專利名稱：鉀診斷/測(cè)定試劑盒及鉀濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鉀診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清鉀三個(gè)決定性水平的臨床意義低于參考值下限，表現(xiàn)低鉀rfn
癥，其原因有腎小管疾病，高醛固酮癥，胰島素過多癥，代謝性堿中 毒，利尿劑治療、胰島素治療糖尿病酮癥時(shí)鉀離子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)等。 高于參考值上限，可能由腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、
腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當(dāng)血鉀高達(dá)7. 5 mmol/L或以上時(shí)病人將出現(xiàn) 心律失常，應(yīng)考慮確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨?。血清鉀超過10 mmol/L時(shí)， 即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測(cè)定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰 光度計(jì)法、化學(xué)測(cè)定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動(dòng)力 學(xué)法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測(cè) 血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測(cè) 定方法分為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大， 一般 不采用。現(xiàn)在主要使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃 度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行測(cè)定。操作時(shí)，將含鋰的溶液作為稀釋
液，同時(shí)測(cè)定K、 Na和Li的濃度，以標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的Na/Li與K/Li 比值，計(jì)算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大，血清蛋白質(zhì)粘性的影 響幾乎可忽略不計(jì)。
化學(xué)測(cè)定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為 冠醚，均為離子載體進(jìn)行測(cè)定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧 原子有未共用電子對(duì)可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié) 合不同直徑的金屬離子，從而可達(dá)到測(cè)出離子濃度的目的。測(cè)定血清 K， 一般采用普通冠醚陰離子染料進(jìn)行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器 上進(jìn)行血清和尿等體液的K+、 Na+的測(cè)定，因標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確， 幾乎有取代其他方法的趨勢(shì)。其儀器測(cè)定原理是離子選擇電極與參比 電極組合浸泡在待測(cè)標(biāo)本溶液中，進(jìn)行檢測(cè)。目前己有的電極種類為
① 玻璃膜電極，感應(yīng)材料為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；
② 固相膜電極，由難溶性金屬物質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為 感應(yīng)膜的電極有C1—電極和F—電極；③液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝
聚氯乙稀為感應(yīng)膜的C,電極；④用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述
電極均有一定的壽命，因?yàn)殡姌O使用一段時(shí)間就會(huì)自動(dòng)老化，有效期
長(zhǎng)短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測(cè)血清K+、 Na+，操作 繁雜，誤差較大，不及火焰光度法簡(jiǎn)便。
鉀測(cè)定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。WHO推薦 的方法是火焰光度計(jì)法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測(cè)定法和火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且 抗干擾性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，彌補(bǔ)了生化分析儀不能同時(shí)測(cè)定鉀鈉的不足。 有較好的分析性能，易于自動(dòng)化，在臨床化學(xué)分析中必定取代火焰光 度計(jì)法成為常規(guī)分析項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)
還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得 以測(cè)定鉀濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鉀診 斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自 動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鉀濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而 可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 ' 本發(fā)明鉀濃度測(cè)定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸
+丙酮酸
丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
這種方法利用需要鉀離子激活的丙酮酸激酶(pyruvate kinase ; EC 2.7.1.40)偶聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)酶 促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速率比色法。丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反 應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶)聯(lián)合丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過 測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算鉀的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀診斷/測(cè)定 試劑盒較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 丙酮酸激酶 丙氨酸脫氫酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
12000 U/L 12000U/L 5 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L
本發(fā)明的鉀診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮 酸、氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙
酮酸、氯化氨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化氨、丙酮酸激
酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙 酮酸。
試劑2
緩沖液、氯化氨。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化氨、丙酮酸激
酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試
劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體
試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定鉀濃度的方法，其還原型
輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸激酶 12000 U/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 5 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 2 mmol/L
氯化氨 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；
使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始
吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)鉀樣
品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)
間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340mn吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀的濃
度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷二磷酸
磷酸烯醇式丙酮酸
氯化氨
100 mmol/L 50 mmol/JL
0.25 mmol/L 15 mmol/L 6 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶
100 mmol/L 50 mmol/L
24000 U/L 24000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)鉀樣 品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反 應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀的濃 度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 8 mmol/L 2 mmol/L
100 mmol/L 40 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
丙酮酸激酶
丙氨酸脫氫酶
100 mmol/L
50 mmol/L
32000 U/L
32000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定鉀濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)
間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng) 405nm，被測(cè)鉀樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間 2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀的濃
度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀濃度測(cè)定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968930002C1.gif" wi="133" he="37" top= "49" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出鉀的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種鉀診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑卜50 mmol/L還原型輔酶0.1———0.35 mmol/L丙酮酸激酶1000——-80000 U/L丙氨酸脫氫酶1000———?jiǎng)?0 U/L腺苷二磷酸卜50 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸卜50 mmol/L氯化氨l一50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯 化氨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫 酶組成。還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化氨、 丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸組成； 試劑2，由緩沖液、氯化氨組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙 酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯 醇式丙酮酸、氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶在試劑l、試劑 2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氯化氨、丙酮酸激酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出鉀的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101169429SQ20061009689
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司