宿主DNA作為克羅恩氏病的生物標記物的制作方法
本發(fā)明涉及診斷患者患有克羅恩氏病和/或診斷患有克羅恩氏病的患者的疾病狀態(tài)的新方法。
背景技術：
克羅恩氏病(cd)是一種慢性炎性腸病(ibd)，其可能會影響從口腔至肛門胃腸道的任何部位。發(fā)病年齡一般在15-30歲之間，均等地流行于女性和男性中。發(fā)現(xiàn)歐洲和北美的發(fā)病率最高，每100000人中有超過300人(molodecky等人，2012)。cd通常會導致腹痛、嚴重腹瀉和體重紊亂。該疾病的病因未知并且是多因素的：環(huán)境因素、宿主遺傳學和腸道微生物群都已被證明可以影響疾病的風險及其嚴重程度(cho，j.h.&brant，s.r.(2011))。
cd的臨床診斷由血清學、放射學、內(nèi)鏡檢查和組織學檢查結(jié)果所支持。目前，沒有獨立的實驗室開發(fā)的測試允許進行cd診斷。在現(xiàn)有的實驗室測試中，血清crp、糞便鈣網(wǎng)蛋白和乳鐵蛋白是最廣泛使用的標記物，但它們不是cd特異性的?？梢酝ㄟ^克羅恩氏病的活動性指數(shù)(cdai)(一種由多個參數(shù)組合得到的分數(shù))或者僅由臨床參數(shù)組成的harvey-bradshaw指數(shù)(hbi)，來測量疾病的活動性(laas等人，2014)。
此外，在診斷患有cd的患者中，單獨監(jiān)測臨床癥狀不足以可信地評估疾病活動性?；颊咦晕覉蟾婕膊』顒有缘屯ǔＴ趦?nèi)窺鏡檢查期間呈現(xiàn)腸道損傷。生物標記物比如排泄物的鈣網(wǎng)蛋白是有用的，但非特異性，并且它們的增加與晚期惡化(flare)發(fā)生時的全身/粘膜炎癥有關。內(nèi)窺鏡檢查能夠檢測粘膜愈合，這被認為是疾病緩解最強大可靠的征兆；然而，由于需要腸道準備和全身麻醉，常規(guī)重復的內(nèi)窺鏡監(jiān)測是不可行的。新的成像工具，比如mri，已經(jīng)被證明是有效的，但它昂貴、耗時且使用受限，而排除常規(guī)使用。作為最有希望的方法而提出的mr腸動描記法也涉及腸道準備和侵入性結(jié)腸鏡檢查。
因此，鑒于這些疾病的復發(fā)性和緩解性(remitting)，通過準確的監(jiān)測和治療調(diào)整，對cd的嚴格控制是管理這些患者的關鍵。然而，由于上述原因，目前的診斷方法都不能令人滿意。
因此，患者和醫(yī)療保健提供者積極尋找可以評估疾病活動性和監(jiān)測患者護理的非侵入性工具。
更準確地說，仍然需要鑒定cd的標記物，其允許以非侵入性、簡單和準確的方式診斷患者的疾病。這正是本發(fā)明的主題。
此外，需要鑒定這樣的生物標記物，其可以幫助區(qū)分患有活躍型cd的患者和患有所述疾病靜止期的患者。事實上，這些信息可以幫助臨床醫(yī)師診斷cd的階段，預測所述變化的發(fā)生，以便從不同的治療方案中進行選擇(強化型或常規(guī)型)，而無需進行內(nèi)窺鏡分析。本發(fā)明滿足了這一需求。
現(xiàn)有技術中已觀察到宿主dna在患者糞便樣本中的增加，其中所述患者患有已知引起腸粘膜炎癥狀態(tài)的疾病。
在599名住院患者的前瞻性群體中，每位患者在入院后7天內(nèi)獲得單一直腸拭子。宿主dna比例與腸道微生物群多樣性呈負相關。排泄大量人dna的患者富含腸球菌屬和大腸埃希氏菌屬，而瘤胃球菌屬和odoribacter則耗盡。排泄物中人dna的定量可以作為評估腸道炎癥的簡單且非侵入性方法(vincent等人，2014)。
來自結(jié)腸直腸癌患者的糞便樣本還含有提高濃度的人dna(klaassen等人2003)。
患有克羅恩氏病的患者糞便樣本中宿主dna的量迄今為止從未被評估過。然而，已經(jīng)觀察到來自cd患者的糞便樣本也含有提高濃度的人dna。這是非常令人驚訝的，因為cd患者(與潰瘍性結(jié)腸炎相比)腸道損傷的總面積小，而在克羅恩氏病中排泄物中可見的出血是非常罕見的。
通過定量的宏基因組分析，還通過qpcr，本發(fā)明人分析了從健康對照和cd患者收集的一些糞便樣本中的人dna豐度。此外，在患有侵襲性克羅恩氏病與所述疾病靜止期的患者中獲得的糞便樣本中評估了宿主dna豐度。
這樣做，本發(fā)明人觀察到，人dna在糞便樣本中的存在和量是克羅恩氏病的標記物，同樣，正是利用這種的標記物可以區(qū)分患有侵襲性克羅恩氏病與所述疾病靜止期的患者。
綜上所述，他們證明宿主dna在cd患者排泄物中的存在可能被用作cd、其活動性或嚴重程度的標記物。
附圖說明
圖1公開了在來自健康和nash對照組(左側(cè))和克羅恩氏病患者(右側(cè))的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)的百分比人dna的盒子圖(boxplot)。
圖2公開了在研究的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)的宿主dna的相對豐度水平(以％計)，疾病活躍期(左側(cè))和靜止期(右側(cè))的克羅恩氏病患者。使用鈣網(wǎng)蛋白水平和hbi分數(shù)的組合分數(shù)確定疾病狀態(tài)(活躍期與靜止期)。
圖3公開了在研究的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)的人dna百分比與鈣網(wǎng)蛋白水平。
圖4公開了使用人dna百分比作為cd群體中疾病活動性的預測分數(shù)的roc曲線。對于組合分數(shù)，auc具有0.67的值。
圖5公開了為了測量宿主dna豐度，vp5和vp9的qpcr分析定量數(shù)據(jù)之間的相關性。
圖6公開了vp5qpcr分析定量數(shù)據(jù)和通過illumina測序測量的人dna相對豐度的百分比之間的相關性。
圖7公開了vp9qpcr分析定量數(shù)據(jù)和通過illumina測序測量的人dna相對豐度的百分比之間的相關性。
圖8公開了通過qpcr分析獲得的排泄物鈣網(wǎng)蛋白的mrna水平(s100a8和s100a9mrna水平的測量)和通過elisa獲得的排泄物鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平(a：s100a8；b：s100a9)之間的相關性。
技術實現(xiàn)要素：
測量方法，尤其是診斷cd的方法
第一方面，本發(fā)明涉及一種用于針對患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna相對豐度，其中定量數(shù)據(jù)表示宿主dna相對豐度，優(yōu)選與參考值相比。
換句話說，本發(fā)明涉及一種體外方法，其用于分析來自患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者的生物樣本，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)確定所述相對豐度是否高于參考值。
更準確地說，本發(fā)明涉及一種體外診斷受試者中克羅恩氏病(cd)的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)當所述相對豐度高于參考值時，診斷所述受試者患有克羅恩氏病。
該方法優(yōu)于現(xiàn)有技術的診斷方法，因為它是非侵入性的、經(jīng)濟上可接受、并具有高度的特異性。
如本文所用，術語“宿主dna”是指腸道微生物群中宿主的dna，其不同于微生物的或病毒的dna。如果待測試的受試者是人患者，則術語“宿主dna”具體指“人dna”。
可以從所述感興趣的生物樣本中提取dna，例如通過使用godonjj等人1997中描述的提取方案。其它方案仍然可以使用并且是眾所周知的。值得注意的是，對于隨后的分析，微生物dna和宿主dna不需要進行物理分離。
通過任何常規(guī)方式，比如檢測cpg甲基化或細菌16s核糖體dna，可以將哺乳動物dna與微生物dna區(qū)分開。也可以使用qpcr靶向人dna或β球蛋白、β-肌動蛋白和htert基因中的alu(str)重復區(qū)(klaassenchw等人，2003；shewalejg等人，journalofforensicscience，2007，vol.52(2))。納米鏈(nanostring)技術也是有用的。
可以通過任何公知的方法進行宿主和微生物dna的定量。本領域已知的用于定量樣本中dna鏈的最常用的方法包括northern印跡和原位雜交(parker&barnes，methodsinmolecularbiology106：247-283(1999))、基于pcr的方法，比如定量聚合酶鏈反應(qpcr)(heid等人，genomeresearch6：986-994(1996))和基于核酸的多重技術，比如多重pcr和dna微陣列?；蛘?，可以使用可識別序列特異性雙鏈體(包括dna雙鏈體或dna-蛋白質(zhì)雙鏈體)的抗體。用于基于測序的分析的代表性方法包括鏈終止方法、鳥槍測序方法、從頭測序、下一代測序方法(包括大規(guī)模并行簽名測序(mpss)、polony測序、454焦磷酸測序、illumina(solexa)測序、solid測序、離子半導體測序、dna納米球測序、helioscope單分子測序、單分子實時(smrt)測序、rnap測序、納米孔dna測序、雜交測序和微流體sanger測序)。
如以下實施例所示，還可以通過以下從dna庫(pool)中測量宿主dna：i)使用高通量測序技術對存在于糞便樣本中的dna進行測序，以及ii)通過這些測序技術獲得的短讀取與人基因組進行比對。在這種情況下，可以通過對繪制(map)到人基因組單一參考序列上的讀取進行計數(shù)(h)，產(chǎn)生剩余讀取的數(shù)目(b)，并通過讀取的總數(shù)(h+b)對讀取h的數(shù)目進行歸一化，而計算“宿主dna的相對豐度”。
如本文所述，術語“宿主dna豐度”是指所述樣本中存在的宿主dna相較于dna總量(包括尤其是細菌和真菌dna)的相對量。在本申請中，因此優(yōu)選稱為宿主dna的“相對豐度”(或“相對量”)。
優(yōu)選地，利用人特異性核酸片段比如引物和/或探針，通過qpcr測量宿主dna豐度。
如本文所使用的，可互換的術語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核苷酸序列”是指精確連續(xù)的天然核苷酸(例如a、t、g、c和u)，其對應于單鏈或雙鏈dna，比如cdna、基因組dna、核糖體dna或質(zhì)粒dna、以及所述dna的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，比如rna。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以通過任何已知的方法進行分離和制備，包括但不限于任何合成方法、任何重組方法、任何離體生成方法等、及其組合。
在宿主dna中進行qpcr所需或有用的探針和引物在本發(fā)明的上下文中被稱為“核酸片段”。
通過“核酸片段”，本文中更通常地指與感興趣的核酸雜交的核酸。例如，這樣的核酸片段長度可以是至少10個核苷酸，或者優(yōu)選長度至少為15個核苷酸。它們也可以是至少25個或至少50個核苷酸長度。
根據(jù)本發(fā)明的核酸片段對宿主dna是特異性的，優(yōu)選對人宿主dna，因為它們允許將存在于生物樣本中的宿主dna和其它dna(即非宿主dna)區(qū)分開，其中所述其它dna比如真菌和/或細菌dna(即微生物dna)。換句話說，本發(fā)明的核酸片段將與宿主dna雜交，但不會(或基本上不)結(jié)合存在于生物樣本中大部分其它dna(即非宿主dna)，比如真菌和/或細菌dna(即微生物dna)。
在本發(fā)明的上下文中，核酸片段優(yōu)選在嚴格雜交條件下與宿主dna雜交。嚴格雜交條件的一個實例是，在約50℃至約65℃，更優(yōu)選約55℃至約65℃的溫度下，使用例如約0.9摩爾的鹽溶液進行嘗試雜交。然而，技術人員將能夠改變這樣的條件，以便考慮比如核酸片段長度、堿基組成、存在的離子類型等變量。
“引物”更具體地指，用作感興趣的核酸(即本文的宿主dna)擴增起始點的核酸片段。本發(fā)明的核引物的實例包括但不限于序列seqidno：1、seqidno：2、seqidno：4和seqidno：5的引物。這種引物可按照“引物組”的形式而使用以擴增宿主dna。本發(fā)明引物組的實例包括但不限于引物組(seqidno：1、seqidno：2)和(seqidno：4、seqidno：5)。
“探針”更具體地指，可用于檢測感興趣的核酸的核酸片段，即本文中的宿主dna。該術語包括各種衍生形式，例如“熒光探針”。當與如上定義的引物組組合使用時，所述探針可用于定量感興趣的核酸。本發(fā)明的探針的實例包括但不限于序列seqidno：3和seqidno：6的探針。探針可以被同位素、放射性標記、比如生物素的結(jié)合部分、比如地高辛的半抗原、發(fā)光的、質(zhì)量標簽、磷光或熒光部分、或單獨的熒光染料(例如，mgb、fam、vic、tet、ned、tamra、joe、hex、rox等)或與其它染料組合進行標記。這些標記提供可通過熒光、放射性、比色法、重量分析、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性、質(zhì)譜、結(jié)合親和力等可檢測的信號，并且便于檢測或定量感興趣的核酸。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用至少一種選自序列seqidno：1至seqidno：6的核酸片段、其變體及其互補序列的核酸片段，通過定量pcr(qpcr)測量宿主dna豐度。
更優(yōu)選地，使用與序列seqidno：3的探針組合的引物組(seqidno：1、seqidno：2)和/或使用與序列seqidno：6的探針組合的引物組(seqidno：4、seqidno：5)，通過定量pcr(qpcr)來測量宿主dna豐度。
術語“互補”是指，例如，第一核酸序列的每個核苷酸與方向相反的第二核酸序列的互補堿基配對?；パa核苷酸是a和t(或a和u)或c和g。
根據(jù)本發(fā)明的核酸片段的“變體”包括但不限于與所述核酸片段比對之后具有至少99％同一性、并且保留其與感興趣的核酸(此處為宿主dna)雜交的能力的核酸序列。變體的實例是簡并核酸片段。
本發(fā)明的方法可以應用于任何受試者，無論是人還是動物。然而，在優(yōu)選的實施方案中，它適用于人患者，尤其是疑似患有cd的人，或需要確認患有cd的人。更準確地說，本發(fā)明的方法適用于監(jiān)測顯示出增強水平的炎癥標記物的人患者，其中所述炎癥標記物比如血小板計數(shù)、平均血小板體積、紅細胞沉降率(esr)、血清血小板生成素、血清促紅細胞生成素、c-反應性蛋白和血清類黏蛋白(α1酸性糖蛋白)、tnfα、白細胞介素(特別是il1、il2、il6、il8、il10、il15)以及排泄物的炎癥標記物，如乳鐵蛋白和鈣網(wǎng)蛋白。診斷cd的精確方法詳見laas等人，2014，其通過引用并入本文。更優(yōu)選地，受試者不患有以下病理中的至少一種：癌癥或癌前病變，特別是結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸腺瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、微小結(jié)腸炎(比如膠原性結(jié)腸炎或淋巴細胞性結(jié)腸炎)、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎(diversioncolitis)、過敏性結(jié)腸炎、白塞病、結(jié)腸直腸息肉、乳糜瀉、腸易激綜合征(ibs)及其任何組合。
在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)明方法的步驟a)中使用的生物樣本是糞便樣本。事實上，這樣的樣本可以通過來自患者完全無害的收集來獲得。優(yōu)選地，收集所述糞便樣本并存儲在適當?shù)木彌_液中，所述緩沖液不變性或影響其中所含的dna(在該目的中，可以使用例如rna
如本文所用，術語“參考值”是指可用于鑒定已知宿主dna較少(poor)的樣本的特定值或數(shù)據(jù)集。例如從健康受試者獲得的歷史豐度數(shù)據(jù)中獲得該參考值。它可以是單截止值，比如中位數(shù)或平均值。它可以是單個數(shù)字，等同地適用于每個樣本。在優(yōu)選的實施方案中，該參考值是預先確定的值。通常，這個預先確定的值是約1％。
原則上，健康受試者的糞便樣本沒有宿主dna。因此，受試者的糞便樣本中宿主dna的存在暗示著所述受試者可能患有腸道相關疾病。本發(fā)明還包括涉及檢測糞便樣本中宿主dna的存在的旨在診斷受試者中cd的所有方法。換句話說，涉及使用宿主dna作為cd標記物的任何診斷方法都包含在本發(fā)明內(nèi)。
在本發(fā)明的背景下，當比參考值高(優(yōu)選10倍，更優(yōu)選高20倍)時，這意味著待測試的受試者的宿主dna的相對豐度“高于參考值”。在優(yōu)選的實施方案中，當上面定義的宿主dna的相對豐度高于1％，優(yōu)選高于10％，更優(yōu)選高于20％時，可以得出結(jié)論待測試的受試者患有cd。
其它方面，宿主dna的量與參考值進行比較。所述比較可以由本領域技術人員使用統(tǒng)計方法進行，特別是可以使用roc曲線來確定靈敏度和特異性的最佳截止值。
在具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括：在患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者的糞便樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna相對豐度，其中定量數(shù)據(jù)代表宿主dna相對豐度，優(yōu)選和約1％的參考值進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種用于體外分析來自患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者的生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得糞便樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)確定所述相對豐度是否高于約1％的參考值。
更具體而言，在具體的實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
a)從人患者獲得糞便樣本，
b)通過任何以上公開的常規(guī)方法確定所述樣本中人dna的相對豐度，
以及
c)當所述相對豐度高于約1％時，診斷所述患者患有克羅恩氏病。
測量方法，尤其是監(jiān)測cd狀態(tài)的方法
另一方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：進行至少一種分析以確定所述受試者的生物樣本中宿主dna相對豐度，其中定量數(shù)據(jù)表示宿主dna相對豐度，優(yōu)選與參考值進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種體外分析來自患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者的生物樣本的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)確定所述相對豐度是否高于參考值。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約10％。
本發(fā)明還涉及一種針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：進行至少一種分析以確定所述受試者的生物樣本中宿主dna相對豐度，其中定量數(shù)據(jù)表示宿主dna相對豐度，優(yōu)選與第一參考值和第二參考值進行比較。
在優(yōu)選的實施方案中，所述第一參考值為約10％，所述第二參考值為約1％。
換句話說，本發(fā)明涉及一種用于體外分析來自患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者的生物樣本的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)確定所述相對豐度是否低于第一參考值并高于第二參考值。
在優(yōu)選的實施方案中，所述第一參考值為約10％，所述第二參考值為約1％。
更具體地，本發(fā)明人獲得的結(jié)果允許鑒定生物標記物(宿主dna)，所述生物標記物特別是以非侵入性方式區(qū)分患有非活躍(靜止狀態(tài))克羅恩氏病的患者和患有侵襲性克羅恩氏病(緊急惡化期有關的狀態(tài))的患者。因此，其結(jié)果是監(jiān)測疾病階段的特定值。
在本發(fā)明的上下文中，“穩(wěn)定”患者被定義為在幾周內(nèi)其疾病活動性穩(wěn)定的cd患者(患者處于“穩(wěn)定狀態(tài)”)。而“不穩(wěn)定”的患者(或患者“處于不穩(wěn)定狀態(tài)”)是在接下來的幾周內(nèi)改變或加強其治療的cd患者，其血液檢查顯示在接下來的幾周內(nèi)有升高的活動性，和/或其自我評價顯示連續(xù)樣本中健康下降和/或鈣網(wǎng)蛋白水平已經(jīng)升高，和/或具有全身性粘膜炎癥，更特別是全身性粘膜潰瘍。也可以根據(jù)結(jié)腸鏡分數(shù)比如cdeis或ses-cd來定義穩(wěn)定或不穩(wěn)定。
因此，本發(fā)明更具體地針對一種旨在診斷患有cd的受試者中這兩種特定狀態(tài)的方法。
更準確地說，本發(fā)明涉及一種體外診斷受試者中克羅恩氏病活動性的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)當所述相對豐度高于參考值時，診斷所述受試者患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
上述方法優(yōu)于現(xiàn)有技術，因為它們是非侵入性的、經(jīng)濟上可接受的、并且具有高特異性。
上述所有實施方案，特別是本發(fā)明的診斷方法，也適用于本方法，特別是用于監(jiān)測克羅恩氏病的活動性。
特別地，所述受試者可以是疑似患有cd、或需要確認患有cd或已被診斷患有cd的人患者。更準確地說，本發(fā)明的方法適用于監(jiān)測顯示增強水平的炎癥標記物的人患者，其中所述炎癥標記物比如血小板計數(shù)、平均血小板體積、紅細胞沉降率(esr)、血清血小板生成素、血清促紅細胞生成素、c-反應性蛋白和血清類黏蛋白(α1酸性糖蛋白)、tnfα、白細胞介素(特別是il1、il2、il6、il8、il10、il15)以及排泄物的炎癥標記物，如乳鐵蛋白和鈣網(wǎng)蛋白。診斷cd的精確方法詳見laas等人，2014，其通過引用并入本文。
此外，生物樣本優(yōu)選為糞便樣本，更優(yōu)選如上所述處理。
在優(yōu)選的實施方案中，如上所述，確定宿主dna的相對豐度。
當確定宿主dna的相對豐度，并直接或間接地和參考值比較時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的這些方法是高度敏感和特異性的。
如本文所使用的，術語“參考值”是指可用于鑒定具有穩(wěn)定cd的樣本的特定值或數(shù)據(jù)集。例如，從已經(jīng)毫無疑義地被診斷為穩(wěn)定cd的患者或者患者庫獲得的歷史豐度數(shù)據(jù)中獲得該參考值。例如，通過測量處于cd穩(wěn)定狀態(tài)的患者糞便樣本中宿主dna的相對豐度而獲得該參考值。它可以是單截止值，比如中位數(shù)或平均值。它可以是單個數(shù)字，等同地適用于每個樣本。所述參考值也是預先確定的值。通常，這個預先確定的值是約10％。
在優(yōu)選的實施方案中，如上所限定的，當宿主dna的相對豐度高于10％，優(yōu)選高于18％，更優(yōu)選高于20％時，可以得出結(jié)論待測試的患者患有不穩(wěn)定的cd。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括：在患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者的糞便樣本中進行至少一種分析以確定宿主dna相對豐度，其中定量數(shù)據(jù)表示宿主dna相對豐度，優(yōu)選與約10％的參考值進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種用于體外分析患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者中生物樣本的方法，所有方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得糞便樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
以及
c)確定所述相對豐度是否高于約10％的參考值。
更確切地說，在這個具體的實施方案中，本發(fā)明的體外診斷方法能夠診斷人患者中的克羅恩氏病的不穩(wěn)定狀態(tài)，包括以下步驟：
a)通過任何上述方法測量所述患者糞便樣本中人dna的相對豐度，
以及
b)當所述相對豐度高于10％時，確定所述患者患有不穩(wěn)定cd。
相反，本發(fā)明還允許針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)，或換句話說，分析來自所述受試者的生物樣本，特別是用于診斷穩(wěn)定的cd。在這種情況下，當所述受試者的生物樣本中測量的宿主dna的相對豐度高于用于診斷cd的參考值(通常為1％)但是低于用于診斷疾病不穩(wěn)定狀態(tài)的參考值(通常為10％)時，可以得出結(jié)論受試者患有穩(wěn)定的cd。
如上所述，本發(fā)明的方法可以包括(或排除)這樣的步驟，其由獲得糞便樣本并從所述樣本提取核酸分子組成。
原則上，靜止(非活動性)cd的受試者糞便樣本具有0至10％之內(nèi)的宿主dna相對豐度(例如，取決于測量技術)。然而，受試者的糞便樣本中存在中間水平的宿主dna(通常在1％至10％之間)提示所述受試者可能患有cd，并且所述cd處于靜止狀態(tài)。此外，受試者的糞便樣本中存在高水平的宿主dna(通常超過10％)提示所述受試者可能患有cd，并且所述cd處于活躍狀態(tài)。因此，本發(fā)明涵蓋旨在診斷受試者中cd狀態(tài)的的涉及在糞便樣本中檢測宿主dna存在的所有方法。換句話說，涉及使用宿主dna作為cd狀態(tài)的標記物的任何診斷方法都包含在本發(fā)明內(nèi)。
測量方法，尤其是用于設計治療的方法
在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷方法可用于針對患有克羅恩氏病的受試者調(diào)整治療。
在這個實施方案中，本發(fā)明的方法因此包括針對待診斷的受試者而設計治療的附加步驟，所述治療經(jīng)調(diào)整以適應(比如通過本發(fā)明的方法)經(jīng)診斷的cd的特定狀態(tài)。
因此，根據(jù)這一方面，本發(fā)明涉及一種治療患有克羅恩氏病的受試者的方法，包括：
i)根據(jù)上述方法，針對患有或疑似患有不穩(wěn)定或穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)，
以及
ii)用適當?shù)闹委焷韺λ鍪茉囌哌M行治療，所述適當?shù)闹委熯x自執(zhí)業(yè)醫(yī)生所通常決定的(attributed)那些治療。
換句話說，本發(fā)明涉及一種治療患有克羅恩氏病的受試者的方法，包括：
i)根據(jù)上述方法，對患有或疑似患有不穩(wěn)定或穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者的生物樣本進行分析，
以及
ii)用適當?shù)闹委焷韺λ鍪茉囌哌M行治療，所述適當?shù)闹委熯x自執(zhí)業(yè)醫(yī)生所通常決定的那些治療。
更優(yōu)選，本發(fā)明包括用于治療患有克羅恩氏病的受試者的方法，所述方法包括以下步驟：
i)根據(jù)上述方法診斷受試者中cd的活動性，
以及
ii)當診斷所述cd的狀態(tài)后，用適當?shù)闹委焷韺λ鍪茉囌哌M行治療，所述適當?shù)闹委熯x自執(zhí)業(yè)醫(yī)生所通常決定的那些治療。
例如，當cd患者被診斷為不穩(wěn)定狀態(tài)時，則適應的治療可以是選自以下的藥理學治療：硫唑嘌呤、美沙拉嗪、阿巴他汀、阿達木單抗、阿那白滯素、賽妥珠單抗、依那西普、戈立木單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、托珠單抗、那他珠單抗、皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤、他克莫司、抗jak(托法替尼)、抗整聯(lián)蛋白(vedolizu單抗、rhumabbeta7、madcam-1拮抗劑)或抗il12/il23(優(yōu)特克單抗、abt874)。
或者，當克羅恩氏病患者被診斷為穩(wěn)定狀態(tài)時，適應的治療將是生活方式干預，例如不同熱量限制強度和大量營養(yǎng)素組成(低碳水化合物、低脂肪、飽和脂肪飲食)的飲食。
此外，可以使用本發(fā)明的方法用于測試患有cd的受試者的治療效果，特別是處于不穩(wěn)定狀態(tài)的cd，或評估患者對治療的反應。
在本實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
i)根據(jù)上述方法，在施用治療前后，針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)，
以及
ii)當施用治療前的狀態(tài)不穩(wěn)定，但施用治療后變得穩(wěn)定時，得出治療對所述受試者有效的結(jié)論。
換句話說，本發(fā)明的方法包括：
i)根據(jù)上述方法，在施用治療前后，對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者生物樣本進行分析，
以及
ii)當施用治療前的狀態(tài)不穩(wěn)定，但施用治療后變得穩(wěn)定時，得出治療對所述受試者有效的結(jié)論。
更準確地說，本發(fā)明的方法包括：
i)根據(jù)上述方法，在施用治療前后，診斷cd的活動性，
以及
ii)當施用治療前的狀態(tài)不穩(wěn)定，但施用治療后變得穩(wěn)定時，得出治療對所述受試者有效的結(jié)論。
當克羅恩氏病患者在施用治療前被診斷為“不穩(wěn)定”，并且施用治療后變得“穩(wěn)定”時，則所述患者對所述治療有響應。因此，優(yōu)選維持有效的治療。
相反，當克羅恩氏病患者在施用治療前被診斷為“不穩(wěn)定”，并且施用治療后維持“不穩(wěn)定”時，則所述患者對所述治療不響應，最好將所述治療替換成另一種治療或?qū)⑵渑c另一種治療相結(jié)合。
值得注意的是，當克羅恩氏病患者在施用治療前被診斷為“穩(wěn)定”時，不值得施用任何化學治療，因為生活方式干預就足夠了。
組合的測量方法，尤其是用于診斷
本發(fā)明人進一步提出，將宿主dna豐度的測量與通常用于診斷cd和/或cd狀態(tài)(即，活躍型與靜止狀態(tài))的另一標記物的測量進行組合。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明因此涉及一種針對患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值、和所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否高于150μg/ml或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度高于參考值時，以及當所述鈣網(wǎng)蛋白水平高于150μg/ml時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約1％。
本領域技術人員將很容易理解，以μg/ml(或以μg/g)表示的鈣網(wǎng)蛋白水平是指鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平，或換句話說是指鈣網(wǎng)蛋白的蛋白表達水平。蛋白表達水平可以通過本領域眾所周知的任何方法進行評估，特別是由reeves等人(2000)和schena(2005)綜述的。這些方法通常涉及使感興趣的生物學樣本與一種或多種可檢測的試劑接觸，所述試劑適合于測量蛋白表達水平，比如抗體，并且隨后基于所檢測的試劑的水平確定蛋白的表達水平，優(yōu)選在歸一化之后。通常涉及使用抗體的方法的實例包括但不限于western印跡、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)、酶聯(lián)免疫斑點(elispot)、放射免疫分析(ria)、免疫組織化學和免疫沉淀。不一定涉及使用抗體的、適合于測量蛋白表達水平的其它方法也可以使用，包括但不限于熒光激活細胞分選(facs)、顯微鏡比如原子力顯微鏡、流式細胞術、微細胞計數(shù)、蛋白結(jié)合分析、配體結(jié)合分析、微陣列、聚丙烯酰胺凝膠電泳比如sds-page、表面等離子共振(spr)、
在另一個優(yōu)選實施方案中，宿主dna相對豐度和鈣網(wǎng)蛋白水平可以在受試者的同一生物樣本中進行測量。
因此，本發(fā)明還涉及一種用于針對患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值、和所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否高于150μg/ml或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度高于參考值時，以及當所述鈣網(wǎng)蛋白水平高于150μg/ml時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約1％。
在優(yōu)選的實施方案中，在待測試的受試者的糞便樣本中測量鈣網(wǎng)蛋白。在更優(yōu)選的實施方案中，如上所述，在相同的糞便樣本中進行宿主dna和鈣網(wǎng)蛋白檢測。然而，這可能需要進行兩種單獨類型的檢測，一種用于測量宿主dna相對豐度(例如通過qpcr)，以及一種用于測量鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平(例如通過elisa)。
因此，另一方面，本發(fā)明提出了測量鈣網(wǎng)蛋白的基因水平，從而可以在本發(fā)明的方法中進行單一類型的檢測。更優(yōu)選地，這樣的檢測在相同的容器中進行，甚至更優(yōu)選在相同的生物樣本比如糞便樣本中進行。
在這方面，即使這些類型的功能實體(即由所述基因編碼的基因和蛋白)的行為不能彼此預測，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白的蛋白和基因水平彼此相關。實際上，本領域眾所周知的是，蛋白一經(jīng)轉(zhuǎn)錄，其表達水平仍然可以在翻譯水平上被調(diào)節(jié)，并且相應的蛋白可以進行翻譯后修飾，而改變半衰期和區(qū)域劃分。
因此，根據(jù)這方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和第一參考值進行比較；以及
b)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白基因水平，優(yōu)選與第二參考值進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于第一參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白基因水平是否高于第二參考值或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度高于第一參考值時，以及當所述鈣網(wǎng)蛋白水平高于第二參考值時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，關于宿主dna的所述第一參考值如上所定義，更優(yōu)選為約1％。
基因水平或基因表達水平可以通過本領域熟知的任何方法測量，比如上述用于測量宿主和微生物dna的那些。編碼鈣網(wǎng)蛋白的基因在本領域是眾所周知的。特別地，已知人鈣網(wǎng)蛋白形成由s100鈣結(jié)合蛋白a8(s100a8，也稱為鈣粒蛋白a)和s100鈣結(jié)合蛋白a9(s100a9，也稱為鈣粒蛋白b或遷移抑制因子相關蛋白14(mrp14))組成的異二聚體。以genbank登錄號cr407674，版本號：cr407674.1可獲得人s100a8基因的核苷酸序列，而以ncbi參考序列登錄號nm_002965，版本號：nm_002965.3可獲得人s100a9基因之一。
在優(yōu)選的實施方案中，第二參考值是一個特定的值或數(shù)據(jù)集，其可用于鑒定已知屬于健康受試者的樣本(即未患有克羅恩氏病)。因此，所述參考值可以由本領域技術人員容易地確定。它可以是一個單一的截止值，比如中位數(shù)或平均值。它可以是單個數(shù)字，等同地適用于每個樣本。在優(yōu)選的實施方案中，該參考是預先確定的值。因此，本文“高于第二參考值”表示鈣網(wǎng)蛋白基因水平超過所述參考值。
用于測量宿主dna相對豐度和/或鈣網(wǎng)蛋白基因水平的特別優(yōu)選的技術是qpcr，使用例如特異于編碼鈣網(wǎng)蛋白的基因的核酸片段(比如引物和/或探針)。
“組合臨床分數(shù)”，這里是指這樣的任何分數(shù)，其將生物學參數(shù)與臨床參數(shù)結(jié)合以產(chǎn)生與cd中的疾病嚴重程度或粘膜治愈相關的分數(shù)。它可以是例如鈣網(wǎng)蛋白水平(在患有cd的患者中通常高于150μg/ml)、hbi(通常在患有cd的患者中高于4)、性別、年齡、疾病持續(xù)時間、血小板計數(shù)、白蛋白、血小板、crp、直腸出血的組合(摘要op05，第七屆ecco大會)。
“預先確定的分數(shù)”，這里是指通過任何統(tǒng)計或算法方法將這些多重參數(shù)組合而產(chǎn)生的值。例如，鈣網(wǎng)蛋白為150μg/ml，hbi為4。
另一方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml或250μg/g進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種體外分析患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否高于150μg/ml或250μg/g或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更準確地說，本發(fā)明涉及用于體外診斷受試者中克羅恩氏病活動性的方法，包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度大于參考值時，并且當所述鈣網(wǎng)蛋白水平大于150μg/ml或250μg/g時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約10％。
在另一個優(yōu)選實施方案中，可以在受試者的相同生物樣本中測量宿主dna相對豐度和鈣網(wǎng)蛋白水平。
因此，本發(fā)明還涉及一種針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml或250μg/g進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者生物樣本的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否高于150μg/ml或250μg/g或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更準確地說，本發(fā)明涉及用于體外診斷受試者中克羅恩氏病活動性的方法，包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度大于參考值時，并且當所述鈣網(wǎng)蛋白水平大于150μg/ml或250μg/g時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約10％。
在優(yōu)選的實施方案中，在待測試的受試者的糞便樣本中測量鈣網(wǎng)蛋白。在更優(yōu)選的實施方案中，如上所述，在相同的糞便樣本中進行宿主dna和鈣網(wǎng)蛋白檢測。然而，這可能需要進行兩種單獨類型的檢測，一種用于測量宿主dna相對豐度(例如通過qpcr)，以及一種用于測量鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平(例如通過elisa)。
因此，另一方面，本發(fā)明提出了測量鈣網(wǎng)蛋白的基因水平，從而可以在本發(fā)明的方法中進行單一類型的檢測。更優(yōu)選地，這樣的檢測在相同的容器中進行，甚至更優(yōu)選在相同的生物樣本比如糞便樣本中進行。
因此，根據(jù)此方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和第一參考值進行比較；以及
b)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白基因水平，優(yōu)選與第二參考值進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于第一參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白基因水平是否高于第二參考值或所述組合臨床分數(shù)是否高于預先確定的分數(shù)。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度高于第一參考值時，以及當所述鈣網(wǎng)蛋白水平高于第二參考值時或者所述組合臨床分數(shù)高于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，關于宿主dna的所述第一參考值如上所定義，更優(yōu)選為約10％；以及關于鈣網(wǎng)蛋白的所述第二參考值優(yōu)選是患有靜止型克羅恩氏病(即，患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病)的受試者中觀察到的鈣網(wǎng)蛋白基因水平。
“組合臨床分數(shù)”，這里是指這樣的任何分數(shù)，其將生物學參數(shù)與臨床參數(shù)結(jié)合以產(chǎn)生與cd中的疾病嚴重程度或粘膜治愈相關的分數(shù)。它可以是例如鈣網(wǎng)蛋白水平、hbi、性別、年齡、疾病持續(xù)時間、血小板計數(shù)、白蛋白、血小板、crp、直腸出血的組合(摘要op05，第七屆ecco大會)。
“預先確定的分數(shù)”，這里是指通過任何統(tǒng)計或算法方法將這些多重參數(shù)組合而產(chǎn)生的值(參見例如，摘要op05，第七屆ecco大會中提及的參數(shù)和值)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml或250μg/g進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種體外分析患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者生物樣本的方法，所述方法包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否低于150μg/ml或250μg/g或所述組合臨床分數(shù)是否低于預先確定的分數(shù)。
更準確地說，本發(fā)明涉及用于體外診斷受試者中克羅恩氏病活動性的方法，包括步驟：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度大于參考值時，并且當所述鈣網(wǎng)蛋白水平低于150μg/ml或250μg/g時或者所述組合臨床分數(shù)低于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約1％。
在另一個優(yōu)選實施方案中，可以在受試者的相同生物樣本中測量宿主dna相對豐度和鈣網(wǎng)蛋白水平。
因此，本發(fā)明還涉及一種針對患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病的受試者而產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和參考值進行比較；以及
b)在所述樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與150μg/ml或250μg/g進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白水平是否低于150μg/ml或250μg/g或所述組合臨床分數(shù)是否低于預先確定的分數(shù)。
更準確地說，本發(fā)明涉及用于診斷受試者中穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度大于參考值時，并且當所述鈣網(wǎng)蛋白水平低于150μg/ml或250μg/g時或者所述組合臨床分數(shù)低于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，所述參考值為約1％。
在優(yōu)選的實施方案中，在待測試的受試者的糞便樣本中測量鈣網(wǎng)蛋白。在更優(yōu)選的實施方案中，如上所述，在相同的糞便樣本中進行宿主dna和鈣網(wǎng)蛋白檢測。然而，這可能需要進行兩種單獨類型的檢測，一種用于測量宿主dna相對豐度(例如通過qpcr)，以及一種用于測量鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平(例如通過elisa)。
因此，另一方面，本發(fā)明提出了測量鈣網(wǎng)蛋白的基因水平，從而可以在本發(fā)明的方法中進行單一類型的檢測。更優(yōu)選地，這樣的檢測在相同的容器中進行，甚至更優(yōu)選在相同的生物樣本比如糞便樣本中進行。
因此，根據(jù)此方面，本發(fā)明涉及一種針對患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)克羅恩氏病的受試者產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：
a)在所述受試者的生物樣本中進行至少一種分析，以確定宿主dna的相對豐度，其中第一定量數(shù)據(jù)表示宿主dna的相對豐度，優(yōu)選和第一參考值進行比較；以及
b)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中進行至少一種分析，以確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，其中第二定量數(shù)據(jù)表示所述鈣網(wǎng)蛋白水平，優(yōu)選與第二參考值和/或第三參考值進行比較，或所述組合臨床分數(shù)優(yōu)選與預先確定的分數(shù)進行比較。
換句話說，本發(fā)明涉及一種分析患有或疑似患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的受試者生物樣本的方法，所述方法包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)確定所述相對豐度是否高于第一參考值，以及所述鈣網(wǎng)蛋白基因水平是否低于第二參考值和/或高于第三參考值或所述組合臨床分數(shù)是否低于預先確定的分數(shù)。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于診斷受試者中穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病(cd)的方法，包括：
a)從所述受試者獲得生物樣本，
b)確定所述樣本中宿主dna的相對豐度，
c)在所述樣本(優(yōu)選此處的)或所述受試者的另一生物樣本中確定鈣網(wǎng)蛋白基因水平或組合臨床分數(shù)，
以及
d)當所述相對豐度高于第一參考值時，以及當所述鈣網(wǎng)蛋白水平低于第二參考值和/或高于第三參考值時或者所述組合臨床分數(shù)低于預先確定的分數(shù)時，診斷所述受試者患有穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病。
在優(yōu)選的實施方案中，對于穩(wěn)定狀態(tài)，關于宿主dna的所述第一參考值如上所定義(1％)；關于鈣網(wǎng)蛋白的所述第二參考值優(yōu)選是患有活躍型克羅恩氏病(即，患有不穩(wěn)定狀態(tài)的克羅恩氏病)的受試者中觀察到的鈣網(wǎng)蛋白基因水平；和/或關于鈣網(wǎng)蛋白的所述第三參考值優(yōu)選是健康受試者(即，不患有克羅恩氏病)中觀察到的鈣網(wǎng)蛋白基因水平。
“組合臨床分數(shù)”，這里是指這樣的任何分數(shù)，其將生物學參數(shù)與臨床參數(shù)結(jié)合以產(chǎn)生與cd中的疾病嚴重程度或粘膜治愈相關的分數(shù)。它可以是例如鈣網(wǎng)蛋白水平、hbi、性別、年齡、疾病持續(xù)時間、血小板計數(shù)、白蛋白、血小板、crp、直腸出血的組合(摘要op05，第七屆ecco大會)。
“預先確定的分數(shù)”，這里是指通過任何統(tǒng)計或算法方法將這些多重參數(shù)組合而產(chǎn)生的值(參見例如，摘要op05，第七屆ecco大會中提及的參數(shù)和值)。
這些方法適用于任何受試者，人或動物。然而，在優(yōu)選的實施方案中，它們適用于人患者，尤其是疑似患有cd的人，或需要確認患有cd的人，或已經(jīng)診斷為cd的人。
用于本發(fā)明方法的生物樣本優(yōu)選是糞便樣本。
在優(yōu)選的實施方案中，通過使用上述基于多核苷酸雜交分析的譜(profiling)方法和/或多核苷酸的測序，確定相對dna豐度。
如上述，根據(jù)本領域技術人員通常已知的任何方法測量鈣網(wǎng)蛋白水平。優(yōu)選，鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平表示為μg/ml或μg/g。
這些方法與現(xiàn)有技術相比具有顯著的優(yōu)點，特別是與僅僅涉及測量糞便樣本中鈣網(wǎng)蛋白水平的那些方法相比較。實際上，如本領域技術人員所知，這樣的診斷方法不夠靈敏，并且給出假陽性結(jié)果。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，兩個測量(步驟b)和步驟c))沒有反映出簡單的相關性：人dna的百分比在鈣網(wǎng)蛋白高于150μg/ml的樣本中顯著提高，這反映出具有腸道炎癥征兆的患者糞便中存在更多的人dna。因此，盡管這兩種測量相關，但它們似乎并不是恰好捕獲臨床疾病的相同臨床特征。
測量宿主dna相對豐度和鈣網(wǎng)蛋白基因水平的優(yōu)選技術是qpcr。
本發(fā)明方法中使用的試劑盒
可以例如通過使用預包裝試劑盒來進行上述方法，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或由本發(fā)明的核酸片段組成。
因此，本發(fā)明涉及用于本發(fā)明任何方法的試劑盒，所述試劑盒包含或由以下組成：
a)至少一種與宿主dna特異性雜交的核酸片段；
以及
b)進行所述方法的說明書。
如本文所使用的，術語“說明書”是指可用于傳達如何進行本發(fā)明方法的出版物、記錄、圖表或任何其它介質(zhì)。所述說明書可以例如附加到包含所述試劑盒的容器中。優(yōu)選地，使用所述試劑盒的說明書包括參考值。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，與宿主dna特異性雜交的所述核酸片段選自序列seqidno：1至seqidno：6的核酸片段、其變體及其互補序列。
更優(yōu)選地，所述試劑盒包含或由以下組成：
a)引物組(seqidno：1、seqidno：2)和序列seqidno：3的探針；和/或引物組(seqidno：4、seqidno：5)和序列seqidno：6的探針；以及
b)進行所述方法的說明書。
然而，甚至更優(yōu)選地，上述試劑盒可進一步包含：
c)至少一種能夠特異性確定鈣網(wǎng)蛋白的蛋白或基因水平的試劑。
術語“能夠特異性地確定鈣網(wǎng)蛋白水平的試劑”或“能夠特異確定鈣網(wǎng)蛋白表達水平的試劑”是指特異性識別鈣網(wǎng)蛋白并允許在蛋白質(zhì)或基因水平上定量其表達水平的試劑或試劑套裝。這些試劑可以是例如特異性識別蛋白質(zhì)鈣網(wǎng)蛋白的抗體、適體或親和體，或者識別編碼鈣網(wǎng)蛋白的基因的核酸片段，比如引物和/或探針。在本發(fā)明的上下文中，當所述試劑1)顯示出結(jié)合和/或雜交活性的閾值水平，和/或2)與已知和鈣網(wǎng)蛋白相關的靶分子沒有顯著交叉反應，則認為所述試劑是鈣網(wǎng)蛋白“特異性的”或“特異性識別”鈣網(wǎng)蛋白。這種試劑的結(jié)合親和力可以容易地通過本領域技術人員來確定，例如通過scatchard分析。試劑的交叉反應性也可以由本領域技術人員容易地確定，因此需要在本文中進一步詳細描述。能夠特異性確定鈣網(wǎng)蛋白表達水平的試劑的實例包括但不限于，抗鈣網(wǎng)蛋白抗體(比如來自invitrogen的mac387igg1)和與編碼鈣網(wǎng)蛋白的基因特異性地雜交的核酸片段，比如上述s100a8和/或s100a9。
本發(fā)明進一步涉及如上所述的試劑盒在本發(fā)明任何方法中的用途(特別是體外用途)。
實施例
實施例1
1.材料和方法
1.1.群體
1.1.1cd群體
所有參與者都是“crohnometer1”研究的一部分，其目的是從克羅恩氏病患者的不同人群中收集糞便樣本，以調(diào)查其腸道微生物群。研究的納入標準是克羅恩氏病的臨床診斷、和參與者簽署知情同意書。crohnometer1是一項縱向研究，平均每個參與者在8個月的時間段內(nèi)提供8個糞便樣本。共包括99名參與者并提供糞便樣本。在99名參與者中，68人的糞便樣本進行了測序。總共438個樣本被測序。
每次將糞便樣本提供給研究時，各研究參與者填寫問卷。問卷捕獲了有關患者健康和糞便特征的信息。特別是以下信息用于評估疾病活動性/炎癥狀態(tài)：
-測量鈣網(wǎng)蛋白水平(以患者糞便計)(鈣網(wǎng)蛋白是表示炎癥的蛋白質(zhì)標記物)；
-記錄每個患者的harvey-bradshaw指數(shù)(hbi)。hbi是一種復合自動評估的指標，其反映了患者的一般健康狀況。該分數(shù)基于對一般健康情況(well-being)的評估、腹痛的評估、每天液體糞便的數(shù)量、腹部腫塊的存在、和并發(fā)癥的存在。廣泛用于克羅恩氏病患者狀況的評估。
1.1.2健康對照群體
由健康個體組成對照個體組。主要排除標準是使用處方藥和重大疾病史。從相同的個體收集多個樣本，產(chǎn)生總共137個樣本。
1.1.3nash對照群體
對另外兩個來自更大研究的nash患者進行了測序。更大的nash研究稱為nash2，其目的是從nash患者的不同群體中收集糞便樣本，以調(diào)查其腸道微生物群，并鑒定nash與單純性脂肪變性患者之間的差異。從那兩名患者中獲得6個樣本。該群體盡管小，其被選擇用作不位于腸道的炎癥性疾病的對照群體。
1.2樣本收集和制備
1.2.1排泄物取樣
每三個星期，為cd群體的受試者提供含有dna穩(wěn)定劑和書面說明的專用收集試劑盒，從而從家里收集糞便樣本。在經(jīng)過驗證的dna保存緩沖液(通常為rna
同樣的收集試劑盒用于對照群體。
1.2.2dna提取
將每個排泄物樣本的冷凍等份試樣懸浮于250μl硫氰酸胍0.1mtris(ph7.5)和40μl10％n-月桂酰肌氨酸中。然后，將懸浮液進行劇烈的珠粒振搖(beating)以從微生物細胞釋放dna，并使用標準方案(godon等人，1997)進行dna提取。通過nanodrop和agilent和瓊脂糖凝膠電泳評估dna完整性和濃度。
1.3illumina測序
在hiseq2500illumina測序儀上在iso17025認證實驗室進行測序。他們使用iso17025認證的方法hshov4pe100。dna文庫的制備遵循制造商的指導(illumina)。測序設備提供者所建議的工作流程用于進行不同的步驟：簇生成、模板雜交、等溫擴增、線性化、封閉和變性以及測序引物的雜交。使用提供者的pipeline進行堿基識別(base-calling)。為每個樣本生成了4000萬個最小雙端(paired-end)讀取的目標。測序讀取長度為100bp。
1.4生物信息學處理
使用enterome的內(nèi)部pipeline處理原始讀取。簡要地說，pipeline基于mocat(kultima等人，2012)和內(nèi)部腳本的匯編。它由使用mocatv1.3的質(zhì)量控制、繪圖(mapping)和基因豐度計算組成，包括illumina接頭(adapter)和人基因組(hg19)的列表。繪制到人基因組上的讀取數(shù)目基于在90％長度上95％的同一性，質(zhì)量控制步驟之后進行返回，質(zhì)量控制步驟包括修剪具有低質(zhì)量分數(shù)的堿基。使用1—繪制到hg19的讀取數(shù)目/修剪后的讀取數(shù)目來計算樣本中人讀取的百分比。
2.結(jié)果
2.1對照與克羅恩氏病患者(cd)的比較
使用wilcoxon秩和檢驗，我們比較了來自健康對照的137個樣本、來自nash患者的6個、以及來自cd患者的438個樣本。cd相對于健康對照的p值具有高度顯著性(p值＝1.667e-12)，圖1。表1提供了兩個群體的總結(jié)統(tǒng)計。
表1：繪制到人基因組hg19上的讀取百分比的總結(jié)統(tǒng)計
來自健康對照的樣本中99％在其總糞便dna中均含有小于1％的人dna，相比之下克羅恩氏病樣本為84％。因此，截止值為1％，可以捕獲16％的克羅恩氏病樣本。因此，糞便中dna的存在是高度特異性的。
2.2克羅恩氏病患者(cd)中的疾病嚴重程度相關性
鑒于克羅恩氏病患者與健康對照在糞便樣本中人dna百分比方面存在高度顯著的差異，研究了與疾病嚴重程度的關系，以評估宿主dna相對豐度的度量是否可以用作疾病活動性的標記物。
為此，根據(jù)三個標準將患者分為疾病的活躍型組：1)他們是否具有150以上的鈣網(wǎng)蛋白水平，
2)他們是否具有4以上的hbi分數(shù)，
3)他們是否具有4以上的hbi分數(shù)，或他們的鈣網(wǎng)蛋白水平在150以上(組合分數(shù))。
基于wilcoxon秩和檢驗，靜止型患者糞便樣本(n＝227)和cd活躍期患者的糞便樣本(n＝211)中人dna百分比(相對豐度)之間的差異高度顯著(參見圖2，p-val＝1.034e-09)。
具有超過20％人dna的樣本中的95％來自活躍型患者。
具有超過10％人dna的樣本中的90％來自活躍型患者。
具有超過1％人dna的樣本中的80％來自活躍型患者。
roc曲線(圖4)是視覺上的呈現(xiàn)，其表示基于各種截止值的真和假陽性數(shù)目。從左下角可以看出，具有非常高的特異性(100％，但靈敏度低，只有約10％的患者被捕獲)。直線代表“非信息”分數(shù)。
單獨考察鈣網(wǎng)蛋白水平時，并將其與人dna(圖3)進行比較，這兩種測量并不反映簡單的相關性，但鈣網(wǎng)蛋白高于150μg/ml(p值＝1.041e-07)的樣本中人dna的百分比顯著提高，這反映了這樣的事實，即在具有腸道炎癥征兆的患者糞便中存在更多的人dna。有趣的是，盡管這兩種測量相關，但它們似乎并不是恰好捕獲臨床疾病的相同臨床特征，因為從圖3可以看出一些樣本具有非常高的鈣網(wǎng)蛋白水平并且沒有人dna。
實施例2
1.材料和方法
1.1群體
如上述，參與者是“crohnometer1”研究的一部分。共11個糞便樣本進行了測序。群體符合與實施例1相同的標準。
1.2樣本收集和制備
1.2.1排泄物取樣和dna提取
根據(jù)和上述實施例1中詳述的相似過程，進行排泄物取樣和dna提取。
1.2.2在宿主dna上進行qpcr
使用
以400nm終濃度運行引物，探針具有200nm終濃度。
每個反應跨越10萬個拷貝至6.10個拷貝的標準曲線和樣本一同運行，標準品之間的稀釋因子為4x。樣本歸一化為4.84ng/μl的濃度，這至少為10倍稀釋度。
表2.用于宿主dna的qpcr定量的引物和探針
使用閾值法生成來自cfx管理軟件(bio-rad)的數(shù)據(jù)cq值。閾值設置為230。從cfx管理軟件(bio-rad)獲得標準曲線。使用標準曲線在cfx管理中計算樣本濃度。
1.2.3qpcr數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
基于繪制到人基因組的讀取數(shù)目除以樣本中總讀取數(shù)目來計算估計的人dna百分比。使用validprime分析，該百分比與人dna的定量相關。
通常根據(jù)數(shù)據(jù)的線性回歸分析來確定使用另一變量(qpcr分析)的值來預測變量(人dna)的值的能力，假設兩個變量之間存在線性響應。統(tǒng)計分析在r中進行。
2.結(jié)果
2.1通過qpcr特異性引物進行的宿主dna豐度定量
圖5顯示了使用vp5和vp9引物和探針進行的qpcr分析之間產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)中的統(tǒng)計學顯著相關性(相關性＝0.964)。
圖6和圖7顯示使用vp5(圖6)或vp9(圖7)引物和探針進行的qpcr分析產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)以及通過實施例1中提出的方法測量的人dna百分比(即illumina測序)中的統(tǒng)計學顯著相關性(對于vp5分析，相關性＝0.909，以及對于vp9分析為0.927)。
因此，使用上述表2中所述的vp5和vp9引物和探針，通過qpcr測量宿主dna豐度，可以允許進行診斷克羅恩氏病，并監(jiān)測所述疾病的活動性。
實施例3
1.材料與方法
1.1群體
如上述，參與者是“crohnometer1”研究的一部分。共15個糞便樣本進行了測序。群體符合與實施例1相同的標準。
1.2樣本收集和制備
1.2.1排泄物取樣和rna提取
根據(jù)和上述實施例1中詳述的相似過程，進行排泄物取樣。
然后根據(jù)制造商的說明，進行了一些修改，用
1.2.2rna質(zhì)量和歸一化
在分光光度計(dropsense96，trineannv)上分析15個提取的rna/dna樣本的吸光度和純度。在凝膠電泳(bioanalyzer，agilenttechnologies)上以rin值測量rna的質(zhì)量。根據(jù)吸光度測量，將樣本歸一化為約66.67ng/μl。
1.2.3cdna合成
使用tataagrandscriptcdna合成試劑盒#a103(tataabiocenterab)將所有樣本逆轉(zhuǎn)錄成cdna。在cdna合成之前，根據(jù)制造商的說明書，使用heat&rungdna去除試劑盒(catno80200-50，articzymes)進行dna酶處理。反應中加入了最大負載量的rna，使其能夠獲得盡可能高的cq值。將試劑混合。在t100(bio-radlaboratories，inc)上在20μl反應體積中進行逆轉(zhuǎn)錄。應用表3中的溫度程序進行cdna合成。
1.2.4qpcr
在逆轉(zhuǎn)錄后，15個樣本進行9×稀釋。使用tataa
使用經(jīng)設計用于擴增s100a8和s100a9基因的引物和探針進行qpcr，s100a8和s100a9基因編碼形成鈣網(wǎng)蛋白異二聚體的蛋白?？梢杂杀绢I域技術人員基于這些基因的公知核苷酸序列而容易地設計所述引物和探針。
表3.編碼s100a8和s100a9蛋白的基因
在cfx管理軟件(bio-rad)上使用閾值法生成原始數(shù)據(jù)。用genex軟件(multidanalyzesab)分析qpcr數(shù)據(jù)，并用genorm和normfinder進行參考基因的驗證，以評估最穩(wěn)定表達的基因。
1.2.5統(tǒng)計分析
對于每個基因，將三份的值進行平均。將cq值連同通過管家基因歸一化的值(deltacq值)，與測量鈣網(wǎng)蛋白的蛋白水平時獲得的log10轉(zhuǎn)化的elisa值(參見實施例1，150μg/ml的值)進行比較。計算spearman相關性。另外，使用250μg/g的截止值將患者分為炎癥或非炎癥(dhaliwal等人，2015)，并對每個基因的cq值進行wilcoxon秩和檢驗以比較兩個組。統(tǒng)計分析在r中進行。
2.結(jié)果
2.1通過qpcr特異性引物定量鈣網(wǎng)蛋白的基因水平
對于所有12(s100a9)至15(s100a8)的測試樣本，s100a8和s100a9基因具有cq值。stati
表4.統(tǒng)計數(shù)據(jù)
圖8顯示，基因s100a8和s100a9中排泄物mrna水平與排泄物鈣網(wǎng)蛋白水平(蛋白水平)之間的統(tǒng)計學顯著相關性。
因此，通過qpcr測量鈣網(wǎng)蛋白的基因水平，更特別是s100a8和/或s100a9的基因水平，可以允許診斷克羅恩氏病，更具體地，優(yōu)選當和宿主dna相對豐度的測量組合時，可以允許用于監(jiān)測所述疾病的活動性。
與實施例2中所述的測量宿主dna豐度的qpcr測試相組合，優(yōu)選在單個管中，可以進一步容易地進行這種測試。
參考文獻
cho,j.h.,&brant,s.r.(2011).recentinsightsintothegeneticsofinflammatoryboweldisease.gastroenterology,140(6),1704–12.doi:10.1053/j.gastro.2011.02.046
hmp,aframeworkforhumanmicrobiomeresearch.nature.2012jun13；486(7402):215-21
klaassench,jeuninkma,prinsencf,ruerstj,tanac,strobbelj,thunnissenfb.quantificationofhumandnainfecesasadiagnostictestforthepresenceofcolorectalcancer.clinchem.2003jul；49(7):1185-7.
laas等人.diagnosisandclassificationofcrohn’sdisease.autoimmunrev.2014apr-may；13(4-5):467-71
molodeckyna,等人.increasingincidenceandprevalenceoftheinflammatoryboweldiseaseswithtime,basedonsystematicreview.gastroenterology.2012jan；142(1):46-54.e42；quize30.doi:10.1053/j.gastro.2011.10.001
vincentc,mehrotras,loovg,dewark,mangesar.excretionofhostdnainfecesisassociatedwithriskofclostridiumdifficileinfection.journalofimmunologyresearch2014sept；論文id246203
shewalejg,schneidae,wilsonj,walkerja,batzermaandsinhask,人genomicdnaquantitationsystem,h-quant:developmentandvalidationforuseinforensiccasework；journalofforensicscience,2007,vol.52(2)
reevesj.r和bartlettj.m.s.methodsinmolecularmedicine；第39卷,第51章,471-483(2000)
schenam.proteinmicroarrays；jonesandbartlettlearning.(2005)
godonjj,zumsteine,dabertp,habouzitf和molettar,molecularmicrobialdiversityofananaerobicdigestorasdeterminedbysmall-subunitrdnasequenceanalysis.appl.environ.microbiol.1997,63(7):2802.
parkerrm&barnesnm,mrna:detectionbyinsituandnorthernhybridization.methodsinmolecularbiology106:247-283(1999)
heidca,stevensj,livakkj,williamspm..,realtimequantitativepcr,genomeresearch6:986-994(1996)
kultimajr,sunagawas,lij,chenw,chenh,mendedr,arumugamm,panq,liub,qinj,wangj,borkp.；mocat:ametagenomicsassemblyandgenepredictiontoolkit.plosone.2012；7(10):e47656
dhaliwala.,zeinoz.,tomkinsc.,cheungm.,nwokoloc.,smiths.,harmstonc和arasaradnamr.p.frontlinegastroenterol.；2015,6(1):14-19.epub2014。
序列表
<110>恩特姆生物科學公司
<120>宿主dna作為克羅恩氏病的生物標記物
<130>d34578
<140>pct/ep2016/051989
<141>2016-01-29
<150>ep15305142.0
<151>2015-01-30
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