本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組樣品處理方法。

背景技術(shù)：

作為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。異常的磷酸化修飾與許多疾病過程息息相關(guān)，例如惡性腫瘤等。目前基于鳥槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略是磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究當(dāng)中的主要方法。在這種方法中，蛋白質(zhì)樣品首先被酶解為多肽，通過磷酸肽富集之后，進行l(wèi)c-ms/ms分析。由于磷酸化修飾的高度動態(tài)范圍、磷酸化蛋白的低豐度以及磷酸化肽段較差的離子化效果，因此，影響整個磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析的準(zhǔn)確度以及靈敏度的關(guān)鍵步驟就是磷酸肽的特異性富集過程。

目前，固定化金屬離子親和色譜(imac)和金屬氧化物親和色譜(moc)，是兩種主要的磷酸肽富集手段，其中要屬二氧化鈦(tio2)和ti(iv)-imac微球材料應(yīng)用最為廣泛。近些年來，填充離心小柱在微量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析中得到了廣泛的應(yīng)用，這是由于它具有操作自動化、樣品損失少和無樣品污染等優(yōu)點。但是，該方法需要在離心小柱的尖端制備額外的塞子來對小柱進行封閉，以防止填充的材料溢出灑落。目前，脫脂棉和c8材料是兩種主要用于塞子制備的材料，但是脫脂棉在樣品處理過程中易吸收溶液，導(dǎo)致較高的離心負(fù)壓，而c8材料易產(chǎn)生普通肽段的非特異性吸附(文獻1.zhu,j.etal.centrifugationassistedmicroreactorenablesfacileintegrationoftrypsindigestion,hydrophilicinteractionchromatographyenrichment,andon-columndeglycosylationforrapidandsensitiven-glycoproteomeanalysis.anal.chem.84,5146-5153(2012).文獻2.zhou,h.；ye,m.etal.robustphosphoproteomeenrichmentusingmonodispersemicrosphere–basedimmobilizedtitanium(iv)ionaffinitychromatography.nat.protoc.8,461-480(2013).)。

因此，基于整體材料的離心小柱因其具有較寬的ph耐受范圍以及優(yōu)良的通透性，在微量樣品分析方面引起了人們的關(guān)注。krenkova等人制備了基于甲基丙烯酸酯的有機整體小柱，繼而使用氧化鐵納米粒子或羥磷灰石納米粒子進一步修飾整體柱材料的表面(文獻3.krenkova,j.etal.nanoparticle-modifiedmonolithicpipettetipsforphosphopeptideenrichment.anal.bioanal.chem.405,2175-2183(2013).)，成功地從α-酪蛋白和β-酪蛋 白的胰酶酶解液中富集出相應(yīng)的磷酸肽，但是，復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的富集實驗卻沒有進行，這極可能是因為該整體柱材料缺乏足夠的富集特異性。deng等人利用多巴胺可自聚生成聚多巴胺的性質(zhì)，在聚多巴胺的鄰苯二酚基團上固載ti(iv)離子，從而制備得到了imacziptip整體小柱(文獻4.yan,y.h.etal.facilesynthesisofti⁴⁺-immobilizedfe3o4@polydopaminecore-shellmicrospheresforhighlyselectiveenrichmentofphosphopeptides.chem.commun.49,5055-5057(2013).文獻5.yan,y.h.；zheng,z.f.etal.hydrophilicpolydopamine-coatedgrapheneformetalionimmobilizationasanovelimmobilizedmetalionaffinitychromatographyplatformforphosphoproteomeanalysis.anal.chem.85,8483-8487(2013).文獻6.shi,c.y.；deng,c.h.etal.immobilizedmetalionaffinitychromatographyziptippipettetipwithpolydopaminemodificationandti⁴⁺immobilizationforselectiveenrichmentandisolationofphosphopeptides.talanta143,464-468(2015).)，成功地從人血清樣品中富集出四條內(nèi)源性磷酸肽。但是，文獻中報道聚多巴胺缺乏足夠的化學(xué)穩(wěn)定性，與此同時，商品化的ziptip小柱價格昂貴，增加了該小柱的使用成本。因此，迄今為止，基于整體柱材料的離心富集小柱還沒有在復(fù)雜生物樣品的磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析中得到應(yīng)用。

在發(fā)明實現(xiàn)了一種ti(iv)-imac有機整體小柱的制備，并將其用于微量樣品的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得了高效的磷酸肽富集效果。該有機整體小柱制備簡單，僅需數(shù)分鐘的自由基聚合反應(yīng)便可完成；且無需塞子的制備，在很大程度上減少富集材料的準(zhǔn)備時間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、高效的磷酸肽富集技術(shù)ti(iv)-imac有機整體小柱，使其適用于微量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

本發(fā)明提出的ti(iv)-imac有機整體小柱，具有豐富的富集活性位點以及親水性的材料表面，可以實現(xiàn)高效的磷酸肽的富集能力；且制備簡單、耗時短，可實現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的快速分析。

具體步驟如下：

(1)配置甲醇與1,4-丁二醇的混合溶液，其體積比為1:2-2:1；

(2)使用上述步驟(1)得到的甲醇/1,4-丁二醇混合溶液配置二苯甲酮溶液，其質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.05-0.20g/ml；

(3)取上述步驟(2)中得到的二苯甲酮溶液5μl-20μl，加入到20μlgeloadertip槍頭(德國eppendorf公司)內(nèi)，置于紫外發(fā)生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中，于365nm波長紫外光下照射反應(yīng)5-20分鐘；離心去除geloadertip槍頭內(nèi)的二苯甲酮溶液；

(4)重復(fù)上述步驟(3)的過程1-4次；

(5)取2μl-4μl聚合液，加入到步驟(4)中準(zhǔn)備好的geloadertip槍頭內(nèi)，置于紫外發(fā)生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中， 于365nm波長紫外光下照射反應(yīng)5-20分鐘，得到磷酸基離心小柱；

聚合液溶劑的體積組成為：12％-15％egmp(乙烯基乙二醇甲基丙烯磷酸酯)、40.0-49.0％dmso(二甲基亞砜)、7.0-10.0％dmf(二甲基甲酰胺)、32.0-35.0％十二烷醇；溶質(zhì)為0.05-0.20g/mlbis(亞甲基雙丙烯酰胺)；

(6)配置40-60mg/ml硫酸鈦水溶液，加入到上述步驟(5)中制備好的磷酸基離心小柱內(nèi)，4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心反應(yīng)10-20分鐘，棄掉離心分離出的液體，重復(fù)上述操作2-4次；

(7)配置洗滌水溶液1，其中，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20-40％、三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1-0.3％、余量為水，在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌步驟(6)得到的小柱，棄掉離心分離出的液體；重復(fù)上述操作過程4-6次；

(8)配置洗滌水溶液2，其中，氯化鈉的摩爾濃度為150-300mm、余量為水，在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌步驟(7)得到的小柱，棄掉離心分離出的液體；重復(fù)上述操作過程4-6次；

(9)用去離子水洗滌上述步驟(8)中的離心小柱，在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌，棄掉離心分離出的液體；重復(fù)上述操作過程4-6次，獲得所需產(chǎn)物ti(iv)-imac有機整體小柱。

將上述步驟(9)中準(zhǔn)備的ti(iv)-imac有機整體小柱，用于復(fù)雜肽段樣品富集分析的具體步驟如下：

(1)配置上樣緩沖水溶液，其中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為70-90％、三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5-7％、余量為水；

(2)使用上述步驟(1)中的上樣緩沖水溶液，酸化平衡ti(iv)-imac有機整體小柱，離心棄掉其中的液體；重復(fù)上述操作過程2-4次；

(3)使用上述步驟(1)中的上樣緩沖水溶液與復(fù)雜肽段樣品混合，其體積比為1:2-2:1，并轉(zhuǎn)移至ti(iv)-imac有機整體小柱內(nèi)，在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心富集，離心分離出的液體再次轉(zhuǎn)移至ti(iv)-imac有機整體小柱內(nèi)，重復(fù)上述操作過程1-3次；

(4)配置洗滌水溶液1，其中，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為40-60％、三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5-7％、氯化鈉的摩爾濃度為150-300mm、余量為水；在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌步驟(3)得到的小柱，棄掉洗滌液；重復(fù)上述離心洗滌操作過程1-3次；

(5)配置洗滌水溶液2，其中，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20-40％、三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1-0.3％、余量為水；在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌步驟(4)得到的小柱，棄掉洗滌液；重復(fù)上述離心洗滌操作過程1-3次；

(6)配置洗脫水溶液，其中氨水的體積分?jǐn)?shù)為5-20％、余量為水；在4000-8000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌步驟(5)得到的小柱，收集洗脫液；重復(fù)上述離心洗脫操作過程1-3次，合并洗脫液得產(chǎn)物。

將ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)快速分析，可獲取相應(yīng)的磷酸肽和磷酸化位點的鑒定結(jié)果，該結(jié)果可以用于翻譯后修飾蛋白 質(zhì)組學(xué)分析。

本發(fā)明的優(yōu)點：

該ti(iv)-imac有機整體小柱具有明顯的優(yōu)點：制備簡單、耗時短，磷酸肽富集效率高，可實現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量分析。相比較填充小柱，它可以通過光誘導(dǎo)的自由基聚合反應(yīng)快速制備完成，且無需進行塞子的制備。通過β-酪蛋白和bsa酶解液的磷酸化分析，證實該離心小柱具有優(yōu)異的富集效率和較高的特異性，而這主要歸功于其豐富的富集活性位點和其親水性的材料表面。將其用于5μghela細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定到1185個高度可信的磷酸化位點，且富集特異性高達92.5％。以上結(jié)果證實了ti(iv)-imac有機整體小柱為微量磷酸蛋白組學(xué)分析提供了一個強有力的工具。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實施方式對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明：

圖1為用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析的ti(iv)有機整體小柱的制備流程圖。每支小柱內(nèi)加入2μl-4μl聚合液。首先通過自由基聚合反應(yīng)制得磷酸基有機整體小柱，將其進一步與四價的鈦離子螯合，最終制得ti(iv)有機整體小柱。

圖2為ti(iv)有機整體小柱的掃描電子顯微鏡圖。(a)圖清楚的顯示了有機整體柱材料與聚丙烯管壁之間微觀形貌。(b)圖清楚的顯示了微孔結(jié)構(gòu)的形貌。

圖3為β-酪蛋白酶解液的malditof-ms分析譜圖。(a)是對100fmol酶解液直接進行分析；(b)是對100fmol酶解液富集后進行分析；(c)是對10fmol酶解液富集分析；(d)是對5fmol酶解液富集分析。星號(*)表示磷酸化肽段，井號(#)表示去磷酸化肽段。

圖4為β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液混合物的malditofms分析譜圖。β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液的摩爾比分別為(a)1:500；(b)1:1000。星號(*)表示磷酸化肽段，井號(#)表示去磷酸化肽段。

圖5為hela細(xì)胞樣品的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。(a)不同蛋白質(zhì)上樣量下鑒定到的非冗余磷酸肽數(shù)目。(b)柱狀圖為每組樣品中鑒定到的單磷酸化肽和多磷酸化肽的比例，點線圖為其富集特異性。每一組樣品都進行了三次質(zhì)譜重復(fù)實驗。誤差線指的是標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖6為5μghela細(xì)胞蛋白質(zhì)中鑒定到的磷酸化位點的數(shù)目。每個蛋白質(zhì)上樣量平行進行了三次技術(shù)重復(fù)實驗。

具體實施方式

實施例1

ti(iv)-imac有機整體小柱的制備過程

如圖1所示，使用體積比為1：1的甲醇/1,4-丁二醇溶液配制0.10g/ml二苯甲酮溶液。取10μl二苯甲酮溶液加入到20μlgeloadertip(德國eppendorf公司)內(nèi)，置于紫外發(fā)生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中，于365nm波長紫外光下照射反應(yīng)15分鐘，待反應(yīng)結(jié)束后，離心去除geloadertip內(nèi)的二苯甲酮溶液；重復(fù)上述操作三次，以充分活化聚丙烯小柱。配制聚合液的組成如下：13.4％egmp(乙烯基乙二醇甲基丙烯磷酸酯)、0.10g/mlbis(亞甲基雙丙烯酰胺)、45.0％dmso(二甲基亞砜)、8.3％dmf(二甲基甲酰胺)、33.3％十二烷醇；取3μl聚合液超聲脫氣10分鐘以排除氧氣后，加入到上述活化的聚丙烯小柱中，置于365nm波長紫外線下照射反應(yīng)15分鐘。待聚合反應(yīng)完成后，使用甲醇沖洗有機整體柱材料以除去小柱內(nèi)未反應(yīng)的殘余物，離心裝置是由離心小柱和兩個離心管組成，其中一個600μl的離心管用于固定離心小柱的尖端，另一個2ml的離心管用作離心支撐和樣品收集。由此，嫁接了磷酸酯有機整體柱材料的聚丙烯小柱制備而成。使用掃描電子顯微鏡(sem,zeisssupra55,jena,germany)可獲取該離心小柱內(nèi)有機整體柱材料的微觀形貌。配制100μl50mg/ml硫酸鈦水溶液，加入到上述制備好的磷酸基離心小柱內(nèi)，5000g轉(zhuǎn)速下離心反應(yīng)15分鐘，棄掉離心分離出的液體，重復(fù)上述操作3次，使鈦離子與有機整體柱材料上的磷酸基團充分螯合。然后使用洗滌溶水液1(30％acn/0.1％tfa，v/v)，在5000g轉(zhuǎn)速下離心洗滌該小柱至少5次，再用洗滌水溶液2(200mmnacl水溶液)離心洗滌該小柱3次，以充分去除小柱上大大過量的硫酸鈦，最后用去離子水洗滌3次以除去上一步洗滌中殘留的鹽離子。

如圖2所示，通過掃描電子顯微鏡照片，我們可以清楚的看到有機整體柱材料的表面微觀形貌。圖2.a清楚地顯示出了磷酸基有機整體柱材料與聚丙烯表面之間的鍵和情況，兩者之間并沒有出現(xiàn)任何空隙，表明磷酸基有機整體柱材料是緊密嫁接于聚丙烯小柱的表面上的。因此，我們可以發(fā)現(xiàn)，與填充離心小柱相比，該有機整體小柱可免于塞子制備的困難與煩惱，極大簡化了離心小柱的制備過程。與此同時，更大放大倍數(shù)的掃描電子顯微鏡照片(圖2.b)展示了有機整體柱材料的微孔形貌。我們可以發(fā)現(xiàn)該有機整體柱材料孔徑豐富，且多為大孔，其孔徑大約為5μm。這種特性使得該有機整體柱小柱在樣品的預(yù)處理過程可避免出現(xiàn)很高的離心負(fù)壓；與此同時，其豐富的大孔結(jié)構(gòu)，對應(yīng)著材料較高的比表面積，可暴露出較多的磷酸基活性基團，也因此可鍵和較多的鈦離子，而這將大大有利于實現(xiàn)高效快速的磷酸肽富集。更為重要的是，該有機整體柱材料化學(xué)穩(wěn)定性高，可耐受強酸、強堿環(huán)境，滿足磷酸肽富集的要求，因為在磷酸肽富集過程，磷酸肽的富集與洗脫通常是在強酸、強堿性條件下進行的。

ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸肽富集分析的具體過程

在磷酸肽富集之前，首先使用上樣緩沖液(80％acn,6％tfa水溶液)酸化平衡ti(iv)-imac有機整體小柱。首先將蛋白質(zhì)酶解液與等體積的上樣緩沖液(80％acn,6％tfa)混合均勻，并轉(zhuǎn)移至有機整體離心小柱中，在3000g的轉(zhuǎn)速下離心富集30分鐘，離心分離出的液體再次轉(zhuǎn)移至ti(iv)-imac有機整體小柱內(nèi)，重復(fù)上述操作過程2次。然后，依次用洗滌水溶液1(50％acn,6％tfa,200mmnacl)和洗滌水溶液2(30％acn,0.1％tfa)分別離心洗滌小柱兩次，保持轉(zhuǎn)速為5000g，每次洗滌15分鐘，以去除普通肽段的非特異性吸附和洗滌溶液1中的鹽離子。最后，使用100μl10％氨水洗脫吸附在小柱上的磷酸化肽段兩次，合并洗脫液得產(chǎn)物，室溫凍干，保存在-30℃待用。

實施例2

操作過程同上ti(iv)-imac有機整體小柱用于富集分析的具體過程，將制備好的ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸化蛋白β-酪蛋白的富集分析。將100fmolβ-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液進行磷酸化肽段的富集，待徹底去除材料上的非特異性吸附之后，用10％氨水溶液洗脫磷酸化肽段，取其中的0.5μl洗脫液點到maldi靶片上進行maldi-tofms分析。作為對照實驗，沒有經(jīng)過磷酸肽富集步驟的100fmolβ-酪蛋白的胰酶酶解液平行進行maldi-tofms分析。

如圖3.a所示，未經(jīng)過富集步驟的樣品的質(zhì)譜譜圖中，高強度的非磷酸肽段峰占據(jù)了整個譜圖，無法準(zhǔn)備辨別出其磷酸肽的信號峰，這說明大量存在的非磷酸化肽段嚴(yán)重抑制了磷酸化肽段的離子化。但是，與之相反的，經(jīng)過ti(iv)-imac有機整體小柱富集以后，譜圖中只出現(xiàn)了清晰的磷酸肽及其去磷酸化對應(yīng)物的質(zhì)譜峰，非磷酸化肽段的信號峰幾乎全部消失(圖3.b)，這證明了ti(iv)-imac有機整體小柱的高效富集能力。在此基礎(chǔ)之上，我們進一步考察了該有機整體小柱對β-酪蛋白酶解液的檢測靈敏度，如圖3.c和3.d所示，該有機整體小柱可以成功富集到10fmol和5fmolβ-酪蛋白酶解液中的磷酸肽，表明該小柱可實現(xiàn)fmol級別的樣品分析。

實施例3

操作過程同上ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸肽富集分析的具體過程，將β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液以不同摩爾比(500:1和1000:1，mol/mol)混合來模擬復(fù)雜樣品，進一步評估ti(iv)-imac有機整體小柱的 特異性。

如圖4所示，在非磷酸化肽段(bsa酶解液)大大過量的條件下，maldi譜圖中只出現(xiàn)了清晰的磷酸肽及其去磷酸化對應(yīng)物的質(zhì)譜峰，即使當(dāng)β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液的摩爾比達到1000:1時，非磷酸化肽段的干擾信號依然不明顯，這證明了ti(iv)-imac有機整體小柱的高富集特異性。

實施例4

操作過程同上ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸肽富集分析的具體過程，將其用于實際樣品hela細(xì)胞樣品的富集分析。運用ti(iv)-imac有機整體小柱分別富集分析一系列不同質(zhì)量的hela細(xì)胞蛋白酶解液，分別是10μg，25μg，50μg以及100μg，將富集到的磷酸肽樣品進行l(wèi)c-ms/ms分析。

圖5.a給出了每個樣品中分別鑒定到的非冗余磷酸肽的數(shù)目。從10μghela細(xì)胞蛋白質(zhì)中可以鑒定到約1300個非冗余磷酸化肽段，隨著樣品檢測質(zhì)量的增加，鑒定到的磷酸肽的數(shù)量也隨之增加，25μghela細(xì)胞蛋白質(zhì)中鑒定到約2000個非冗余磷酸化肽段，50μghela細(xì)胞蛋白質(zhì)中鑒定到約2300個，最終，在100μg上樣量時，磷酸肽的鑒定數(shù)目達到了穩(wěn)定狀態(tài)，同樣可鑒定到約2300個非冗余磷酸化肽段。這表明了ti(iv)-imac有機整體小柱高效的富集能力，完全可以應(yīng)用于實際生物樣品的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

進一步統(tǒng)計每組樣品中分別鑒定到的單磷酸化肽段和多磷酸化肽段的比例。如圖5.b所示，當(dāng)上樣量是10μg和25μg時，單磷酸化肽段的比例都為75％左右，而當(dāng)上樣量增加到50μg和100μg時，單磷酸化肽段的比例顯著降低到50％左右。這是因為當(dāng)樣品的上樣量較少時(10μg)，該有機整體小柱具有足夠的富集容量去同時吸附單磷酸化肽段和多磷酸化肽段。然而，隨著上樣量的增加，富集材料逐漸達到了其飽和的狀態(tài)，同時由于其有限的富集容量，單磷酸化肽段和多磷酸化肽段之間就會出現(xiàn)競爭吸附。顯而易見的是，多磷酸化肽段由于包含有多個磷酸根，因此與吸附材料上的鈦離子的結(jié)合能力較強，從而可以被富集材料優(yōu)先選擇性地富集。因此，我們可以發(fā)現(xiàn)ti(iv)-imac有機整體小柱在25μghela細(xì)胞蛋白的上樣量時達到飽和，當(dāng)上樣量增至50μg和100μg時，該有機整體小柱已經(jīng)處于過飽和的狀態(tài)。因此該ti(iv)-imac有機整體小柱的富集容量為25μg。

該ti(iv)-imac有機整體小柱的富集特異性也同時證明了這一點。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品量為10μg時，富集特異性高達95％；當(dāng)樣品上樣量增加到25μg和50μg時，吸附特異性小幅下跌，但依然高達90％左右，這主要是得益于該材料較高的富集效率，但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品量激增至100μg時，富集特異性則顯著降低到只有75％左右。再一次證明了該ti(iv)-imac有機整體小柱的富集容量為25μg。

實施例5

操作過程同上ti(iv)-imac有機整體小柱用于磷酸肽富集分析的具體過程，ti(iv)-imac有機整體小柱用于微量樣品的分析。對5μghela細(xì)胞蛋白酶解液進行富集分析，將得到的磷酸肽樣品通過自動進樣器上樣至質(zhì)譜儀進行分析檢測，同時進行三次技術(shù)重復(fù)試驗。

圖6給出了每次實驗中所鑒定到非冗余的磷酸化位點數(shù)目。三次技術(shù)重復(fù)實驗中，分別從5μghela細(xì)胞蛋白中鑒定到1087，1043和1060個非冗余磷酸化位點，其中分別有802，767和772個位點是高度可信的磷酸化位點(classi，即localizationprobability>0.75，scoredifference>5)。這是目前文獻報道中，從5μg復(fù)雜細(xì)胞樣品中，結(jié)合自動進樣的標(biāo)準(zhǔn)lcms/ms分析方法，鑒定到的最好結(jié)果。其對磷酸肽的富集特異性是92.7％(rsd＝0.2％)。如此之高的富集特異性也同時表明了該有機整體小柱的高效富集能力。

本發(fā)明為一種ti(iv)-imac有機整體小柱的制備，并將其用于微量生物樣品的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。該有機整體柱材料是聚甲基丙烯酸酯類高聚物，含有豐富的孔結(jié)構(gòu)，比表面積高，鈦離子的富集活性位點多；與此同時，由于其親水性的材料表面，在磷酸肽富集方面展現(xiàn)出了強大的富集能力。將其用于5μghela細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，平均鑒定到了超過1000個以上的非冗余磷酸化位點，且富集特異性高達92.5％。更重要的是，該ti(iv)-imac有機整體小柱制備簡單，相比較填充小柱，它可以通過光誘導(dǎo)的自由基聚合反應(yīng)僅需數(shù)分鐘就制備完成；且無需進行塞子的制備，在很大程度上減少富集材料的準(zhǔn)備時間。