(chǎn)物首先分析引物的序列信息，然后按照目標(biāo)序列、發(fā)夾引物序列、目標(biāo)序列(互補序列)、引物序列(互補序列)的順序解析。

這里，來自各引物序列的堿基序列信息和堿基序列的信號信息(例如拉曼散射光、封閉電流值)是已知的，因此，以何種信號(波長、頻率或電流值)得到峰、對應(yīng)于各堿基的信號以何種順序得到峰是已知的，因而能夠?qū)崟r進行檢測的校正。例如，檢測拉曼散射光的情況下，依次獲得已知的利用拉曼散射光得到的光譜信息，因而由光譜峰得到的信息無法在本應(yīng)得到的元件的位置獲得的情況下，例如可以校正檢測元件的位置。如果光軸偏移，則在與本來的檢測圖像元件位置不同的位置獲得光譜峰，因此無法正確解析。因此，利用通過堿基序列讀取的開始和終止以及目標(biāo)序列的間隔得到多個已知的拉曼光譜峰，使用由解析初期得到的多個拉曼光譜峰的檢測圖像元件位置和激發(fā)光的檢測圖像元件位置(不是拉曼光，而是激發(fā)光的反射光)組成的多個已知的位置信息、以及本來可檢測到的元件位置信息等，可以修正頻率和元件的位置信息并進行解析。

由已知序列部得到的多個拉曼光譜峰不僅可以用于上述元件的位置校正，還可以用于污染、延遲的檢測。例如，解析多個樣品的目標(biāo)序列的情況下，根據(jù)樣品的不同，改變解析所用的發(fā)夾引物300發(fā)夾部分的序列。或在成對的引物303的5’末端設(shè)置不具有與目標(biāo)序列互補的序列的序列，通過根據(jù)樣品的不同來改變序列，可以由讀取的序列信息來識別樣品間的污染、解析中前一解析樣品的延遲并進行解析。

進行電流檢測的情況下，可以使用由已知的各引物序列的各堿基得到的電流值和背景信號值進行校正。例如，在測定中背景信號值發(fā)生變動的情況下特別有效。將核酸通過前的信號值作為背景信號值，核酸分子進入時電流值會大幅變化，因此，減去核酸分子進入前的背景信號值而測量電流值。依次測量acgt并列的已知堿基序列的情況下，可以將在各堿基的信號強度減去背景信號值后，已知序列產(chǎn)生的信號強度比、信號的變化作為對照值，將目標(biāo)序列部得到的信號值與對照值進行比對而對堿基進行判定。校正的方法不限于此。該方法是以由已知序列得到的已知信號值或信號信息、或由已知序列得到的已知序列產(chǎn)生的實測信號為基礎(chǔ)進行校正或解析的方法?；谏鲜鲇涊d，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)Ρ景l(fā)明的方法進行適當(dāng)改變。

上述是以檢測拉曼散射光而確定核酸堿基序列的例子為中心來表示的，但本發(fā)明的方法不限于此，例如，可以在下述方法中使用通過本發(fā)明的方法得到的核酸分子：檢測通過納米孔時的封閉電流的核酸堿基序列確定方法(us2011/0229877、us2011/0177498等)；檢測通過納米孔時產(chǎn)生的隧道電流的核酸堿基序列確定方法(日本特開2014-20837)；使用液滴的單分子核酸堿基序列確定方法(wo2014111723a、wo2014053854a)；制作聚合酶延伸產(chǎn)物的情況下，進行從核苷酸三磷酸[ntp]放出的熒光標(biāo)記焦磷酸[ppi]部分的單分子檢測的核酸堿基序列確定方法(日本專利第4638043號)等。即使目標(biāo)序列的讀取精度低，由于分子中包含多個目標(biāo)序列信息，因此也能夠通過解析單分子而顯示出高精度的解析結(jié)果，能夠減輕進行檢測的裝置側(cè)的負(fù)擔(dān)(例如功能上)。

實施例2

實施例1中，僅一方使用發(fā)夾引物的情況下構(gòu)建的核酸分子是按圖3的(4)所示分子與(5b)所示分子約各占一半的比例構(gòu)建的。本實施例中，對下述方法進行說明：能夠2次檢測圖3的(5b)所示目標(biāo)序列的分子不是以一半的程度構(gòu)建，而是以構(gòu)建的分子全部為能夠2次檢測目標(biāo)序列的分子的方式構(gòu)建。圖4顯示其流程。

本實施例中，在圖4所示工序之前，進行與圖3類似的工序。與圖3所示的工序不同的一點是，將與發(fā)夾引物300配對的引物303生物素化而進行圖3所示擴增工序。隨著引物的生物素化，為了減少由于生物素的立體結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的使用聚合酶進行的合成中的擴增障礙，可以包含約5個碳原子左右的間隔(例如堿基等)。

使用生物素化的引物300，在通過例如圖3所示工序擴增的40μl反應(yīng)產(chǎn)物中，混合帶有鏈霉親和素的磁珠(例如dynabeads(注冊商標(biāo))m-280streptavidin)，懸浮并在室溫下孵育15分鐘，使擴增產(chǎn)物與磁珠結(jié)合。

之后，在反應(yīng)容器外側(cè)架設(shè)磁鐵，在跨反應(yīng)容器地將磁珠吸引至磁鐵側(cè)并固定的狀態(tài)下，僅將上清除去，進行洗滌溶液的添加和懸浮、利用磁鐵進行的吸引和將上清除去的洗滌操作。該洗滌操作時，通過使洗滌溶液為60℃以上或95℃以上來進行，存在于磁珠上結(jié)合的dna鏈互補鏈中的dna鏈隨著雙鏈dna的解離而被洗去，能夠僅分離到磁珠上結(jié)合的dna鏈、即從生物素化引物延伸的分子?；蛘?，通過利用堿溶液在進行雙鏈dna的解離的同時進行洗滌，也可獲得同樣的效果。

作為僅分離到磁珠上結(jié)合的dna鏈的方法，記載了通過高溫下的洗滌和利用堿溶液的洗滌進行處理的方法，但不限于此。只要是使dna鏈的互補鏈序列相結(jié)合的狀態(tài)解離、僅分離到由生物素化的引物延伸的分子的方法即可。

使用該分離到的dna鏈，構(gòu)建分子全部為能夠2次檢測目標(biāo)序列的分子。例如，反應(yīng)溶液設(shè)為100μl時，在分離到的dna鏈中加入下述組成的溶液：

20mmtris-hcl(ph8.5)

50mmkcl

2mmmgcl2

200μm各dntp

5upfu^exo-dna聚合酶(沒有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)，

在以下的溫度條件下進行反應(yīng)。

通過在94℃加熱5分鐘使高級結(jié)構(gòu)解開。然后通過95℃30秒、60℃45秒使3’末端具有互補鏈的序列位置退火，從而構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過在72℃加熱90秒以上進行延伸反應(yīng)。

結(jié)果，如圖4所示，能夠僅獲得具有重復(fù)包含目標(biāo)序列信息的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。此外，反應(yīng)條件不限于上述反應(yīng)條件，可以根據(jù)作為目標(biāo)的序列、引物的序列來改變溫度、時間、循環(huán)等。此外，關(guān)于各工序的反應(yīng)之間，雖然未記載將鹽、酶除去的純化工序，但根據(jù)情況，如有需要也可以實施。

進行納米孔測序時，由于結(jié)合的磁珠而測序效率降低的情況下，可以將磁珠從核酸分子切掉。例如，可以將設(shè)于引物與生物素之間的間隔區(qū)域切斷。作為切斷方法，例如可以是間隔區(qū)域的堿基序列中預(yù)先包含制限酶酶切序列，在測序前切斷。由此，可以以將dna鏈與磁珠切斷而得的混合物作為試樣進行納米孔測序。

實施例3

本實施例中，對使用λ外切核酸酶構(gòu)建使分子全部作為包含2次目標(biāo)序列信息的分子的方法的例子進行說明。圖5顯示其流程。

本實施方式的特征在于，在使用前將發(fā)夾引物的5'末端磷酸化，在構(gòu)建目的核酸分子后使5'末端磷酸化的dna鏈分解。分解沒有特別限定，使用例如λ外切核酸酶。

在圖5所示工序之前進行與圖3類似的工序。與圖3所示的工序不同的一點是，使發(fā)夾引物300的5’末端磷酸化、配對的引物303未磷酸化地進行圖3所示擴增工序。反應(yīng)后，如有需要，將擴增反應(yīng)液中的鹽、引物除去。除去方法無要求，可以使用例如作為通過將擴增產(chǎn)物固定于硅膠膜并離心來純化的市售試劑盒的nucleospin(注冊商標(biāo))凝膠及pcr純化(gelandpcrclean-up)(寶生物公司制)。

λ外切核酸酶是具有下述特征的酶：從磷酸化的5'末端側(cè)開始消化雙鏈dna，產(chǎn)生單核苷酸。5'末端磷酸化的雙鏈dna為良好的底物。利用該性質(zhì)，在擴增產(chǎn)物中加入λ外切核酸酶(neb公司制)，按照67mm甘氨酸-koh(ph9.4)、2.5mmmgcl2、50μg/mlbsa的緩沖液組成調(diào)制反應(yīng)溶液，在37℃孵育30分鐘。通過該反應(yīng)，經(jīng)圖3的工序生成的擴增產(chǎn)物中不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此，無法在一分子中2次讀取目標(biāo)序列信息的雙鏈dna中具有磷酸基的鏈被消化，成為單鏈。進行λ外切核酸酶反應(yīng)后，再次實施使該dna鏈延伸的反應(yīng)。

這種情況下，將進行了λ外切核酸酶反應(yīng)的溶液調(diào)整為例如下述組成的溶液。

20mmtris-hcl(ph8.5)

50mmkcl

2mmmgcl2

200μm各dntp

5upfu^exo-dna聚合酶(沒有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶)

按上述組成在以下的溫度條件下進行反應(yīng)。通過在94℃加熱5分鐘使高級結(jié)構(gòu)解開。然后通過95℃30秒、60℃45秒使3’末端具有互補鏈的序列位置退火，從而構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過在72℃加熱90秒以上進行延伸反應(yīng)。該反應(yīng)不限于上述所示的反應(yīng)條件。可以根據(jù)作為目標(biāo)的序列、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列來改變溫度、時間、循環(huán)等。

結(jié)果，如圖5所示，作為得到的dna鏈，能夠僅獲得具有目標(biāo)序列重復(fù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。關(guān)于各工序的反應(yīng)之間，雖然未記載將鹽、酶除去的純化工序，但如有需要也可以實施。

本實施例中制成的核酸分子也同樣能夠在測序時2次檢測目標(biāo)序列，能夠進行高精度的堿基測序。

實施例4

本實施例中，對不止2次以上檢測目標(biāo)序列、也可進行4次檢測的構(gòu)建方法進行說明。圖6顯示其流程。

在圖6所示工序之前進行與圖3類似的工序。與圖3所示工序不同的一點是，將延伸反應(yīng)中的“72℃90秒”的步驟進行足夠長的時間(例如5分鐘以上)，從而能夠刻意形成反應(yīng)生成物的3’末端有1堿基腺嘌呤突出的結(jié)構(gòu)。因此，優(yōu)選使用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的dna聚合酶(例如taqdna聚合酶)實施延伸反應(yīng)。

對于這里形成的反應(yīng)產(chǎn)物，進行使3’末端1堿基胸腺嘧啶突出的末端結(jié)構(gòu)與具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的接頭601連接的ta克隆(tacloning)。如圖6所示，該接頭601具有下述結(jié)構(gòu)：與前一工序的反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合(連接)的部分(雙鏈dna)和形成發(fā)夾環(huán)的部分(例如表1所示那樣的序列)之間，僅通過單鏈連接。這是從發(fā)夾環(huán)向與反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合的部分3’末端中斷的結(jié)構(gòu)。

作為接頭的連接例，給出了利用ta克隆與接頭601結(jié)合，但連接方法不限于此。例如，可以使用作為利用了拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆系統(tǒng)的、例如使用了dna拓?fù)洚悩?gòu)酶i和來自細(xì)菌噬菌體p1的cre重組酶的strataclonepcr克隆系統(tǒng)(安捷倫公司)、topo(注冊商標(biāo))cloning(lifetechnologies)等其他克隆技術(shù)來連接。

作為連接后的步驟，對于經(jīng)連接的反應(yīng)產(chǎn)物，使用鏈置換型聚合酶進行延伸反應(yīng)。該反應(yīng)是在能夠從接頭601的3'末端對互補堿基序列形成堿基對結(jié)合、且可維持發(fā)生鏈置換反應(yīng)的酶活性的溫度(例如60℃)下孵育。孵育時間可以根據(jù)延伸反應(yīng)的堿基長度來調(diào)整。這里，各個位置形成堿基對結(jié)合的條件一般是例如設(shè)定為熔解溫度以下，與pcr法、lamp法中使用的條件是同樣的。

該基于鏈置換反應(yīng)的延伸可以在提供適合于酶的ph的緩沖劑、維持酶的催化劑活性、為了退火而使用的鹽成分、酶的保護劑、以及根據(jù)需要的熔解溫度調(diào)節(jié)劑等共存的條件下實施。作為ph緩沖劑的一例，可以使用tris-hcl等在中性至弱堿性具有緩沖作用的緩沖劑。ph根據(jù)所使用的酶(dna聚合酶)的特性來調(diào)整。作為鹽成分，可以為了維持酶的活性、調(diào)整核酸的熔解溫度而適當(dāng)添加kcl、nacl或者(nh4)2so4等。作為酶的保護劑，可以使用糖類、牛血清白蛋白。

熔解溫度的調(diào)整一般利用的是二甲亞砜(dmso)、甲酰胺。通過使用它們作為熔解溫度調(diào)節(jié)劑，能夠?qū)?'末端開始的退火調(diào)整至限定的溫度條件之下。進而，甜菜堿(n,n,n-三甲基甘氨酸)是天然的滲透性保護劑，可以利用其能夠使大量含有g(shù)+c堿基序列區(qū)域的熔解溫度降低至與大量含有a+t堿基序列區(qū)域相同的熔解溫度的性質(zhì)。另外，作為熔解溫度調(diào)節(jié)劑，已知脯氨酸、三甲胺n-氧化物等。帶來雙鏈dna的不穩(wěn)定化，從而能夠提高鏈置換效率。甜菜堿的添加量在反應(yīng)液中為0.2～3.0m，優(yōu)選為0.5～1.5m程度，可期待促進本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)的作用。這些熔解溫度調(diào)節(jié)劑向降低熔解溫度的方向發(fā)揮作用，因此考慮鹽濃度、反應(yīng)溫度等其他反應(yīng)條件，憑經(jīng)驗設(shè)定產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)的條件而實施。

根據(jù)鏈置換反應(yīng)的特性，只要進行反應(yīng)，就可以進行延伸反應(yīng)。例如，存在下述情況：引導(dǎo)延伸反應(yīng)的3’末端結(jié)構(gòu)自身退火、轉(zhuǎn)移至附近的自身堿基序列而進行反應(yīng)。

在堿基序列的立體結(jié)構(gòu)上，反應(yīng)這樣進行的情況下，除了作為dna聚合酶底物的dntp(脫氧三磷酸核苷酸)以外，還可以以一定濃度含有ddntp(二脫氧三磷酸核苷酸)?？梢酝ㄟ^含有的ddntp的濃度來限制擴增到的模板的長度。例如，只要經(jīng)過環(huán)結(jié)構(gòu)后延伸反應(yīng)繼續(xù)進行，則通過含有高濃度的ddntp，能夠在鏈置換反應(yīng)時引進ddntp而使延伸反應(yīng)停止。ddntp濃度低的情況下，聚合酶優(yōu)先引進dntp，如果鏈置換反應(yīng)進行到一定程度而ddntp的濃度比變高，則優(yōu)先引進ddntp，鏈置換反應(yīng)停止。可以根據(jù)所需的延伸產(chǎn)物長度調(diào)整ddntp的濃度。通過ddntp的濃度調(diào)整，能夠使目標(biāo)序列信息重復(fù)4次以上，但過多的重復(fù)結(jié)構(gòu)結(jié)果會形成高級結(jié)構(gòu)，能夠?qū)νㄟ^納米孔產(chǎn)生影響，因此可以根據(jù)序列的構(gòu)成正確使用重復(fù)次數(shù)。

鏈置換反應(yīng)無限制地進行帶來的延伸能夠如上所述使用ddntp來控制，但控制方法不限于此。作為另一例子，如果設(shè)為使接頭601所具有的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分脫堿基的構(gòu)成，則鏈置換型聚合酶反應(yīng)在脫堿基化的位置停止。因此，能夠利用脫堿基來控制生成的核酸分子的長度。

此外，也可以在接頭601所具有的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)部分包含抑制利用聚合酶進行的延伸反應(yīng)的分子。通過準(zhǔn)備抑制分子，能夠在延伸反應(yīng)的過程中抑制利用聚合酶進行的延伸反應(yīng)，防止無限制地延伸。抑制分子的結(jié)構(gòu)只要能夠抑制利用聚合酶進行的延伸反應(yīng)就沒有特別限定，優(yōu)選包含例如核酸衍生物、非核酸衍生物。

作為核酸衍生物，除了上述脫堿基以外，還可列舉具有即使在鏈置換型酶的作用下也不會解離的牢固的高級結(jié)構(gòu)、如假結(jié)結(jié)構(gòu)那樣立體抑制聚合酶行進的結(jié)構(gòu)的核酸、l型核酸、3-脫氧-2-羥基-dn、修飾堿基核酸、損傷堿基核酸、磷酸結(jié)合部位修飾核酸、rna、2'-ome-n、bna(lna)、以及它們的衍生物。

如圖6所示，本實施例所示反應(yīng)的結(jié)果是，能夠獲得具有目標(biāo)序列重復(fù)4次的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。關(guān)于各工序的反應(yīng)之間，雖然未記載將鹽、酶除去的純化工序，但如有需要也可以實施。

本實施例中制成的核酸分子能夠在測序時對目標(biāo)序列檢測4次，能夠?qū)崿F(xiàn)更高精度的堿基測序。

實施例5

如圖6所示，實施例4中構(gòu)建的核酸分子是目標(biāo)序列重復(fù)2次或4次的核酸分子可以混合存在的混合物。本實施例中，對構(gòu)建分子全部為目標(biāo)序列重復(fù)4次的核酸分子的方法進行說明。圖7顯示其流程。

圖7的工序中使用通過圖5所示反應(yīng)工序生成的反應(yīng)物。該生成的反應(yīng)物是分子全部包含重復(fù)2次的目標(biāo)序列的核酸分子，用其構(gòu)建目標(biāo)序列重復(fù)4次的核酸分子。

與實施例4中說明的例子同樣，圖5的反應(yīng)中，通過延伸反應(yīng)充分進行，能夠刻意形成反應(yīng)生成物的3’末端1堿基腺嘌呤突出的結(jié)構(gòu)。因此，對圖5中生成的反應(yīng)物，進行賦予具有與實施例4中使用的同樣結(jié)構(gòu)的接頭601的ta克隆或topo(注冊商標(biāo))克隆(lifetechnologies)等。但與接頭的連接方法沒有特別限定。

圖5的反應(yīng)產(chǎn)物與接頭601結(jié)合后，進行使用了鏈置換型聚合酶的延伸反應(yīng)。這里的反應(yīng)是在能夠從3'末端針對互補堿基序列形成堿基對結(jié)合、且能夠維持發(fā)生鏈置換反應(yīng)的酶活性的溫度下孵育。這里，產(chǎn)生各個位置的堿基對結(jié)合的條件一般是例如設(shè)為熔解溫度以下，與pcr法、lamp法中所使用的條件同樣。關(guān)于這里所示鏈置換反應(yīng)，也考慮與實施例4所示的鏈置換反應(yīng)同樣的點而進行反應(yīng)。

如圖7所示，上述所示反應(yīng)的結(jié)果是，能夠使得到的dna鏈全部為具有目標(biāo)序列重復(fù)4次的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。關(guān)于各工序的反應(yīng)之間，雖然未記載將鹽、酶除去的純化工序，但如有需要也可以實施。

本實施例中制成的核酸分子能夠在測序時檢測目標(biāo)序列4次，能夠進行更高精度的堿基測序。

實施例6

上述實施例1～5中，主要以記載構(gòu)建核酸分子的工序作為主要目的。實施例6中，對考慮了有效地將實施例1～5中構(gòu)建的核酸分子導(dǎo)入納米孔的構(gòu)建方法進行說明。通過實施例1～5的方法構(gòu)建的核酸分子的末端結(jié)構(gòu)形成雙鏈dna形狀，在確定單鏈dna堿基序列的情況下，通過使雙鏈解離為單鏈，向設(shè)為單鏈dna直徑尺寸的納米孔的導(dǎo)入效率提高。一般而言，使雙鏈dna變性為單鏈dna的情況下，除了溶劑以外，暴露于高溫、ph調(diào)節(jié)、熔解溫度調(diào)節(jié)劑的使用等也是公知的技術(shù)。將增強它們的效果的方法示于本實施例。

通過實施例1～5所示的核酸分子構(gòu)建方法生成的分子的末端在例如圖3所示的反應(yīng)中，形成具有發(fā)夾引物300與配對的引物303序列的雙鏈dna結(jié)構(gòu)，這種狀態(tài)下，不容易進入單鏈dna直徑尺寸的納米孔。因此，通過設(shè)為容易在使該引物303序列變性時形成單鏈dna的富含at(腺嘌呤和胸腺嘧啶)序列的序列701(圖7)，容易在堿基測序時簡便地將單鏈dna導(dǎo)入納米孔結(jié)構(gòu)。

或者，制成發(fā)夾引物300的5’末端具有rna的、dna與rna的嵌合引物，進行圖3所示反應(yīng)，進行各實施例所示反應(yīng)。之后，使用核糖核酸酶rnaseh使dna與rna中嵌合結(jié)構(gòu)末端的rna分解，從而生成單鏈dna突出的核酸分子，從單鏈dna的位置導(dǎo)入納米孔變得容易。

實施例7

本實施例中，對下述方法進行說明：通過發(fā)夾引物300中具有隨機序列801，利用該隨機序列801來識別作為擴增時的來源的核酸分子，提高作為來源的核酸分子的序列判斷精度。

實施例1～6所示反應(yīng)中，發(fā)夾引物300中具有隨機序列801。例如，如圖8a所示，該隨機序列801位于發(fā)夾引物300的雙鏈形成序列的位置。針對目標(biāo)序列形成互補序列以外的位置中，雙鏈形成序列中(莖部)形成10堿基對的隨機序列的情況下，使用4種堿基能夠準(zhǔn)備具有4的10次方(1,048,576)種隨機序列的發(fā)夾引物。結(jié)果，圖8a(1)～圖8c(5)的工序中，如圖8c(5)所示，以復(fù)制的具有某一隨機序列801的核酸分子為模板擴增到的核酸分子以具有同一隨機序列801及其互補序列802的分子的形式得到擴增。通過擴增循環(huán)的重復(fù)，在維持作為擴增來源的序列和隨機序列的狀態(tài)下，得到呈指數(shù)級擴增的核酸分子。從具有不同隨機序列的發(fā)夾引物803～805擴增的核酸分子構(gòu)成隨機序列不同的核酸分子組(圖8c)。

序列解析時，通過在識別目標(biāo)序列的同時識別對應(yīng)于該發(fā)夾引物300的雙鏈形成序列的位置(隨機序列801及其互補序列802)，作為擴增時的來源的核酸分子的序列解析結(jié)果僅得到擴增到的核酸分子的數(shù)量，能夠提高相對于數(shù)據(jù)庫等中的參考序列，判定是堿基序列讀取錯誤還是突變的精度。

圖9中顯示出將具有同一隨機序列901的多個核酸分子(01～05)的序列解析結(jié)果匯總并與目標(biāo)序列相比的結(jié)果的例子。通過將各核酸分子的解析結(jié)果與參考序列同時進行比較，可檢測到分子間不同的結(jié)果。這種情況下，如果是序列解析時的讀取錯誤，則表示在一部分核酸分子的隨機位置存在與參考序列不同的堿基(圖中以四邊形圍成的區(qū)域所示的堿基)。例如，在擴增到的核酸分子01中解析到“g”、在另外的核酸分子02～05中解析到“c”的情況下，判定這是讀取錯誤(參考序列中也為“c”)。而在作為擴增來源的核酸分子堿基序列中產(chǎn)生了突變(位置902中的“t”→“c”)的情況下，在具有同一隨機序列901的核酸分子01～05的位置902(核酸分子01～05中共用且不同的堿基)顯示與參考序列不同的堿基。也就是說，通過識別作為擴增來源的核酸分子，對由該分子擴增到的核酸分子與擴增來源不同的核酸分子進行識別并讀取多個，能夠進行更高精度的解析。

本方法在前述檢測大量存在的來自正常細(xì)胞的基因組dna中少量含有的來自異常細(xì)胞的突變的情況下特別有效。

這里將隨機序列801的堿基長度設(shè)為10堿基，但不限于此。檢測對象的含有比例少的情況下，通過使隨機序列的堿基長度加長，反應(yīng)中可以使用種類更多的發(fā)夾引物，檢測對象(例如來自異常細(xì)胞的核酸)和除其以外的核酸(來自正常細(xì)胞的核酸)能夠不使用具有相同隨機序列的發(fā)夾引物地擴增。也就是說，優(yōu)選發(fā)夾引物具有上述目標(biāo)序列的突變數(shù)量以上種類的隨機序列。

此外，圖8中將隨機序列801的位置設(shè)為雙鏈形成序列的位置，也可以包含發(fā)夾的環(huán)部分地形成隨機序列。此外，雖然沒有特別限定，發(fā)夾引物的莖部的堿基長度可以設(shè)為8～20堿基，例如16～18堿基的范圍。

本說明書中引用的全部出版物、專利和專利申請直接作為參考并入本說明書中。

符號說明

100：納米孔拉曼dna測序裝置，101：光源，102：物鏡，103：顯微鏡觀察容器，104：xy平臺，105：z軸調(diào)節(jié)機構(gòu)，106：濾波器，107：分光器，108：衍射光柵，109：檢測器，110：led，111：二維檢測器，112：反光鏡，113：多重照射機構(gòu)，114：透鏡，115：驅(qū)動控制部，116：計算機，117：nir(近紅外)反光鏡，201：觀察容器，202：納米孔，203：基板，204：試樣導(dǎo)入分區(qū)，205：試樣流出分區(qū)，206：流入路徑，207：流入路徑，208：流出路徑，209：流出路徑，210：液體，211：液體，212：試樣，213：電極，214：電極，215：導(dǎo)電性薄膜，216：浸液介質(zhì)，217：物鏡，300：發(fā)夾引物，300a：發(fā)夾引物300的延伸產(chǎn)物，301：形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補鏈序列部，302：發(fā)夾引物中的互補鏈序列部，303：引物，303a：引物303的延伸產(chǎn)物，303b：引物303的延伸產(chǎn)物，303c：引物303的延伸產(chǎn)物，303d：引物303的延伸產(chǎn)物，601：發(fā)夾接頭，701：富含at(腺嘌呤和胸腺嘧啶)序列的序列，801：隨機序列，802：隨機序列的互補序列，803：具有不同隨機序列的發(fā)夾引物，804：具有不同隨機序列的發(fā)夾引物，805：具有不同隨機序列的發(fā)夾引物，901：隨機序列，902：核酸分子01～05中共用且不同的堿基。