本發(fā)明涉及一種組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱，及其制備方法與應(yīng)用，屬于色譜填料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，大部分關(guān)于整體柱材料的應(yīng)用主要集中在反相色譜分離方面，以c18柱為代表，這些反相色譜柱對(duì)非極性化合物具有良好的分離效果，部分相關(guān)類型的整體柱已實(shí)現(xiàn)商品化，但這類整體柱材料存在的問題是：很難實(shí)現(xiàn)對(duì)極性化合物的有效分離。另外，在制備時(shí)，現(xiàn)有的制備方法普遍采用的是非水溶性的有機(jī)功能單體作為修飾劑，這就使得在制備過程中需要大量使用到有機(jī)溶劑，制備方法相對(duì)復(fù)雜，不經(jīng)濟(jì)且不環(huán)保。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為了解決采用現(xiàn)有技術(shù)制備方法的復(fù)雜、不經(jīng)濟(jì)、不環(huán)保等問題，同時(shí)解決現(xiàn)有整體柱材料對(duì)極性化合物不能實(shí)現(xiàn)良好分離的問題，本發(fā)明提供了一種組氨酸修飾的有機(jī)硅膠-雜化整體柱，并提供了其制備方法，并將其應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)對(duì)一些常見的極性化合物、親水性化合物的分離分析。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備方法，包括以下步驟：

（a）選用四甲氧基硅烷和氯丙基三甲氧基硅烷為前驅(qū)體，通過溶膠-凝膠法制備氯丙基-硅膠雜化硅膠整體柱床；

（b）用過量的組氨酸水溶液沖洗氯丙基-硅膠雜化硅膠整體柱床，然后，將氯丙基-硅膠雜化硅膠整體柱床置于恒溫箱中反應(yīng)，即得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

所述步驟（a）中，氯丙基-硅膠雜化硅膠整體柱床的制備方法為：先將聚乙二醇（peg，m=10000）溶于乙酸水溶液中，然后向其中分別緩慢加入四甲氧基硅烷（tmos）和氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），得混合溶液；將混合溶液置于冰水浴條件下反應(yīng)，直至形成均一透明的溶膠，然后將其在冰水浴條件下超聲，再將其引入處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為30～35cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中反應(yīng)，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱床。

進(jìn)一步地，所述聚乙二醇、四甲氧基硅烷和氯丙基三甲氧基硅烷三者的用量配比關(guān)系為：240mg：0.9ml：0.3ml。

優(yōu)選的，所述乙酸水溶液的濃度為0.01mol/l，每240mg聚乙二醇所用的乙酸水溶液的用量為2.5ml。

優(yōu)選的，混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)時(shí)間為3～5h。

優(yōu)選的，在冰水浴條件下超聲時(shí)間為3～5min。

進(jìn)一步地，所述處理好的毛細(xì)管是通過以下方法處理得到的：取長(zhǎng)度為40～50cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、蒸餾水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗至沖出的液體ph呈中性（ph7.0）（約20min），最后用甲醇沖洗20min，120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

優(yōu)選的，所述放入恒溫箱中反應(yīng)的條件為：反應(yīng)溫度為50℃～70℃，反應(yīng)時(shí)間為12～14h。

所述步驟（b）中，所述組氨酸水溶液的濃度≥10mg/ml。

所述過量是指毛細(xì)管體積的2倍以上。

所述將氯丙基-硅膠雜化硅膠整體柱床置于恒溫箱中反應(yīng)的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度60℃～80℃，反應(yīng)時(shí)間為23～25小時(shí)。

利用上述方法制備得到的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

上述組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱，在極性、親水性化合物的分離分析中的應(yīng)用，將具體的，可在富水色譜條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)一些常見的極性、親水性化合物的分離分析。

進(jìn)一步地，所述富水色譜條件為流動(dòng)相中h2o含量（體積百分?jǐn)?shù)）≥90%。

進(jìn)一步地，所述極性化合物選自酰胺類化合物、核苷和核苷堿基、氨基酸、苯甲酸衍生物等。

本發(fā)明的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱，選用水溶性的有機(jī)功能單體對(duì)整體柱床進(jìn)行修飾，可使得制備方法相對(duì)簡(jiǎn)單，減少了需使用有機(jī)溶劑沖洗柱子的步驟（在整個(gè)修飾過程中都未使用到有機(jī)溶劑），制備方法綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。本發(fā)明的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱，能夠在富水色譜條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)一些常見極性、親水性化合物的分離分析，能很好地解決常規(guī)整體柱在對(duì)這些極性化合物的分離分析方面存在的固有缺陷。由于在富水色譜模式下使用的有機(jī)溶劑很少，所以同樣也使得本發(fā)明的整體柱材料能在相對(duì)綠色、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)極性化合物的分離分析。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的掃描電鏡圖，其中，a：放大倍數(shù)為1200×；b：放大倍數(shù)為3000×；c：放大倍數(shù)為5000×；d：放大倍數(shù)為15000×。

圖2：整體柱的電滲流考察結(jié)果示意圖，ph在3.0～5.0之間時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)陽(yáng)極的eof，表明整體柱表面的凈電荷為正。此時(shí)，eof的大小會(huì)隨著ph的增大而逐漸減小，當(dāng)ph在5.7左右時(shí)，eof的大小接近于零。隨著ph的進(jìn)一步增大，整體柱表面的凈電荷由正變?yōu)樨?fù)，從而使eof發(fā)生反轉(zhuǎn)，產(chǎn)生一個(gè)陰極的eof。此時(shí)，eof的大小會(huì)隨著ph的增大而逐漸增大。上述結(jié)果表明，通過改變流動(dòng)相的ph可輕易實(shí)現(xiàn)對(duì)eof的大小和方向的調(diào)控。分離條件：10mmnah2po4bufferatdifferentphvalues;appliedvoltage,±20kv。eof標(biāo)記物：硫脲。

圖3：不同ph條件下有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)5種酰胺類化合物的色譜分離圖，其中，1.甲酰胺；2.丙烯酰胺；3.n,n-二甲基甲酰胺；4.n,n-二甲基乙酰胺；5.己內(nèi)酰胺。

分離條件：10mmnah2po4緩沖溶液；a：含4%acn,ph3.0,電壓:-15kv。b：含4%acn,ph3.0,電壓:-20kv。c：含2%acn,ph7.0,電壓:+15kv。d：含2%acn,ph8.0,電壓:+20kv。

圖4：不同乙腈含量條件下有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)5種酰胺類化合物的色譜分離圖，其中，1.甲酰胺；2.丙烯酰胺；3.n,n-二甲基甲酰胺；4.n,n-二甲基乙酰胺；5.己內(nèi)酰胺。

分離條件：10mmnah2po4緩沖溶液,含不同acn含量,ph3.0,電壓:-20kv。

圖5：不同鹽濃度條件下有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)5種酰胺類化合物的色譜分離圖，其中，1.甲酰胺；2.丙烯酰胺；3.n,n-二甲基甲酰胺；4.n,n-二甲基乙酰胺；5.己內(nèi)酰胺。

分離條件：不同濃度nah2po4緩沖溶液,ph3.0,電壓:-20kv。

圖6：有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)3種苯甲酸衍生物的色譜分離圖，其中，a：對(duì)3種苯甲酸衍生物的色譜分離圖，1.硫脲；2.對(duì)羥基苯甲酸；3.對(duì)氨基苯甲酸；4.苯甲酸。b：流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)苯甲酸衍生物保留的影響。c：流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)苯甲酸衍生物保留的影響。

分離條件：a：30mmnah2po4緩沖溶液,含6%acn,ph3.0。b：10mmnah2po4緩沖溶液,不同acn含量,ph3.0。c：不同緩沖鹽濃度,含6%acn,ph3.0,電壓:-15kv。

圖7：有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)4種核苷和核苷堿基的色譜分離圖，其中，a：對(duì)4種核苷和核苷堿基的色譜分離圖，1.硫脲；2.對(duì)羥基苯甲酸；3.對(duì)氨基苯甲酸；4.苯甲酸。b：流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)核苷和核苷堿基保留的影響。c：流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)核苷和核苷堿基保留的影響。

分離條件:a：20mmnah2po4緩沖溶液,ph4.0。b：20mmnah2po4緩沖溶液，ph4.0，不同acn含量。c：不同緩沖溶液濃度,ph4.0.電壓:-15kv。

圖8：有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)3種氨基酸的色譜分離圖，其中，a：對(duì)3種氨基酸的色譜分離圖，1.酪氨酸；2.苯丙氨酸；3.色氨酸；a.氨基酸在咪唑乙酸修飾的有機(jī)硅膠雜化整體柱上的色譜分分離圖；b.氨基酸在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上的色譜分離圖。b：流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)氨基酸保留的影響。c：流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)氨基酸保留的影響。

分離條件:aa：10mmnah2po4緩沖溶液，含4%acn,ph3.0；ab：5mmnah2po4緩沖溶液,ph3.0。b：10mmnah2po4緩沖溶液,不同acn含量,ph3.0。c：不同緩沖溶液濃度,ph3.0.電壓,-20kv。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例1組氨酸修飾的有機(jī)硅膠-雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為45cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為30cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在55℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的2倍）的組氨酸水溶液（濃度為10mg/ml）沖入整體柱床中，置于75℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞90%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基以及氨基酸、苯甲酸衍生物等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例2組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為40cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈桑茫?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為35cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在60℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的3倍）的組氨酸水溶液（濃度為10mg/ml）沖入整體柱床中，置于70℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞92%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例3組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為50cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為35cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在55℃條件下反應(yīng)14h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的3倍）的組氨酸水溶液（濃度為8mg/ml）沖入整體柱床中，置于70℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞90%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例4組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為50cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈桑茫?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為32cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在60℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的2倍）的組氨酸水溶液（濃度為5mg/ml）沖入整體柱床中，置于75℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞94%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、苯甲酸衍生物、核苷和核苷堿基以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例5組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為43cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)5h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲5min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為36cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在50℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的4倍）的組氨酸水溶液（濃度為6mg/ml）沖入整體柱床中，置于80℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞90%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例6組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為47cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為33cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在55℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的3倍）的組氨酸水溶液（濃度為10mg/ml）沖入整體柱床中，置于75℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞90%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例7組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為42cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為30cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在70℃條件下反應(yīng)12h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的5倍）的組氨酸水溶液（濃度為10mg/ml）沖入整體柱床中，置于65℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞96%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例8組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為46cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)5h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為35cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在50℃條件下反應(yīng)14h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的3倍）的組氨酸水溶液（濃度為2mg/ml）沖入整體柱床中，置于80℃烘箱中反應(yīng)24h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞90%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例9組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為50cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)3h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲3min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為30cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在55℃條件下反應(yīng)14h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的3倍）的組氨酸水溶液（濃度為10mg/ml）沖入整體柱床中，置于80℃烘箱中反應(yīng)22h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞92%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

實(shí)施例10組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備及應(yīng)用

步驟如下：

①毛細(xì)管的預(yù)處理：取長(zhǎng)度為41cm的熔融石英毛細(xì)管，依次用甲醇、水分別沖洗20min，再依次用1mol/l的naoh溶液、水、1mol/l的鹽酸分別沖洗2.0h、0.5h、1.5h，然后再用水沖洗毛細(xì)管20min，直至沖出的液體的ph呈中性，最后用甲醇沖洗20min，置于120℃條件下用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

②將240mg聚乙二醇（peg，m=10000）溶于裝有2.5ml0.01m乙酸水溶液的玻璃瓶中，然后向其中分別緩慢加入0.9ml四甲氧基硅烷（tmos）和0.3ml氯丙基三甲氧基硅烷（cptms），將混合溶液在冰水浴條件下反應(yīng)4h，直至形成均一透明的溶膠，然后將溶膠在冰水浴條件下超聲5min，再將其引入上述已處理好的毛細(xì)管中至長(zhǎng)度為35cm；將毛細(xì)管兩端用硅脂密封，然后放入恒溫箱中在60℃條件下反應(yīng)14h，完成凝膠過程，制得氯丙基-硅膠雜化整體柱；

③將步驟②所制備的氯丙基-硅膠雜化整體柱用水沖洗后，再將過量（毛細(xì)管體積的2倍）的組氨酸水溶液（濃度為8mg/ml）沖入整體柱床中，置于75℃烘箱中反應(yīng)26h，最終制得組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

④將步驟③所制備的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱應(yīng)用于富水色譜條件下（水含量＞96%），實(shí)現(xiàn)對(duì)酰胺、核苷和核苷堿基、苯甲酸衍生物以及氨基酸等極性和親水性化合物的分離分析。

下述以實(shí)施例1為例，對(duì)制備得到的組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的制備進(jìn)行參數(shù)表征，表征的方法和結(jié)果如下：

掃描電鏡表征：采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（型號(hào)：s-4800，購(gòu)于日本電子公司）對(duì)整體柱材料進(jìn)行掃描電鏡表征。所得結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，整體柱床具有較為均一的多孔結(jié)構(gòu)，且整體柱基質(zhì)也很好地連接到了毛細(xì)管內(nèi)壁上。

電滲流表征（化學(xué)表征）：電滲流是由固定相表面的帶電基團(tuán)所產(chǎn)生的。電滲流的大小取決于所有帶電基團(tuán)的凈電荷密度的大小，相應(yīng)地，電滲流的方向則取決于凈電荷的正負(fù)。對(duì)于硅膠整體柱而言，電滲流主要由其表面的殘余硅羥基所產(chǎn)生。由于硅羥基的解離能力較弱，所以這類整體柱往往只能在ph＞5.0的流動(dòng)相中才能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的電滲流。解決這個(gè)問題的方法就是在硅膠整體柱的表面鍵合更多的帶電功能基團(tuán)。對(duì)于組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱，ph在3.0～5.0之間時(shí)，也能觀察到一個(gè)陽(yáng)極的電滲流，這就表明組氨酸被成功鍵合到了氯丙基-硅膠雜化整體柱上。在較低的ph條件下，整體柱固定相表面的羧基和殘余的硅羥基的解離得到抑制，所以其凈電荷的大小和正負(fù)是由帶正電的咪唑鹽和氨基決定的，因此在酸性條件下能產(chǎn)生一個(gè)陽(yáng)極的電滲流（如圖2所示）。

機(jī)械性能和通透性的考察：將一根8cm長(zhǎng)的整體柱連接到hplc液相泵上，以（acn/h2o=50/50,v/v）為流動(dòng)相，通過測(cè)試背壓來考察組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的機(jī)械穩(wěn)定性。當(dāng)流速?gòu)?.001ml/min增大到0.011ml/min時(shí)，背壓線性地從0.6mpa增大到1.6mpa，這就表明整體柱具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性。此外，整體柱的通透性通過達(dá)西定律來計(jì)算得知。組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱的通透性為2.45×10^?12m²，這表明整體柱具有較為滿意的通透性。

重現(xiàn)性的考察：通過測(cè)量分析物的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsds）來評(píng)價(jià)整體柱的重現(xiàn)性。日內(nèi)（n=5）和日間（n=3）重現(xiàn)性在同一根色譜柱上考察，所獲得的結(jié)果（日內(nèi)（n=5）：2.688，2.672，2.63，2.637，2.616；日間（n=3）：2.772，2.735，2.78；柱與柱（n=3）：2.73，2.65，2.81）較為滿意，rsds分別小于1.5%和2.8%。柱與柱之間（n=3）的重現(xiàn)性也在可接受范圍之內(nèi)，rsds小于3.6%。

穩(wěn)定性考察：整體柱在連續(xù)使用超過四個(gè)星期以后，保留性能和柱效都沒有明顯的降低。

接下來以實(shí)施例1為例，對(duì)組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱進(jìn)行色譜性能考察，考察的方法和結(jié)果如下：

將整體柱聯(lián)接到agilentg1600系列毛細(xì)管電泳儀中，設(shè)定柱溫25℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)214nm，選擇合適的流動(dòng)相和電壓對(duì)整體柱的分離性能進(jìn)行考察。

考察上述整體柱在不同色譜條件下對(duì)酰胺類化合物的分離性能。

圖3所示為在不同ph條件下，5種酰胺類化合物（甲酰胺，丙烯酰胺，n,n-二甲基甲酰胺，n,n-二甲基乙酰胺，己內(nèi)酰胺）在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上的色譜分離圖。從圖中可以看出，5種酰胺類化合物在酸性、中性和堿性的色譜條件下都能獲得較為滿意的分離結(jié)果。同時(shí)，與在咪唑乙酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱（除了采用過量的濃度為100mg/ml的咪唑-1-乙酸水溶液外，其它都同實(shí)施例1）上獲得的分離效果相比，在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上能夠獲得更加快速的分離和更高的柱效。而這些酰胺類化合物在常規(guī)的反相整體柱上往往很難獲得較好的分離效果。

圖4和圖5所示分別為在不同乙腈含量和不同鹽濃度條件下，5種酰胺類化合物在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上的色譜分離圖。

考察上述整體柱對(duì)苯甲酸衍生物的分離性能。對(duì)于傳統(tǒng)的硅膠整體柱而言，由于在酸性條件下所能產(chǎn)生的電滲流很弱，從而導(dǎo)致分析物的保留時(shí)間很長(zhǎng)，因此它們很難實(shí)現(xiàn)對(duì)酸性化合物的分離。而在ph小于5.0時(shí)，組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱能產(chǎn)生一個(gè)反轉(zhuǎn)的陽(yáng)極的電滲流，因而能實(shí)現(xiàn)對(duì)這些酸性化合物較好的分離，此外，它也能提供疏水和離子交換作用等多種相互作用。如圖6a所示，3種常見的苯甲酸衍生物（對(duì)羥基苯甲酸，對(duì)氨基苯甲酸，苯甲酸）在富水色譜模式下獲得了較為滿意的分離效果。通過研究流動(dòng)相中乙腈含量和鹽濃度對(duì)苯甲酸衍生物保留的影響（如圖6b和6c所示）得知，苯甲酸衍生物的分離過程中存在混合模式的疏水和離子交換作用機(jī)理。且較高的離子強(qiáng)度更加有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)苯甲酸衍生物較好的分離。

考察上述整體柱對(duì)核苷和核苷堿基的分離性能。如圖7a所示，4種核苷和核苷堿基（尿苷，肌苷，胸苷，次黃嘌呤）在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上獲得了基線分離。與傳統(tǒng)的表面帶負(fù)電的整體柱相比，由于組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱表面帶正電，從而可以有效地避免一些不理想的吸附作用，因此能獲得更好的分離效果。通過研究流動(dòng)相中乙腈含量和鹽濃度對(duì)核苷和核苷堿基保留的影響（如圖7b和7c所示）得知，核苷和核苷堿基的保留因子會(huì)隨著acn含量的增大而明顯降低，這就表明在分離過程中存在有疏水相互作用。降低流動(dòng)相中acn含量將有助于對(duì)核苷和核苷堿基的分離，在最優(yōu)條件下，當(dāng)流動(dòng)相中不含acn時(shí)，核苷和核苷堿基可獲得較好的分離；核苷和核苷堿基的保留因子會(huì)隨著鹽濃度的增大呈現(xiàn)出一種輕微減小的趨勢(shì)，這就表明在分離過程中存在有弱的離子交換作用。

考察上述整體柱對(duì)芳香氨基酸的分離性能。在酸性條件下，組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱固定相表面帶正電，因此它能對(duì)帶正電的分析物提供靜電排斥作用。如圖8a中的b所示，在富水色譜模式下，3種常見的芳香氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸）在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上獲得了較為滿意的分離效果。與在咪唑乙酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上獲得的分離效果相比（如圖8a中的a所示），在組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱上能夠獲得更加快速的分離，且流動(dòng)相中無需添加乙腈。通過研究流動(dòng)相中乙腈含量和鹽濃度對(duì)氨基酸保留的影響（如圖8b和圖8c所示）得知，氨基酸的保留因子會(huì)隨著acn含量的增大而減小，這就表明分析物和整體柱固定相之間的疏水相互作用會(huì)隨著acn含量的增大而減弱；氨基酸的保留因子會(huì)隨著鹽濃度的增大而逐漸增大。隨著鹽濃度的增大，分析物和整體柱固定相之間的靜電排斥作用將較弱，從而導(dǎo)致氨基酸保留的增強(qiáng)。

從圖3～圖8中可以看出，組氨酸修飾的有機(jī)-硅膠雜化整體柱對(duì)不同的極性和親水性化合物都具有良好的分離性能，在實(shí)現(xiàn)某些特定的實(shí)際分析方面顯示出較大的應(yīng)用前景。

本發(fā)明實(shí)施例1～10以及整體柱參數(shù)表征、色譜性能考察所用的物品如表1所示。

表1

上述雖然結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。