.5mL后開始收集樣品組分，每管0.5mL，收集12管。收集到的樣品經(jīng)SDS-聚丙締酷胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)分離后，一部分凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定純度(附圖7a)。另一部分凝 膠作Western-Blot將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，結(jié)果顯示純化得到的蛋白樣品可W被特 異性ACTH抗體識(shí)別（附圖化）。
[0039] 2.具有長(zhǎng)效高效ACTH突變體的篩選
[0040] 2.1各種ACTH多膚在小鼠血液中的代謝程度及體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定
[0041 ] 2.1.1給藥后血液中ACTH代謝程度測(cè)定
[0042] 選擇4周齡體重為20g的昆明鼠（海南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、），分為4組，分別為空白對(duì)照 組(Con)，ACT肥4、ACTH(WT)、ACTH化抓）；給藥組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)的ACTH多膚，藥物濃度為 45.5ng/g，空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水。15min后摘一側(cè)眼球采血，分離血清;45min后 摘另一側(cè)眼球采血，分離血清。用A C T Η E LIS A試劑盒（南京森貝伽）檢測(cè)所采血清樣本的 ACTH含量。（附圖8a)
[0043] 2.1.2不同ACTH多膚體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定
[0044] ACTH能夠刺激糖皮質(zhì)激素(GC)的合成，通過檢測(cè)小鼠體內(nèi)GC的濃度變化即可檢測(cè) ACTH在小鼠體內(nèi)的活性。選擇4周齡體重為20g的昆明鼠，分組同上，分別為Con、ACTH24、 ACTH(WT)、ACTH化加），給藥組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)的ACTH多膚，藥物濃度為32.5ng/g，Con組 注射等體積生理鹽水。15min后摘一側(cè)眼球采血，分離血清;45min后摘另一側(cè)眼球采血，分 離血清。用小鼠腎上腺皮質(zhì)激素 ELISA試劑盒（南京森貝伽）檢測(cè)所采血清樣本中GC水平。 (附圖8b)
[0045] 2.2不同ACTH多膚刺激腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細(xì)胞分泌GC水平測(cè)定
[0046] 在37 °C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中，用含10 %FBS(Gibco)的F12培養(yǎng)基(Gibco)在6孔 板中培養(yǎng)小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細(xì)胞，待貼壁長(zhǎng)滿單層細(xì)胞后。用含巧儀離子的憐酸鹽緩沖 液沖洗3次，之后加入無(wú)血清F12培養(yǎng)基(G化C0)培養(yǎng)化。用2(K)ng/ml的不同ACTH多膚(ACTH、 ACTH24、E5D)刺激Y1細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照，分別刺激化、1化、24h、4化。取培養(yǎng)上清液，用腎上 腺皮質(zhì)激素化ISA試劑盒(南京森貝伽)檢測(cè)所采樣本的GC含量。（見圖8)
[0047] W上體內(nèi)外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，ACTH(E抓)與野生型ACTH(WT)、ACTH24促進(jìn)糖皮質(zhì)激 素產(chǎn)生的生物活性相當(dāng)。并且ACTH化加)靜脈給藥15min及45min后，血藥濃度顯著高于ACTH (WT)及ACT肥4。所W，ACTH化抓)是一種基因重組長(zhǎng)效人促腎上腺皮質(zhì)激素。
【附圖說(shuō)明】
[004引圖1.技術(shù)方案。
[0049]圖 2.HisTag-Linker-EKst-ACTH-pET30a質(zhì)粒載體圖譜及酶切驗(yàn)證。a.HisTag- Linke;r-EKst-ACTH-祀T30a質(zhì)粒圖譜。紅色弧形箭頭顯示HisTag-Linke;r-邸st-ACTH開放閱 讀框（CDS)及轉(zhuǎn)錄方向。b.HisTag-Linker-EKst-ACTH-pET30a 質(zhì)粒 BamHl 及 Sail 雙酶切鑒 定。M:分子量標(biāo)記。泳道1:不含HisTag-Linker-EKst-ACTH序列的pET30a空質(zhì)粒載體BamHl 及Sal 1雙酶切。泳道2: HisTag-Linker-EKst-ACTH-祀T30a BamHl及Sal 1雙酶切，小片段為 邸3*-4(：1'山大片段為載體祀了3〇3。化3化肖:化3標(biāo)簽；^111?5。123個(gè)堿基構(gòu)成的化3標(biāo)簽與 邸St-ACTH之間的鏈接片段;enterokinase site化Kst):腸激酶底物核巧酸序列。
[0化0]圖3.ACTH野生型(WT)測(cè)序結(jié)果圖。注：圖中標(biāo)記的1至1000的堿基排列數(shù)值從可檢 出的測(cè)序起始位置開始計(jì)數(shù)。
[0051 ]圖4.ACTH突變型化加)測(cè)序結(jié)果圖。ACTH序列中谷氨酸化)密碼子GAA換成了編碼 天冬氨酸(D)密碼子GAC。注：圖中標(biāo)記的1至1000的堿基排列數(shù)值從可檢出的測(cè)序起始位置 開始計(jì)數(shù)。
[0052]圖 5.重組蛋白 HisTag-Linker-EKst-ACTH 的 NI 柱純化結(jié)果。HisTag-Linker-EKst- ACTH-pET30a質(zhì)粒在化-21-DE3工程菌中表達(dá)后，經(jīng)超聲破碎，上清液用儀柱純化后，經(jīng)SDS- PAGE(15%Tris-Glycine聚丙締酷胺凝膠)分離后，考馬斯亮藍(lán)R-250原位染色。M:分子量標(biāo) 記。泳道1-8: NI柱純化后的Hi sTag-Linker-邸st-ACTH融合蛋白的分離組分，組分2、3、4、5 中HisTag-Linker-EKst-ACTH融合蛋白含量較高。
[0053] 圖6.HisTag-Linker-邸st-ACTH融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切割的Western Blot檢測(cè)。 Μ: marker;泳道1:蛋白 Hi sTag-Linker-邸 st-ACTH 經(jīng)腸激酶酶切后，用 Wes tern Blotting (l6.5%T;ris-T;ricine聚丙締酷胺凝膠)檢測(cè)切得的ACTH，一抗為鼠抗人ACTH(San1:ac;ruz) 特異性抗體，二抗為Alexa488巧光標(biāo)記羊抗鼠抗體（Abeam)，用Typhoon化A 9500(GE Healthcare)檢測(cè)巧光條帶。
[0054] 圖7.切割后的樣品經(jīng)CM-cellulose陽(yáng)離子交換柱(Sigma-Al化ich)純化后的結(jié)果 圖。a.純化后的樣品經(jīng)12%Bis-化is聚丙締酷胺凝膠電泳分離后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色 結(jié)果。ACTH24:只包含N端24個(gè)氨基酸的ACTH活性片段。ACTH(WT):包含全部39個(gè)氨基酸的野 生型ACTHdACTH(E5D):將野生型ACTH的第5位谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬耐蛔冃虯CTHDb.純化 ACTH(E抓)組分經(jīng)Western Blotting(12%Bis-Tris聚丙締酷胺凝膠)檢測(cè)結(jié)果。一抗為鼠 抗人ACTH(Santa Cruz)特異性抗體，二抗為Alexa488巧光標(biāo)記羊抗鼠抗體（Abeam)，用 Typhoon FLA 9500(GE Healthcare)檢測(cè)巧光條帶。
[0055] 圖8.靜脈注射ACTH后體內(nèi)血藥濃度及促糖皮質(zhì)素生成作用。a.小鼠尾靜脈注射野 生型(WT)或突變型化加)ACTH后15及45分鐘血液中ACTH水平。*沖<0.01，與空白組(Con)比 較嚴(yán)P<0.01，與野生型ACTH (WT)比較;η = 12。結(jié)果提示ACTH化抓)比野生型ACTH更不易被代 謝。b. ACTH( WT)及ACTH化抓)提高小鼠體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平作用。*沖<0.01，與空白組(Con) 比較嚴(yán)P<〇. 01，與野生型ACTH (WT)比較;η = 12。與ACTH (WT)及ACTH24相比，ACTH (E抓)在小 鼠體內(nèi)有更高的活性。Con:空白對(duì)照組。WT:野生型ACTH;ACTH24:只包含N末端24個(gè)氨基酸 的ACTH活性片段;E5D: N末端第5位谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腁CTH突變體。
[0056] 圖9.ACTH(WT)及ACTH化5D)刺激腎上腺皮質(zhì)Y1細(xì)胞株分泌糖皮質(zhì)激素實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。*沖<0.01，與空白對(duì)照組(Con)比較;N = 3。結(jié)果顯示ACTH化加)體外刺激腎上腺皮質(zhì)細(xì) 胞產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素的作用與野生型ACTH及ACTH24相當(dāng)。WT:野生型ACTH; ACT肥4:只包含N末 端24個(gè)氨基酸的ACTH活性片段;E5D: N末端第5位谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腁CTH突變體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 采用本專利所應(yīng)用的基因工程方法制備促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，包括野生型及突 變型。2. 采用本專利所描述的氨基酸定點(diǎn)突變，獲得的具有生物活性的ACTH突變體。3. 采用本專利所描述的氨基酸定點(diǎn)突變，獲得的在血液中不易被代謝的ACTH突變體。 4. N末端第5位氨基酸突變的ACTH。5. 本專利所采用的野生型ACTH及點(diǎn)突變型ACTH的制備工藝。6. 通過構(gòu)建表達(dá)本專利所描述的融合蛋白，即在多肽鏈一側(cè)加上本專利所描述的多肽 連接物(本專利稱其為L(zhǎng)inker)，來(lái)提高多肽在工程菌中的表達(dá)量。
【專利摘要】本發(fā)明說(shuō)明書描述了N端第5位谷氨酸(E)突變?yōu)樘於彼?D)的突變型人促腎上腺皮質(zhì)激素(簡(jiǎn)稱ACTH(E5D))及其制備工藝。在大腸桿菌中表達(dá)ACTH(E5D)組氨酸標(biāo)簽融合蛋白以后，經(jīng)過Ni柱初步純化，腸激酶切除多余氨基酸序列，以及凝膠過濾方法制備。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，ACTH(E5D)在血液中的穩(wěn)定性高于野生型ACTH，并且在相同劑量和相同給藥時(shí)間條件下的生理活性與野生型ACTH相當(dāng)。
【IPC分類】C12N15/70, C07K19/00, C07K14/695
【公開號(hào)】CN105669856
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610083772
【發(fā)明人】王大勇, 黃永林, 裴業(yè)春
【申請(qǐng)人】王大勇, 黃永林, 裴業(yè)春
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年2月13日