本發(fā)明涉及用于合成生物相容性混雜納米材料的通用化學(xué)方法，其可用于開發(fā)新型的基于酶的生物傳感器。

背景技術(shù)：

石墨片(graphiteflake)的完全化學(xué)剝離(completechemicalexfoliation)可生成單層且水溶性的個體氧化石墨烯(grapheneoxide，go)片。然而go是電絕緣的，并且如果將該材料用于電子應(yīng)用或用作電極材料，則因此需要恢復(fù)該材料的導(dǎo)電性。這可以通過將go化學(xué)或熱還原成其還原形式(rgo)來實現(xiàn)。已經(jīng)嘗試了數(shù)種還原劑(包括肼(n2h4)、1-二甲基肼、3-硼氫化鈉和氫奎寧)來用于還原go，這顯示出具有不同效率的結(jié)果。

在上述還原劑中，肼可以說是最常用的試劑。然而，肼并不是環(huán)境和生物友好的試劑。此外，根據(jù)實驗條件，由肼制備的rgo懸浮液具有數(shù)小時至數(shù)天的有限穩(wěn)定性。cn102850795公開了將肼用作還原劑以用于將go還原為rgo之方法的實施例。通過肼將go還原成rgo后，將rgo與二茂鐵接枝的pei(ferrocenegraftedpei)混合，從而在pei與rgo之間形成非共價鍵。

shanliyang等(microchimacta2013，180，第127-135頁)公開了用于將go還原為rgo的替代方法，其中通過將玻璃碳電極浸入溶液中將含有g(shù)o溶液的生物傳感器還原為rgo。

因此，開發(fā)用于制備導(dǎo)電且生物相容性rgo的通用化學(xué)途徑對于促進(jìn)rgo在生物環(huán)境中的使用是特別期望的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了氧化石墨烯(go)的一步式綠色還原和聚合物衍生化，這使得可生產(chǎn)穩(wěn)定且生物相容性的還原型go(reducedgo，rgo)納米片。更具體地說，這里公開了在水性介質(zhì)中通過聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine，pei)在聚合物與rgo之間同時形成共價鍵的一步式綠色還原氧化石墨烯的簡便、環(huán)境友好且實用的方法。

因此，本文中公開了用于制備包含還原型氧化石墨烯(reducedgraphemeoxide，rgo)、聚乙烯亞胺(pei)和酶的混雜生物功能復(fù)合材料(hybridbiofunctionalcomposite)的方法。所述方法包括以下步驟：a)提供氧化石墨烯(go)水溶液；b)通過向go水溶液添加pei來還原go，從而獲得rgo-pei水溶液；以及c)將rgo-pei水溶液與酶混合，從而獲得混雜生物功能復(fù)合材料。

rgo與pei形成共價鍵，并且pei形成生物相容性基質(zhì)，其將酶靜電包封(electrostaticallyencapsulating)在基質(zhì)內(nèi)。因此，該酶與rgo支持的pei非共價結(jié)合。

通過上述方法獲得了混雜生物功能復(fù)合材料，其包含導(dǎo)電元件(即rgo)、由與rgo共價結(jié)合的pei聚合物限定的聚合物籠(polymercage)/基質(zhì)和酶形式之生物催化劑的組合。酶與混雜生物功能復(fù)合材料的其余部分(即rgo-pei)之間的非共價鍵合確保了當(dāng)酶被包含在pei基質(zhì)內(nèi)時不發(fā)生改變，因為酶不與pei基質(zhì)材料或rgo形成任何鍵。相反，這允許酶在聚合物籠內(nèi)部“自由地”移動，其程度由酶和聚合物基質(zhì)袋的尺寸限定。

酶良好地保留其結(jié)構(gòu)和催化活性，因為其位于生物相容性基質(zhì)或環(huán)境中。換言之，即使酶與rgo和pei偶聯(lián)，仍保持酶的催化特性。

聚合物pei也是環(huán)境相容且環(huán)境友好的，這使其成為在環(huán)境方面比肼更好的替代物。其能夠與go形成共價鍵，同時將go還原成rgo，且后者是優(yōu)良的導(dǎo)電材料。因此，使用pei作為還原劑，則可以避免使用環(huán)境和生物不友好的試劑，例如肼。

此外，根據(jù)實驗條件，由肼制備的rgo懸浮液具有數(shù)小時至數(shù)天的有限穩(wěn)定性。當(dāng)使用pei獲得go向rgo的還原時，避免了這種不穩(wěn)定性問題。

因此，通過上述方法獲得了用于制備可用于生物環(huán)境的導(dǎo)電且生物相容性rgo的通用化學(xué)途徑。

本文中還公開了包含還原型氧化石墨烯(rgo)、聚乙烯亞胺(pei)和酶的混雜生物功能復(fù)合材料，其中所述rgo與pei形成共價鍵，并且其中pei形成生物相容性基質(zhì)，其將酶靜電包封在基質(zhì)內(nèi)。因此，該酶與rgo支持的pei非共價“結(jié)合”。

本文中還公開了根據(jù)上述和通過本文中公開的方法制備的混雜生物功能復(fù)合材料。

本文中還公開了包含如上所述的混雜生物功能復(fù)合材料的電極復(fù)合材料結(jié)構(gòu)。

附圖說明

圖1公開了用于制備rgo-pei復(fù)合材料的方法。

圖2a示出了具有所制備的go納米片之溶液的吸收池(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。

圖2b示出了具有rgo-pei納米片之溶液的吸收池(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。

圖2c示出了具有由肼(n2h4)還原的rgo納米片溶液的吸收池(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。

圖3a-3d示出了云母上的go(圖3a)、由n2h4還原的rgo(圖3b)、rgo-pei(圖3c)和rgo-pei/gox復(fù)合材料(圖3d)的afm圖像，其中g(shù)ox是葡萄糖氧化酶。

圖4a-4b示出了云母上rgo-pei結(jié)構(gòu)的具有不同分辨率的高分辨率afm圖像。

圖5a-5d示出了rgo-pei的xps譜。

圖6是概述了通過xps對go、rgo-n2h4和rgo-pei中表面氧基團(tuán)量之元素分析的表格。

圖7a示出了go、rgo-n2h4(“標(biāo)記的rgo”)和rgo-pei的ftir光譜。

圖7b是列出在圖7a中觀察到的go和rgo-pei的峰模式(以cm^-1表示)的表格。

圖8是制備混雜生物功能復(fù)合材料的示意圖。

圖9a示出了gox在與rgo-pei綴合之前和之后的uv-vis吸收光譜。

圖9b示出了從圖9a的數(shù)據(jù)獲得的gox與rgo-pei的吸收質(zhì)量比。

圖9c是概述圖9a和9b所示結(jié)果的表格。

圖10a示出了吸收到rgo-pei之前和之后的chox的uv-vis吸收光譜。

圖10b示出了圖10a中uv-vis光譜中所示的chox與rgo-pei的吸收質(zhì)量比。

圖10c是基于圖10a和10b所示結(jié)果的chox與rgo-pei的質(zhì)量比的數(shù)據(jù)分析列表。

圖11a示出了用rgo-pei-chox復(fù)合材料涂覆的玻璃碳電極(glassycarbonelectrode，gce)表面處具有不同濃度的膽固醇的電催化氧化。

圖11b示出了基于圖11a所示數(shù)據(jù)的chox生物傳感器響應(yīng)于膽固醇的校準(zhǔn)圖。

圖12a示出了在邊緣平面石墨電極(edgeplanegraphiteelectrode，epg)/rgo-pei/gox處的葡萄糖的電催化氧化。

圖12b示出了在0.35v下向含有0.8mmfc-cooh的10mmpbs(ph7.0)中連續(xù)添加葡萄糖的epg/rgo-pei/gox的電流響應(yīng)(amperometricresponse)。

圖12c示出了相比于葡萄糖濃度的電流響應(yīng)。

圖12d示出了基于圖12a所示結(jié)果的葡萄糖生物傳感器的校準(zhǔn)圖。

圖13a-b示出了使用根據(jù)本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器測量人血液樣品中的葡萄糖水平。

圖14a-b示出了使用根據(jù)本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器測量從丹麥glostrup醫(yī)院獲得的人血液樣品中的葡萄糖濃度。

圖15示出了根據(jù)本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器的長期穩(wěn)定性。

具體實施方式

因此，本文中公開了用于制備包含還原型氧化石墨烯(rgo)、聚乙烯亞胺(pei)和酶的混雜生物功能復(fù)合材料的通用化學(xué)方法。

在一個或更多個實施方案中，酶具有低于10的等電點(diǎn)。

在一個或更多個實施方案中，酶選自葡萄糖氧化酶(gox)、膽固醇氧化酶(cholesteroloxidase，chox)、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)、醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase，adh)和膽堿氧化酶。

用于制備混雜生物功能復(fù)合材料的方法包括以下步驟：提供氧化石墨烯(go)水溶液，通過向go水溶液添加pei來還原go，從而獲得rgo-pei水溶液，并將rgo-pei水溶液與酶混合，從而獲得混雜生物功能復(fù)合材料。

rgo與pei形成共價鍵，且pei形成生物相容性基質(zhì)，其將酶靜電包封在基質(zhì)內(nèi)。更具體地說，pei通常形成位于rgo納米片的平面和邊緣上的基質(zhì)，其中pei基質(zhì)形成將酶靜電包封在基質(zhì)內(nèi)的籠(cage)。因此，該酶與rgo支持的pei非共價結(jié)合。

在一個或更多個實施方案中，pei聚合物具有至少60.000單體單元的平均聚合物長度?；蛘撸琾ei聚合物具有至少10.000單體單元或至少25.000單體單元的平均聚合物長度。

在一個或更多個實施方案中，pei聚合物具有以下分子式的單體單元：

在一個或更多個實施方案中，在添加pei后，在70至120℃、或80至110℃、或90至100℃的溫度下、或者在95℃下，將所獲得的溶液攪拌30分鐘至90分鐘、或45分鐘至75分鐘、或60分鐘。

在一個或更多個實施方案中，在步驟中將rgo-pei水溶液與酶混合在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的溫度下、或者在4℃下進(jìn)行6至24小時、或8至18小時、或10至14小時。

在一個或更多個實施方案中，將rgo-pei水溶液與酶混合所獲得的混合物在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的溫度下、或者在4℃下混合6至24小時、或8至18小時、或10至14小時后，以8000rpm離心15分鐘。

在一個或更多個實施方案中，用于制備混雜生物功能復(fù)合材料的方法還包括以下步驟：用磷酸緩沖鹽水(pbs)洗滌將rgo-pei水溶液與酶混合時所獲得的溶液，并將溶液依次離心例如三次以除去松散結(jié)合的酶。

通過上述方法產(chǎn)生的混雜生物功能復(fù)合材料可以在一個或更多個實施方案中用作用于基于石墨烯之生物傳感器的基于酶的生物傳感材料。

或者，混雜生物功能復(fù)合材料可用于：

●綴合毒性重金屬離子，例如pb²⁺、hg²⁺和cd²⁺；

●清潔環(huán)境和水技術(shù)；或

●藥物遞送，其中rgo-pei捕獲并釋放特定藥物。

使用聚乙烯亞胺(pei)作為還原劑和功能性接頭來獲得rgo。pei是具有豐富胺基團(tuán)的聚合物，由作為重復(fù)單元的乙烯亞胺部分構(gòu)成。pei已知為高度支化、帶正電且水溶性的聚合物。在過去幾年中，由于pei具有高胺密度和其支鏈上可接近的伯胺位點(diǎn)，其作為用于構(gòu)建吸附劑的多功能合成砌塊(buildingblock)受到極大關(guān)注。

rgo-pei材料表現(xiàn)出生物相容性的顯著改善，這可以提供容納不同種類酶的微環(huán)境。因此，該rgo-pei-酶混雜材料的生物相容性和優(yōu)異的電子傳遞性質(zhì)為其在生物傳感中的應(yīng)用鋪平了道路。

類似地，go在其基面(basalplane)和邊緣上含有氧官能團(tuán)。因此，go可以顯示出對胺或含胺分子的高親和力。當(dāng)pei與go納米片連接時，pei中的殘留胺基可表現(xiàn)出對陰離子材料(例如聚陰離子和帶負(fù)電荷的有機(jī)、無機(jī)和生物分子)的良好吸附能力。

基于pei還原的rgo的濕化學(xué)合成如圖1所示。制備rgo-pei復(fù)合材料的典型方法是通過將400μl0.1g/mlpei與80mlh2o混合，然后添加20ml0.1mg/mlgo來進(jìn)行。通常在95℃下攪拌混合溶液1小時。顏色從棕色變?yōu)楹谏砻魍ㄟ^pei將go還原成rgo。

氧化石墨烯(go)通常通過經(jīng)修改的hummer法制備，其中用作原料的石墨片＜20μm。氧化石墨烯(go)的制備涉及兩步式工藝，其中在第一步中制備預(yù)氧化石墨。在劇烈攪拌下，將石墨粉(5.0g)緩慢添加到保持在熱水浴(80℃)中的含有p2o5(2.5g)和k2s2o8(2.5g)的濃h2so4溶液(2.5ml)中，持續(xù)3小時。冷卻至室溫并用milli-q水稀釋后，將深綠色混合物過濾并洗滌數(shù)次直到廢液ph達(dá)到中性。隨后收集預(yù)氧化的石墨粉，并在室溫下在空氣中干燥過夜。

在第二步中，將預(yù)氧化石墨粉(1.0g)緩慢添加至在冰水浴(0℃)中的濃h2so4溶液(23ml)中。然后將kmno4(3.0g)在緩慢攪拌下添加到混合物中，保持整個過程低于20℃。除去冰水浴后，混合物在35℃下攪拌反應(yīng)2小時，添加milli-q水(46ml)。幾分鐘后，進(jìn)一步向混合物添加milli-q水(137.5ml)和2.5ml30％h2o2溶液，導(dǎo)致溶液顏色迅速變?yōu)榱咙S色。然后將混合物用1∶10hcl溶液(v/v，250ml)洗滌并過濾以除去殘留的金屬離子。將懸浮在milli-q水中的粗制go以高轉(zhuǎn)速(12000rpmmin^-1)離心。隨后收集含有高度分散且穩(wěn)定的go納米片的上清液。為了除去殘留的鹽和酸，通過定期更換水浴(每天2-3次)，使用透析管(截留分子量為12000-14000)進(jìn)一步透析上清液至少一周。

如上所述，在圖1所示的rgo-pei的合成期間，分散體的顏色在約60分鐘的時間內(nèi)從棕色逐漸變?yōu)楹谏D2a示出了具有所制備的go納米片之溶液的吸收池圖片(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。go的uv光譜在232nm(標(biāo)記為102)和302nm(標(biāo)記為104)顯示兩個吸收帶，這對于go是典型的。

圖2b示出了具有rgo-pei納米片溶液的吸收池圖片(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。rgo-pei的uv光譜在260nm處顯示出一個吸收帶(標(biāo)記為106)。

為了比較，圖2c示出了具有由肼(n2h4)還原的rgo納米片之溶液的吸收池圖片(左側(cè))和溶液的相應(yīng)uv光譜(右側(cè))。rgo-肼的uv光譜在266nm處顯示出一個吸收帶(標(biāo)記為108)，其接近在圖2b中觀察到的rgo-pei吸收帶。

通過原子力顯微術(shù)(atomicforcemicroscopy，afm)、x射線光電子能譜法(x-rayphotoelectronspectroscopy，xps)、傅里葉變換紅外(fouriertransforminfrared，ftir)光譜法、拉曼光譜法(ramanspectroscopy)和熱重分析(thermogravimetricanalysis，tga)系統(tǒng)地分析rgo-pei復(fù)合材料。

考慮到所獲得的rgo-pei納米片在水中的優(yōu)異分散性，可以使用afm研究其單片性質(zhì)。afm圖像的橫截面圖如圖3a所示，圖3b中為由n2h4還原的rgo，圖3c中為rgo-pei，并且圖3d中為rgo-pei/gox復(fù)合物，其中g(shù)ox是葡萄糖氧化酶。

圖3a-3d中的尺度：在圖3a和圖3b中為5×5μm²，圖3c中為2.5×2.5μm²，且在圖3d中為1.8×1.8μm²。圖3a和圖3b中的go和rgo的高度為約0.8nm。圖3c中rgo-pei納米片的高度為2.1至2.5nm，且圖3d中rgo-pei/gox復(fù)合物的高度約為7.6至8.3nm。

發(fā)現(xiàn)單go片的平均厚度為0.8nm，由肼還原的rgo的平均厚度為0.9nm，且rgo-pei的平均厚度為2.1nm至2.5nm。與用肼還原的rgo相比，rgo-pei的平均厚度提高可歸因于其表面上的封端試劑pei在還原和共價連接后代替了含氧官能團(tuán)。

圖4示出了在云母上的rgo-pei結(jié)構(gòu)的afm圖像的橫截面圖，在圖4a中分辨率為5×5μm²，且在圖4b中為1×1μm²。

rgo-pei的xps譜如圖5a-5d所示，其中圖5a示出了高至1200ev的xps譜，圖5b是代表c1s的約285ev峰的特寫(close-up)，圖5c是代表n1s的約400ev峰的特寫，且圖5d是代表o1s的約532ev峰的特寫。

如圖6所示，go中的表面氧基團(tuán)為約30.2％。rgo-n2h4的氧百分比降低至11.64％，這與rgo-pei的14.44％相似。因此，rgo-pei中的c/o比在還原反應(yīng)后顯著提高至與由肼制備的rgo中所觀察到的水平相似的水平。

與go和rgo-n2h4相比，rgo-pei的n峰出現(xiàn)表明pei連接到rgo上。圖5c所示的rgo-pei的n1sxps譜表明存在酰胺(399.1ev)和胺(400.2ev)。如所預(yù)期的，圖5d所示的o1s核心水平譜可以擬合為531.5ev和532.7ev的兩個峰。

圖7a示出了go、rgo-n2h4(標(biāo)記的rgo)和rgo-pei的ftir光譜，且圖7b是列出了對go和rgo-pei所觀察到的峰模式(以cm^-1表示)的表格。在go和rgo-pei兩者中，分別在3415cm^-1和1386cm^-1觀察到o-h伸縮模式(stretchingmode)和o-h彎曲模式(bendingmode)。在純go中觀察到o-h模式是相對強(qiáng)的峰，但在rgo-pei復(fù)合材料中變得明顯更弱。

在go中的1725cm^-1處觀察到羧酸和羰基中的c＝o伸縮，而在rgo-pei中，其在n-c＝o基團(tuán)的1647cm^-1處被觀察到。

作為比較，rgo-n2h4的譜顯示出或多或少的扁平線，其在1047cm^-1處的指紋區(qū)域中具有弱峰，代表在環(huán)氧基中的c-o伸縮。在rgo-pei中觀察到的相同的峰為弱峰，而在go中為強(qiáng)峰。go中的878cm^-1峰也歸因于環(huán)氧基中的c-o基團(tuán)。該峰在rgo-pei和rgo-n2h4譜中不可見。僅在go的1630cm^-1處觀察到石墨結(jié)構(gòu)域的骨架振動。在rgo-pei中，在1450cm^-1處觀察到弱c-n伸縮。

上面結(jié)合前述圖討論的結(jié)構(gòu)表征表明，pei與rgo納米片共價連接以形成生物相容性基質(zhì)。因此，pei基質(zhì)提供生物相容性的微環(huán)境，以用于通過靜電包封來容納酶。rgo-pei酶納米復(fù)合材料可以在電極表面上鑄成薄膜，由此酶保留其催化活性。因此，上述得到的rgo-pei材料提供了大量的電化學(xué)活性表面以用于吸附大量酶，其可用于高度敏感和選擇性的生物傳感器。

圖8是包含還原型氧化石墨烯(rgo)、聚乙烯亞胺(pei)和酶的混雜生物功能復(fù)合材料(這里稱為rgo-pei-酶混雜材料)的制備示意圖。在上部的第一步中，示出了從石墨801開始的氧化石墨烯片802的初始合成。該過程可以使用如先前結(jié)合圖1所述的經(jīng)修改的hummer法來進(jìn)行。

在圖8下部所示的接下來的步驟中，氧化石墨烯被聚合物pei803同時還原并官能化，以獲得rgo-pei805，也如結(jié)合圖1所述。還原/官能化之后是在rgo-pei基質(zhì)805上加載酶806以獲得rgo-pei-酶混雜材料807。

rgo-pei-酶混雜復(fù)合材料807可以通過在4℃下將800μl0.05mg/ml的rgo-pei與200μl1mg/ml酶混合過夜得到，從而形成rgo-pei-酶混雜復(fù)合材料。然后將混合物以8000rpm下離心15分鐘，并收集溶液的上清液以用于確定rgo-pei基質(zhì)上的酶負(fù)載能力。

收集沉淀物，并通常用磷酸緩沖鹽水(pbs)洗滌，并依次離心三次以從rgo-pei基質(zhì)中除去松散結(jié)合的酶。不同酶的固定效率可以通過uv吸收光譜，通過測量上清液中游離量的酶的吸收和之前添加的實際量的酶的吸收來間接確定。

如圖8所示，pei在rgo-pei材料中的go片的平面上和在邊緣處形成基質(zhì)樣的籠/基質(zhì)804。當(dāng)添加酶806時，這些pei籠804有助于酶806的容納，使得酶806被靜電包封在pei形成的基質(zhì)804內(nèi)。由此，酶806不與pei基質(zhì)804中的rgo材料802或pei聚合物803形成任何共價鍵。

圖9-12示出了容納在rgo-pei基質(zhì)中的酶的兩個代表性實例的其他實驗數(shù)據(jù)；葡萄糖氧化酶(gox)和膽固醇氧化酶(chox)酶。葡萄糖和膽固醇是所有人細(xì)胞的兩種關(guān)鍵成分，并且確定血液中的葡萄糖和膽固醇水平是控制和早期診斷許多危及生命的疾病(例如糖尿病和肥胖)的關(guān)鍵步驟。

圖9a示出了在吸附至rgo-pei基質(zhì)之前和之后的gox的uv-vis吸收光譜。線901和902顯示在不存在rgo-pei的情況下，離心之前(線901)和之后(第902行)之后的純gox的uv-vis吸收光譜。如圖所示，顯然這些線或多或少彼此完全重疊，表明僅離心不會降低溶液中的酶量，因此這是一個很好的對照實驗。線903、904和905示出了用三個獨(dú)立樣品測量的rgo-pei/gox在離心后的gox的uv-vis吸收光譜，這些互相重疊的線表明其具有良好的重復(fù)性。

圖9b示出了離心后圖9a中uv-vis光譜中所示的gox與rgo-pei/gox溶液的吸收質(zhì)量比，并與原始的gox溶液進(jìn)行比較，其中a和a0是277nm處溶液的吸收?？梢钥闯?，代表gox的前兩個樣品901、902顯示出在gox離心之前和之后的吸收之間1∶1的比例，而對于rgo-pei/gox樣品903、904和905觀察到與gox相比降低至60％的吸收。

圖9c是總結(jié)圖9a和9b所示結(jié)果的表格。實現(xiàn)了質(zhì)量比為約2的酶gox的高負(fù)荷。

圖10a示出了在線1001中的chox的uv-vis吸收光譜、在線1002中的離心后的rgo-pei/chox譜和在線1003和1004中的離心后12小時的rgo-pei/chox譜。

圖10b示出了離心后圖10a中uv-vis光譜中所示的chox和rgo-pei/chox溶液的吸收比，并與原始chox溶液進(jìn)行比較，其中a和a0是277nm處溶液的吸收?？梢钥闯?，代表chox的前兩個樣品1001、1002顯示在chox離心之前和之后的吸收之間1∶1的比例，而對于rgo-pei/chox樣品1003和1004，觀察到與chox相比降低至60％的吸收。

圖10c：基于圖10a和10b所示結(jié)果的chox與rgo-pei的質(zhì)量比的數(shù)據(jù)分析列表。與gox類似，對于chox也可實現(xiàn)質(zhì)量比約為2的高負(fù)荷。

圖11a顯示了在作為電化學(xué)介體的0.8mm二茂鐵甲酸(fc-cooh)存在下，在10mmpbs(ph7.0)中用rgo(gce/rgo/chox)修飾的玻璃碳電極(gce)表面上的膽固醇電催化氧化。在所有實驗中使用50mv/s的掃描速率，其中膽固醇的濃度從0mm變化到7mm，如圖11a所示。

圖11b示出了基于圖11a所示結(jié)果(正方形)的膽固醇生物傳感器的校準(zhǔn)圖(線)。

圖12a示出了在作為電化學(xué)介體的0.8mmfc-cooh存在下，在10mmpbs(ph7.0)中的邊緣平面石墨電極(epg)/rgo-pei/gox處的葡萄糖的電催化氧化。在所有實驗中使用10mv/s的掃描速率，其中葡萄糖的濃度從0mm變化到7mm，如圖12a所示。

圖12b示出了在0.35v下含有0.8mmfc-cooh的10mmpbs(ph7.0)中連續(xù)添加葡萄糖的epg/rgo-pei/gox的典型電流響應(yīng)。電流響應(yīng)與葡萄糖濃度的關(guān)系如圖12c所示，且基于圖12a所示結(jié)果(正方形)的葡萄糖生物傳感器的校準(zhǔn)圖如圖12d所示。

圖13a示出了使用根據(jù)本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器進(jìn)行的人血液樣品中葡萄糖水平的測量。圓點(diǎn)對應(yīng)于從不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液測量獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)，且血滴對應(yīng)于通過使用混雜生物功能復(fù)合材料傳感器測量兩種不同血液樣品的葡萄糖水平而獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

在圖13b中示出了使用本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器和市售的血糖監(jiān)測裝置的血糖檢測方法的比較。

圖14a顯示了通過使用根據(jù)本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器進(jìn)行的從丹麥glostrup醫(yī)院獲得的人血液樣品中葡萄糖濃度的測量。圓點(diǎn)對應(yīng)于從不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液測量獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)，且血滴對應(yīng)于通過使用混雜生物功能復(fù)合材料傳感器測量11種不同血液樣品(由丹麥glostrup醫(yī)院提供)的葡萄糖水平獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

在圖14b中，示出了使用本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器和市售的血糖監(jiān)測裝置的血糖檢測方法的比較。

圖15示出了本發(fā)明的混雜生物功能復(fù)合材料傳感器在35℃下長達(dá)30天的長期穩(wěn)定性。使用生物傳感器進(jìn)行電流測量30天的時間，其間傳感器儲存在35℃下。這些條件模擬了一些國家的實際夏季條件，例如印度和中國的一些南部地區(qū)。圖15中的圖表示即使在非常溫暖和潮濕的天氣條件下，其穩(wěn)定性也很高。

化學(xué)品和材料。

石墨片(＜20μm，合成的)、d-(+)-葡萄糖(≥99％)和葡萄糖氧化酶(gox，來自黑曲霉(aspergillusniger)，100,000-250,000單位/g固體)購自sigma-aldrich。二茂鐵甲酸(≥97.0％(fe))、聚(乙烯亞胺)溶液(50％(w/v)水溶液，mw＝750,000)、k2hpo4和kh2po4購自fluka。使用磷酸鹽緩沖溶液(pbs)作為支持電解質(zhì)，用k2hpo4和kh2po4將ph值調(diào)節(jié)至7.0。所有化學(xué)品都原樣使用。所有溶液用milli-q水(18.2mω)制備。

儀器

使用單光束分光光度計(hp8453，hewlettpackard)記錄uv-vis光譜。

使用5500afm系統(tǒng)(agilenttechnologies，chandler，美國)在敲擊模式(tappingmode)下進(jìn)行原子力顯微術(shù)(afm)成像。

通過escalabmkiix射線光電子能譜儀進(jìn)行x射線光電子能譜(xps)分析。

通過perkinelmerspectrum使用含有靶材料的kbr基質(zhì)，以固態(tài)記錄傅里葉變換紅外光譜(ftir)。

在n2氣氛中以5℃min^-1的加熱速率報告熱重量分析(tga，netzschsta409pc)。使用chi760c(美國)和autolab(ecochemie，荷蘭)與三電極系統(tǒng)組合的儀器進(jìn)行電化學(xué)實驗。將邊緣平面石墨(epg，d＝5mm)、亮pt絲(brightptwire)和飽和甘汞電極(saturatedcalomelelectrode，sce)分別用作工作電極、對電極和參比電極。通過chrompack(氧＜50ppb)由純化ar將電解質(zhì)溶液脫氧30分鐘。在測量過程中，所有系統(tǒng)都用ar氣氛覆蓋。

通過在1.0μm、0.3μm、0.05μm的al2o3漿料(electronmicroscopyscience，pa，usa)上打磨，然后在millipore水中超聲處理來新鮮地清洗epg。然后將rgo-pei-酶混雜材料滴鑄在電極表面上用于進(jìn)一步的電化學(xué)表征。