專利名稱：克羅恩氏病診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及安全且高靈敏度地、特異性地診斷克羅恩氏病的方法和克羅恩氏病的診斷用試劑，以及含有該試劑的診斷用試劑盒。
背景技術(shù)：
克羅恩氏病，與潰瘍性大腸炎(UC) —起，均為基于免疫學(xué)應(yīng)答異常的分類為局部炎癥性腸疾病(IBD)的疾病。與炎癥局限于大腸的UC不同，克羅恩氏病是在從口腔到肛門的消化道的全部部位均可出現(xiàn)潰瘍的疾病。作為臨床癥狀，經(jīng)常出現(xiàn)以腹痛、腹瀉為主，進而發(fā)熱、便血、由于吸收障礙所導(dǎo)致的體重減少、全身倦怠感、貧血等癥狀。此外，有時并發(fā)壞疽性膿皮癥、結(jié)節(jié)性紅斑等皮膚癥狀，關(guān)節(jié)病變、口腔炎等腸道外并發(fā)癥。但是，克羅恩氏病的病因仍然未充分清楚，其診斷和治療存在限制。例如，克羅恩氏病的診斷，除了臨床所見之外，還可以對于X射線造影檢查、內(nèi)窺鏡檢查、內(nèi)窺鏡下采取的活體組織檢查標(biāo)本的組織檢查等綜合性地進行判斷來進行，這些檢查中，檢查前的腸道內(nèi)清洗需要時間，造影劑的給藥、內(nèi)窺鏡對腸道的插入等對于患者在肉體上、精神上造成很大的負(fù)擔(dān)，而且手藝和辨別需要經(jīng)驗和熟練的技術(shù)。特別是在小腸型或小腸為主的小腸大腸型的情況下，由于小腸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及發(fā)病部位距離內(nèi)窺鏡的插入部(肛門或口腔)遠(yuǎn)等原因，利用X射線造影檢查或內(nèi)窺鏡進行的檢查，需要更高的技術(shù)。此外，難以與表現(xiàn)出類似病理所見的UC等其它炎癥性腸疾病進行鑒別的例子多， 故要求安全、簡便且對于克羅恩氏病特異性的診斷方法。克羅恩氏病的發(fā)病和惡化，認(rèn)為受到各種遺傳性以及環(huán)境性原因的復(fù)雜影響，其中，暗示來源于包含腸內(nèi)細(xì)菌的微生物的抗原與之相關(guān)，認(rèn)為針對微生物的異常免疫應(yīng)答與克羅恩氏病中的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。例如有報告指出，抗釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗體(ASCA)、抗12抗體、抗外膜蛋白質(zhì)C(OmpC)抗體、抗鞭毛蛋白抗體等，在克羅恩氏病患者的血清中特異性地增加。另一方面有報告指出，除了微生物之外，針對CRP、 豬淀粉酶的抗體效價在克羅恩氏病患者的血清中特異性增加?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，提出了通過檢出這些抗體來非侵襲性地診斷克羅恩氏病的方法(專利文獻1和2，非專利文獻1 3)。但是，使用單一的抗體作為標(biāo)記物的這些方法中，靈敏度(真陽性率)均至多止于 40%左右。通過組合多種抗體，可以提高靈敏度(專利文獻幻，但是存在難以得到12抗原、 OmpC抗原、鞭毛蛋白抗原、CRP抗原等問題。飲食，與腸內(nèi)細(xì)菌同樣地作為通過腸道的異物，有可能對腸道免疫造成影響。對于克羅恩氏病的治療來說，要素飲食療法是有效的，因此暗示存在一些飲食抗原作為病因或惡化因子，但是仍未清楚特定的飲食抗原在克羅恩氏病中的參與?，F(xiàn)有技術(shù)文獻
專利文獻1 日本特開平11-190734號公報專利文獻2 本特表2004-5^122號公報專利文獻3 日本特開2006-308494號公報非專利文獻
非專利文獻 1 Jpn J Electroph 1999 ；43 :139-145 非專利文獻 2 Gastroenterology 2002 ；123 :689-699 非專利文獻 3 =Gastroenterology 2000 ；119 :23-31。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明要解決的課題在于，提供安全、簡便且特異性地診斷克羅恩氏病的新型方法，以及用于此的試劑和含有該試劑的診斷用試劑盒。用于解決課題的手段
解決上述課題時，本發(fā)明人首先注意到有報告指出，在克羅恩氏病中，由于腸道上皮的屏障機構(gòu)存在障礙，故膜透過性亢進，易暴露于抗原，想到飲食抗原有可能參與克羅恩氏病中的炎癥反應(yīng)。因此，對從克羅恩氏病患者、UC患者和健康人采取的血清中的、針對各種飲食成分的抗體效價進行測定，并相互比較。結(jié)果成功地鑒定了 19個品種的在來源于克羅恩氏病患者的樣品中特異性地發(fā)現(xiàn)血清抗體效價的上升的飲食成分。其中14個品種，為至今完全未被暗示與克羅恩氏病相關(guān)的飲食成分。進一步地，本發(fā)明人確認(rèn)，通過將上述19個品種中的2種以上組合來使用，可以進一步提高克羅恩氏病診斷的靈敏度和特異度(真陰性率)，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述對象的克羅恩氏病的診斷方法，其特征在于，測定由該對象采取的樣品中的、針對選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜(callage)、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃(pecan nut)、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆中的1種以上飲食成分的各抗體，其中，測定針對1種飲食成分的抗體時，該飲食成分為除了芹菜、蕎麥、玉米、 酵母和大豆之外的飲食成分。[2] [1]的方法，其特征在于，測定針對2種以上的飲食成分的各抗體。[3] [2]的方法，其中，至少一種飲食成分為除了芹菜、蕎麥、玉米、酵母和大豆之外的飲食成分。[4] [2]或[3]的方法，其特征在于，測定針對選自葡萄柚、甘藍(lán)菜、萵苣、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥和玉米中的至少1種飲食成分的抗體。[5] [2] W]中任一項的方法，其特征在于，測定至少針對酵母和玉米的各抗體。[6] [2] [5]中任一項的方法，其特征在于，測定針對3種以上的飲食成分的各抗體。[7] [6]的方法，其特征在于，測定至少針對酵母、玉米、以及蕎麥或芹菜的各抗體。[8] [1] [7]中任一項的方法，其特征在于，測定針對飲食成分中含有的多肽抗原的各抗體。[9] [8]的方法，其中，上述多肽抗原為谷蛋白(glutelin)。
[10]克羅恩氏病的診斷用試劑，其含有選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、 萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、米和甘蔗中的飲食成分的制備物。[11] [10]的試劑，其中，上述制備物為經(jīng)分離或純化的多肽抗原。[12] [11]的試劑，其中，上述多肽抗原為谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。[13]克羅恩氏病的診斷用試劑盒，其含有選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核1 、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆中的2種以上的飲食成分的制備物。[14] [13]的試劑盒，其中，上述制備物為經(jīng)分離或純化的多肽抗原。[15] [14]的試劑盒，其中，上述多肽抗原為谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。發(fā)明效果
本發(fā)明的診斷方法，通過組合對克羅恩氏病特異性的抗飲食成分抗體的抗體效價測定，在可以顯著提高克羅恩氏病診斷的靈敏度和特異度，可以限定利用了需要高技術(shù)、且對患者的負(fù)擔(dān)也大的內(nèi)窺鏡等的侵襲性方法進行診斷的適應(yīng)范圍方面，發(fā)揮顯著的效果。此外，由于使用飲食成分，故進一步具有容易獲得試劑的優(yōu)點。


圖1為表示米蛋白質(zhì)的CBB染色的結(jié)果的圖。泳道M表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物， 泳道a表示米蛋白質(zhì)，左端的數(shù)值表示蛋白質(zhì)的分子量(kDa)。圖2為表示米蛋白質(zhì)的免疫印跡的結(jié)果的圖。泳道C表示使用克羅恩氏病患者 (CD)的血清作為抗體的結(jié)果，泳道H表示使用健康人(HC)的血清作為抗體的結(jié)果，左端的數(shù)值表示蛋白質(zhì)的分子量(kDa)?！唉　北硎景l(fā)現(xiàn)了與CD的血清中的抗體的特異性反應(yīng)的條
市ο
具體實施例方式本發(fā)明提供克羅恩氏病的診斷方法，該方法包括測定由診斷對象采取的樣品中的、1種以上的克羅恩氏病特異性抗飲食成分抗體。本發(fā)明中，“克羅恩氏病特異性抗飲食成分抗體”指的是，在患有克羅恩氏病的動物中，抗體效價特異性地上升的、針對飲食成分的抗體，具體地說，指的是針對葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、 西紅柿、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆這19種飲食成分的各抗體(以下也稱為“本發(fā)明的抗飲食成分抗體”)。應(yīng)予說明，其中，為“克羅恩氏病特異性”指的是，在患有克羅恩氏病的動物中，抗體效價上升的頻率(陽性率真陽性率)至少比患有 UC的動物和健康動物中的該頻率顯著性地高。此外，本發(fā)明的抗飲食成分抗體，可以為針對各種飲食成分中含有的多肽抗原 (各種飲食成分的抗原)的各抗體。飲食成分的多肽抗原，具體地說，只要是葡萄柚、苜蓿、 鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆的飲食成分中含有的多肽抗原，并且為克羅恩氏病特異性多肽抗原則可以為任意的多肽抗原。本發(fā)明中，上述19種飲食成分中，優(yōu)選為米、蕎麥、玉米和甘蔗，作為它們中含有的多肽抗原，若為米，則可以例示谷蛋白、乙二醛酶(glyoxylaseU、烯醇酶(enolase)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase)、天冬氨酸蛋白酶(asparatic protease)、醇溶谷蛋(prolamin)、油質(zhì)蛋白(oleosin)等，若為蕎麥，則可以例示網(wǎng)格蛋白(clathrin)等，若為玉米，則可以例示2，3-雙磷酸甘油酸酯-獨立磷酸甘油酸酉旨變位BS (2, 3-bisphosphoglycerate -independent phosphoglyceratemutase)、 蛋白二硫化物異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase)、酮醇酸還原異構(gòu)酶(ketol-acid reductoisomerase) >1 α (elongation factor 1 alpha) > ^MMSI
(phenylalanine ammonia-lyase)等，若為甘蔗則可以例示三磷酸酯異構(gòu)酶(triphosphate isomerase) 1、NBS-LRR type RGA 等。本發(fā)明的診斷方法中，診斷對象可以為有可能患有克羅恩氏病(包括相當(dāng)于人的克羅恩氏病的非人炎癥性腸疾病)的任意動物，例如哺乳動物，具體地說，可以例示人、非人靈長類、狗、貓、兔子、大鼠和小鼠等。用于診斷的樣品，只要是可以從診斷對象分離、來源于有可能存在克羅恩氏病特異性抗飲食成分抗體的對象的成分或組織，則不特別限定，可以舉出例如血液(全血、血清、血漿)、唾液、其它體液、各種組織等，但是特別優(yōu)選為血清或血漿。使用用于參考的潰瘍性大腸炎患者和/或作為對照的健康人的樣品時，它們的樣品也與之相同。對于樣品中的各抗體的測定方法，作為免疫學(xué)上的測定方法，只要是用于檢出、 測定抗體的方法，則可以為任意方法，可以使用以酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、著色物質(zhì)等作為標(biāo)記物質(zhì)的慣用測定方法中的任意方法，但是優(yōu)選為酶免疫測定法、免疫色譜法等，進一步地，在可以通過著色量、吸光度而容易地將樣品中的抗體量數(shù)值化方面，特別優(yōu)選酶免疫測定法、例如ELISA法。作為同時測定針對多品種的抗體的方法，例如可以使用可測定93個品種食品的IgG的市售的ELISA試劑盒(93 Food IgGScreen/GENESIS Diagnostics公司等)，或依賴于民間檢查機構(gòu)的測定(IgG Food Antibody Assessment/ Genova Diagnostics公司等)。測定所必需的各種器具、材料、試劑類、標(biāo)記方法和測定條件，都可以利用公知的技術(shù)。對于結(jié)合至抗體的標(biāo)記量的測定，根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)的種類來選擇慣用的方法，例如以酶作為標(biāo)記物質(zhì)時，通過分光光度計以吸光度的方式來測定發(fā)色底物的分解是有利的。例如，通過ELISA法進行的本發(fā)明的抗飲食成分抗體的測定可以如下進行，首先， 使樣品與飲食成分的制備物反應(yīng)而生成抗原-抗體復(fù)合體，接著，添加酶標(biāo)記的、與抗飲食成分抗體反應(yīng)的物質(zhì)，進一步添加酶底物進行反應(yīng)，利用酶活性測定反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)記量，由此可以進行上述測定。飲食成分的制備物，可以通過利用慣用方法對飲食成分進行處理來制備。作為原料的飲食成分，可以舉出市售的新鮮品、冷凍品、冷凍干燥品或其粉末材料(Allergon公司等)，作為飲食成分的處理方法，優(yōu)選可舉出萃取。萃取例如通過將原料在水、有機溶劑、 緩沖液、或甘油中物理性地(超聲波、弗氏壓碎器、乳缽、均化器、玻璃珠、凍融等)或用表面活性劑進行處理。通過添加鹽、加溫，可以提高萃取效率。此外，作為飲食成分的制備物，除了由上述方法得到的萃取物之外，還可以使用市售的蛋白質(zhì)萃取液(BioChain公司、 Antigen Laboratories公司等)和/或診斷用變應(yīng)原提取物(島居藥品株式會社、Antigen Laboratories &司·)等。作為飲食成分的制備物，可以是飲食成分中含有的上述多肽抗原的分離或純化物。經(jīng)分離或純化的多肽抗原例如如下制備(a)由飲食成分的組織或細(xì)胞使用公知的方法或基于此的方法制備，(b)通過使用肽合成器等的公知的肽合成方法來化學(xué)性地合成， (c)培養(yǎng)含有編碼多肽抗原的DNA的轉(zhuǎn)化體，或(d)以編碼多肽抗原的核酸作為模板，使用無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)進行生物化學(xué)合成。(a)由飲食成分的組織或細(xì)胞制備多肽抗原時，可以將其組織或細(xì)胞均化后，將粗分級物(例如膜級分、可溶性級分)直接用作多肽抗原?；蛘?，也可以用酸、表面活性劑或醇等進行萃取，對該萃取液，通過組合鹽析、透析、凝膠過濾、反相色譜、離子交換色譜、親和色譜等色譜來進行純化分離。得到的蛋白質(zhì)可以直接作為多肽抗原，也可以通過使用肽酶等的限定分解來制備部分肽并將其作為多肽抗原。(b)化學(xué)性地制備多肽抗原時，作為合成肽，例如使用具有與使用上述(a)的方法、由天然材料純化得到的蛋白質(zhì)相同的結(jié)構(gòu)的合成肽，具體地說，使用含有1種或2種以上的與該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中由至少3個以上、優(yōu)選6個以上的氨基酸構(gòu)成的任意部位的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽等。(c)使用含有DNA的轉(zhuǎn)化體制備多肽抗原時，該DNA可以通過公知的克隆方法 (例如 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al. , Cold Spring HarborLab. Press, 1989)中記載的方法等)來制備。該克隆方法，可以舉出(1)使用基于編碼多肽抗原的基因序列而設(shè)計的DNA探針，由飲食成分的cDNA文庫通過雜交法將編碼該多肽抗原的 DNA分離，或(2)使用基于編碼多肽抗原的基因序列而設(shè)計的DNA引物，以來源于飲食成分的cDNA為模板，通過PCR法制備編碼該抗原的DNA，并將該DNA插入到適合于宿主的表達載體中的方法等。通過該表達載體，將宿主轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體，將該轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，由此可以得到所需的多肽抗原。(d)利用無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)時，可以舉出以通過與上述(c)相同的方法制備的插入有編碼多肽抗原的DNA的表達載體(例如該DNA處于T7、SP6啟動子等的控制下的表達載體等)作為模板，使用含有適合于該啟動子的RNA聚合酶和底物(NTPs)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液合成mRNA后，以該mRNA為模板，使用公知的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(例如大腸菌、兔子網(wǎng)狀細(xì)胞、小麥胚芽等的提取液)，進行翻譯反應(yīng)的方法等。通過調(diào)整鹽濃度等至適當(dāng)，可以在同一反應(yīng)液中一次性進行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和翻譯反應(yīng)。應(yīng)予說明，“分離或純化”指的是進行除去目的的成分以外的成分的操作?！敖?jīng)分離或純化的多肽抗原”中含有的目的的多肽的含量，為試樣中的多肽的通常60重量％以上，優(yōu)選80重量％以上，更優(yōu)選為90重量％以上，最優(yōu)選為95重量％以上。作為多肽抗原，可以使用完整的蛋白質(zhì)分子、含有其部分氨基酸序列的具有抗原性的肽(具有抗原性的部分肽)。作為部分氨基酸序列，可以舉出例如包含3個以上的連續(xù)氨基酸殘基的部分氨基酸序列，優(yōu)選為包含4個以上、更優(yōu)選5個以上、進一步優(yōu)選6個以上的連續(xù)氨基酸殘基的部分氨基酸序列。這些氨基酸殘基的一部分(例如1個 數(shù)個)可以被可以置換的基團(例如Cys、羥基等)置換。用作多肽抗原的肽，具有含有1個 數(shù)個這種部分氨基酸序列的氨基酸序列。優(yōu)選的一實施方式中，飲食成分的制備物被固定化在適當(dāng)?shù)墓滔?例如免疫測定用多孔板等)上。固定化可以通過將根據(jù)需要用一般性的涂布用緩沖液稀釋的該稀釋物添加到固相中，培養(yǎng)一定時間來進行。從固相除去液體后，向該固相中添加樣品，形成抗原-抗體復(fù)合體，將目的的抗體捕捉到固相上。
作為與抗飲食成分抗體反應(yīng)的物質(zhì)，可以舉出例如抗免疫球蛋白抗體、蛋白質(zhì)A、 蛋白質(zhì)G、榴蓮凝素(jacalin)等，優(yōu)選為抗免疫球蛋白抗體，特別優(yōu)選為抗IgG抗體或抗 IgA抗體。作為標(biāo)記酶，可以舉出過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、微過氧化物酶、 羧肽酶、磷酸化酶等，但沒有特別限定。酶底物根據(jù)標(biāo)記酶的種類適當(dāng)選擇，以過氧化物酶作為標(biāo)記酶時，例如可以使用 3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB =Vector Laboratories Inc.公司、#SK_4400)。除去反應(yīng)液，使用酶標(biāo)儀等，測定固相上的測定波長450nm的吸光度，由此可以測定與固相結(jié)合的標(biāo)記量，即抗體量。診斷對象中所調(diào)查的抗飲食成分抗體是否上升的判定，例如可以通過在與健康動物的抗體效價的比較中，是否在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性來進行。例如，可以將健康動物的測定值的平均+ SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)、平均+ 2SD、平均+ 3SD等作為陽性的基準(zhǔn)，但是不限于此。本發(fā)明的診斷方法的優(yōu)選的實施方式中，上述19種的克羅恩氏病特異性抗飲食成分抗體中2種以上(例如2、3、4、5、6、8、10或15種)的抗體作為測定對象。通過組合2 種以上的抗體，可以進一步提高克羅恩氏病的診斷靈敏度和/或診斷特異度。組合2種以上抗體時，優(yōu)選含有針對選自葡萄柚、甘藍(lán)菜、萵苣、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥和玉米中的至少一種飲食成分的抗體，更優(yōu)選含有至少針對酵母和玉米的各抗體。此外， 另外，在其它優(yōu)選方式中，本發(fā)明的診斷方法將3種或4種以上的抗體組合來使用。組合3 種以上的抗體時，更優(yōu)選含有至少針對酵母、玉米、以及蕎麥或芹菜的各抗體。作為具體的組合例子，可以舉出針對以下飲食成分的抗體的組合。(2種飲食成分的組合的例子) 玉米、甘藍(lán)菜
玉米、萵苣 玉米、蕎麥 酵母、葡萄柚 酵母、甘藍(lán)菜 酵母、芹菜 酵母、萵苣 酵母、蕎麥 酵母、玉米 酵母、燕麥 酵母、美洲山核桃 甘蔗、甘藍(lán)菜 甘蔗、玉米 甘蔗、酵母
(3種飲食成分的組合的例子) 酵母、玉米、蕎麥 酵母、玉米、芹菜 (4種飲食成分的組合的例子) 酵母、玉米、蕎麥、葡萄柚 酵母、玉米、蕎麥、甘藍(lán)菜 酵母、玉米、蕎麥、綠辣椒 酵母、玉米、蕎麥、西紅柿 酵母、玉米、蕎麥、大豆 酵母、玉米、蕎麥、芹菜 酵母、玉米、苜蓿、芹菜 酵母、玉米、甘蔗、芹菜 (5種飲食成分的組合的例子) 酵母、玉米、蕎麥、葡萄柚、苜蓿 酵母、玉米、蕎麥、葡萄柚、甘蔗 酵母、玉米、蕎麥、芹菜、苜蓿 酵母、玉米、蕎麥、芹菜、甘蔗 酵母、玉米、蕎麥、綠辣椒、苜蓿 酵母、玉米、蕎麥、綠辣椒、甘蔗 酵母、玉米、蕎麥、西紅柿、苜蓿 酵母、玉米、蕎麥、西紅柿、甘蔗 酵母、玉米、蕎麥、大豆、苜蓿 酵母、玉米、蕎麥、大豆、甘蔗
將2種以上的抗飲食成分抗體組合來進行診斷時，會產(chǎn)生僅一部分抗體為陽性而對于其它抗體則為陰性的結(jié)果，此時，優(yōu)選若對于任意一種抗體為陽性，則判定診斷對象患有克羅恩氏病的患有可能性高。如此可以在維持一定的診斷特異度的狀態(tài)下，顯著提高診斷靈敏度。此外，本發(fā)明還提供含有與本發(fā)明的抗飲食成分抗體反應(yīng)的1種以上的飲食成分制備物的、克羅恩氏病的診斷用試劑。具體地說，飲食成分制備物，通過對選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、 芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆這19種中的飲食成分進行處理來制備。該制備物的制備方法如上述本發(fā)明的方法中所記載。得到的飲食成分制備物例如可以以在塑料管等容器中溶解于水、緩沖液、甘油等中的狀態(tài)來提供，冷藏或冷凍保存直至即將使用之前。如上所述，本發(fā)明的克羅恩氏病的診斷中，優(yōu)選測定樣品中的2種以上的抗飲食成分抗體。因此，優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的克羅恩氏病診斷用試劑可以含有2種以上 (例如2、3、4、5、6、8、10或15種)的飲食成分制備物作為構(gòu)成。作為優(yōu)選的2種以上的飲食成分的組合，如上所述。應(yīng)予說明，使用多種飲食成分制備物時，可以將它們混合制成一種試劑、或分別制成試劑，但是由于不容易提供與各種抗飲食成分抗體特異性反應(yīng)的物質(zhì)，因此通常分別制成試劑是合適的。此外，本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的試劑的克羅恩氏病的診斷用試劑盒。本發(fā)明的試劑盒含有單獨的飲食成分制備物或以2種以上的組合含有飲食成分制備物，作為其它成分，根據(jù)免疫學(xué)上的測定方法的種類、所采用的檢出方法，可以任意包含必要的試劑類。優(yōu)選可以含有與抗飲食成分抗體反應(yīng)的物質(zhì)(例如抗IgG抗體、抗IgA抗體等二抗)。該物質(zhì)可以預(yù)先用酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、著色物質(zhì)等標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化，另外，也可以使標(biāo)記物質(zhì)含有在試劑盒的構(gòu)成中。此外，可以將飲食成分制備物預(yù)先固定化在固相上，另外，也可以使固相含有在試劑盒的構(gòu)成中。此外，本發(fā)明的試劑盒中可以含有對應(yīng)于標(biāo)記物質(zhì)的底物、或用于檢出標(biāo)記物質(zhì)與底物的反應(yīng)的檢出試劑。進一步地，為了方便實施測定，可以含有適當(dāng)?shù)臉悠废♂屢?、二抗稀釋液、?biāo)準(zhǔn)抗體、緩沖液、洗滌液、酶底物液、反應(yīng)終止液等。此外，還可以含有用作對照的來源于健康人的標(biāo)準(zhǔn)血清。以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但是本發(fā)明不被這些例子所限定。[實施例]
參考例1人血清或血漿的獲得
克羅恩氏病患者80例、潰瘍性大腸炎患者44例和健康人52例的血液，通過社會保險中央綜合醫(yī)院或味之素(株)，在簽署文件同意下采取，得到血清或血漿。樣品用號碼等表示，匿名化。實施例1 88品種的飲食的抗體效價(IgG)的測定
采取血液后，快速離心分離獲得血清，將所獲得的血清冷凍保存，通過〒卜,” ^ (tt) 3 Genova Diagnostics (IL, USA),IgG Food Antibody Assessment (88 ηππ
種的飲食)測定。88品種的飲食的詳細(xì)內(nèi)容如下，乳制品7品種(酪蛋白、切達干酪、農(nóng)家干酪、牛奶、山羊奶、乳白蛋白、酸奶)、蔬菜22品種(苜蓿、蘆筍、鱷梨、蘿卜、花莖甘藍(lán)、甘藍(lán)菜、胡蘿卜、芹菜、黃瓜、蒜、綠辣椒、萵苣、洋蘑菇、橄欖、洋蔥、豆、甘薯、馬鈴薯、菠菜、豆角、西紅柿、西葫蘆)、水果16品種(蘋果、杏、香蕉、藍(lán)莓、蔓越莓、葡萄、葡萄柚、檸檬、橙、 番木瓜、桃、梨、菠蘿、梅子、覆盆子、草莓)、魚類和貝類·肉類19品種(蛤、鱈魚、螃蟹、龍蝦、牡蠣、鯛魚、鮭、沙丁魚、蝦、比目魚、鱒魚、金槍魚、牛肉、雞肉、蛋白、蛋黃、羔羊肉、豬肉、 火雞)、谷類 堅果類19品種(杏仁、蕎麥、玉米、玉米麩、麩質(zhì)、扁豆、小扁豆、利馬豆、燕麥、 花生、美洲山核桃、花斑豆、米、黑麥、芝麻、大豆、葵花子、核桃、小麥)、其它5品種(酵母、甘蔗、巧克力、咖啡、蜂蜜)。IgG通過ELISA測定，以各飲食品種的健康人的“平均值+ 2SD” 作為基準(zhǔn)，將其以上的情況作為陽性。88品種的飲食的血清抗體效價陽性品種數(shù)的平均，對于克羅恩氏病患者來說為11品種，對于潰瘍性大腸炎患者來說為2品種，對于健康人來說為1品種。對于克羅恩氏病患者、潰瘍性大腸炎患者、健康人分別算出各品種的抗體的陽性率(陽性樣品數(shù)目/全部樣品數(shù)目X100)。接著，算出組合2 5品種時的陽性率和特異度(陰性樣品數(shù)目/全部樣品數(shù)目X 100)、診斷效率(陽性率X特異度/100)。結(jié)果
克羅恩氏病患者中，與健康人和潰瘍性大腸炎患者相比，陽性率顯著高的飲食品種為 19品種(葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、芹菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、蕎麥、玉米、燕麥、美洲山核桃、米、大豆、酵母、甘蔗)。19品種的克羅恩氏病患者(⑶)、潰瘍性大腸炎患者(UC)、和健康人(HC)的陽性率如表1所示。[表 1]
權(quán)利要求
1.對象的克羅恩氏病的診斷方法，其特征在于，測定由該對象采取的樣品中的、針對選自葡萄柚、苜猜、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆中的1種以上飲食成分的各抗體，其中，測定針對1種飲食成分的抗體時，該飲食成分為除了芹菜、蕎麥、玉米、酵母和大豆之外的飲食成分。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定針對2種以上的飲食成分的各抗體。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，至少一種飲食成分為除了芹菜、蕎麥、玉米、酵母和大豆之外的飲食成分。
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，測定針對選自葡萄柚、甘藍(lán)菜、萵苣、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥和玉米中的至少1種飲食成分的抗體。
5.權(quán)利要求2 4中任一項所述的方法，其特征在于，測定至少針對酵母和玉米的各抗體。
6.權(quán)利要求2 5中任一項所述的方法，其特征在于，測定針對3種以上的飲食成分的各抗體。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，測定至少針對酵母、玉米、以及蕎麥或芹菜的各抗體。
8.權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其特征在于，測定針對飲食成分中含有的多肽抗原的各抗體。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述多肽抗原為谷蛋白。
10.克羅恩氏病的診斷用試劑，其含有選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、 洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、米和甘蔗中的飲食成分的制備物。
11.權(quán)利要求10所述的試劑，其中，所述制備物為經(jīng)分離或純化的多肽抗原。
12.權(quán)利要求11所述的試劑，其中，所述多肽抗原為谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。
13.克羅恩氏病的診斷用試劑盒，其含有選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核1 、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆中的2種以上的飲食成分的制備物。
14.權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中，所述制備物為經(jīng)分離或純化的多肽抗原。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中，所述多肽抗原為谷蛋白或具有抗原性的其部分肽。
全文摘要
本發(fā)明提供用于安全、簡便且特異性地診斷克羅恩氏病的試劑以及方法。提供對象的克羅恩氏病的診斷方法，該方法包括測定由該對象采取的樣品中的、針對選自葡萄柚、苜蓿、鱷梨、甘藍(lán)菜、綠辣椒、萵苣、洋蔥、馬鈴薯、菠菜、西紅柿、燕麥、美洲山核桃、酵母、甘蔗、芹菜、蕎麥、玉米、米和大豆中的1種以上飲食成分的各抗體，提供含有上述飲食成分的制備物的克羅恩氏病的診斷用試劑或試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK102341705SQ201080010458
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者斎藤惠子, 橋本雅棋, 森口智美, 森妹子, 河口貴昭, 鈴木學(xué), 須賀泰世, 高添正和 申請人:味之素株式會社