一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種動物高F值寡肽，具體涉及一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活劑。
【背景技術(shù)】
[0002]高F值寡肽混合物是一個由由3?7個氨基酸殘氨基酸殘基所組成的混合小肽(或稱寡肽)體系。F值(Fischer rat1)是指支鏈氨基酸(BCAA: Val，lie，Leu)與芳香族氨基酸(△△六:1'印巧^?1^)含量的摩爾數(shù)比值。正常人的血液中？值為3.0-3.5，而患有肝臟疾病病人的F值只有1.0或者更低，而高F值寡肽的F值應(yīng)大于20，遠(yuǎn)高于人體中這兩類氨基酸的比值。由于它具有獨特的氨基酸組成和生理功能，已經(jīng)受到食品和醫(yī)藥界的高度關(guān)注。
[0003]鰹魚(Katsuwonus pelamis)，屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、舵鰹亞科、鰹屬，又名正鰹、炸彈魚、堅魚、松魚、飛虎魚。鰹魚是大洋性重要經(jīng)濟魚。鰹魚分布范圍較廣，在印度洋、太平洋和大西洋水溫高于15攝氏度以上的水域，都有鰹魚的蹤跡，并且儲量豐富、開發(fā)利用前景樂觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2_ARE通路激活劑。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑，其特征在于該激活劑為五肽化合物，氨基酸序列為Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI_MS測定分子量為658.76 Da。
[0006]該激活劑的制備方法為:
I)金槍魚碎肉的酶解:取金槍魚碎肉勻漿，按固液比I g:1OmL?15 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH到9.0?10.0，將溶液溫度調(diào)制55?65°C，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的1.0 %?1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95X105 U/g)，酶解時間
3.5h?4.0 h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至45?55°C，調(diào)節(jié)pH到6.0?7.0，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的0.8 %?1.0%加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^^1]/^)，酶解時間2.5 h?3.0 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于8000?10000 rpm離心15?20 min，取上清液。
[0007]2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液，采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液;將超濾酶解液調(diào)pH值至2.5-3.5,按照物料與活性炭顆粒比為10?15:1將超濾酶解液以0.3?0.5mL/min流速緩慢加入到裝載有活性炭顆粒的玻璃柱中，上樣完成后，采用2?3倍柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成10?20 mg/mL的溶液，調(diào)pH值至6.5?7.5，緩慢加入到物料與D1I大孔樹脂比為1?15:1的裝載D1I大孔樹脂的玻璃柱中，用2?3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用2?3倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為金槍魚碎肉高F值寡肽。
[0008]3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得Nrf2-ARE通路激活劑。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的金槍魚為鰹魚(Katsuwonus pelamis)。
[0010]作為優(yōu)選，所述步驟3)的凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30 mg/mL的溶液，
經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.5?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響，選擇Nrf2蛋白質(zhì)水平最高組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據(jù)對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響得I個活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI_MS測定分子量為658.76 Da0
[0011]再優(yōu)選，所述反相高效液相色譜條件為:進樣量10?15yL;色譜柱KromasiI Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?40min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.8?1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。
[0012]與現(xiàn)在技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVff)對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；可促進Nrf2蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，上調(diào)抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf 2-ARE通路密切相關(guān)的疾病的藥品或保健食品。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0014]圖2葡聚糖凝膠SephadexG_15制備酶解物的反相高效液相色譜色譜圖。
[0015]圖3Ile-Glu-Leu-Val-Trp (ffiLVW)對Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
【具體實施方式】
[0016]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
[0017]實施例:
一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚碎肉〃雙酶酶解〃酶解物〃超濾〃活性炭吸附〃大孔樹脂純化〃金槍魚高F值寡肽〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃Nrf2-ARE通路激活劑。
[0018]I)金槍魚碎肉的酶解:取鰹魚碎肉勻漿，按固液比I g:12 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH到9.3，將溶液溫度調(diào)制60°C，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的1.2 %加入堿性蛋白酶(酶活力M.95X105 1]/^)，酶解時間3.5 h后，酶解液于95°C保溫12 min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至50°C，調(diào)節(jié)pH到7.0，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的0.9%加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^?1]/^)，酶解時間3.0 h，酶解液于95°C保溫15min后降至室溫，于9000 rpm離心15 min，取上清液。
[0019]2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液，采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液;將超濾酶解液調(diào)pH值至3.0，按照物料與活性炭顆粒比為12:1將超濾酶解液以0.3mL/min流速緩慢加入到裝載活性炭顆粒的玻璃柱中，上樣完成后，采用3倍柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液，調(diào)pH值至7.0，緩慢加入到物料與DlOl大孔樹脂比為15:1的裝載DlOl大孔樹脂的玻璃柱中，用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用3柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為金槍魚碎肉高F值寡肽。
[0020]3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得Nrf2-ARE通路激活劑。
[0021]作為優(yōu)選，所述步驟3)的凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: ①凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響，選擇Nrf2蛋白質(zhì)水平最高組分凍干，即為凝膠層析酶解物Fr.3(圖1)。
[0022]②反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成100yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化(條件為:進樣量15 yL;色譜柱KromasiI Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?40min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度
0.8 mL/min;紫外檢測波長220 nm。)，根據(jù)對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響得I個活性多肽(圖2)。
[0023]③結(jié)構(gòu)檢測:收集對Nrf2蛋白質(zhì)累計水平最高的多肽，經(jīng)反相高效液相色譜檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ES1-MS測定分子量為658.76 Da。
[0024]自由基清除實驗:將制得的金槍魚碎肉多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp(IELVW)進行自由基清除實驗。實驗結(jié)果表明= Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)對羥基自由基(EC5q 0.12mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5Q 0.06 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0025]抗氧化肽對激活Nrf2/ARE通路的作用:取對數(shù)生長期的人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞接種于60mm皿24小時后，分別加入ΙΟμΜ的酶解液和Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)JI續(xù)培養(yǎng)4小時。棄去上清，細(xì)胞用RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20yg蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，然后按常規(guī)免疫印跡方法檢測Nrf2的蛋白水平。
[0026]與現(xiàn)在技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVff)對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；可促進Nrf2蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，上調(diào)抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf 2-ARE通路密切相關(guān)的疾病的藥品或保健食品。
[0027]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑，其特征在于:該激活劑為五肽化合物，氨基酸序列為Ile-Glu-Leu-Val-Trp，ESI_MS測定分子量為658.76 Da。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑。本發(fā)明以金槍魚碎肉為原料，通過雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、活性炭吸附和大孔樹脂純化得金槍魚高F值寡肽，再利用凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp？，ESI-MS測定分子量為658.76？Da；制備的高活性多肽對羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時亦可促進Nrf2？蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，可用作治療肝損傷、皮膚光老化、衰老等與Nrf2-ARE通路密切相關(guān)疾病治療的藥物和功能產(chǎn)品。
【IPC分類】C07K14/46
【公開號】CN105669853
【申請?zhí)枴緾N201610110512
【發(fā)明人】王斌, 趙玉勤, 孫坤來, 羅紅宇
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月29日