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鉀診斷/測(cè)定試劑盒及鉀濃度測(cè)定方法

文檔序號(hào):6087113閱讀:302來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:鉀診斷/測(cè)定試劑盒及鉀濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種鉀診斷/測(cè)定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀濃 度的方法,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
血清鉀三個(gè)決定性水平的臨床意義低于參考值下限,表現(xiàn)低鉀血 癥,其原因有腎小管疾病,高醛固酮癥,胰島素過(guò)多癥,代謝性堿中 毒,利尿劑治療、胰島素治療糖尿病酮癥時(shí)鉀離子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)等。 高于參考值上限,可能由腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、
腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當(dāng)血鉀高達(dá)7. 5 mmol/L或以上時(shí)病人將出現(xiàn) 心律失常,應(yīng)考慮確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮Q邂洺^(guò)10 mmol/L時(shí), 即可發(fā)生心室纖顫,心臟停搏而死亡。高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測(cè)定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰 光度計(jì)法、化學(xué)測(cè)定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動(dòng)力 學(xué)法。
火焰光度法1950年開(kāi)始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測(cè) 血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+,是一種發(fā)射光譜分析法。測(cè) 定方法分為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大, 一般 不采用?,F(xiàn)在主要使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法,即標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃 度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行測(cè)定。操作時(shí),將含鋰的溶液作為稀釋
液,同時(shí)測(cè)定K、 Na和Li的濃度,以標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的Na/Li與K/Li 比值,計(jì)算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大,血清蛋白質(zhì)粘性的影 響幾乎可忽略不計(jì)。
化學(xué)測(cè)定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚,亦稱為 冠醚,均為離子載體進(jìn)行測(cè)定,由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴,分子內(nèi)部氧 原子有未共用電子對(duì)可與金屬離子結(jié)合,根據(jù)空穴大小,可選擇性結(jié) 合不同直徑的金屬離子,從而可達(dá)到測(cè)出離子濃度的目的。測(cè)定血清 K, 一般采用普通冠醚陰離子染料進(jìn)行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極,在專用儀器 上進(jìn)行血清和尿等體液的K+、 Na+的測(cè)定,因標(biāo)本用量少,快速準(zhǔn)確, 幾乎有取代其他方法的趨勢(shì)。其儀器測(cè)定原理是離子選擇電極與參比 電極組合浸泡在待測(cè)標(biāo)本溶液中,進(jìn)行檢測(cè)。目前已有的電極種類為
① 玻璃膜電極,感應(yīng)材料為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極;
② 固相膜電極,由難溶性金屬物質(zhì)加壓成型,以固體膜或單日膜作為 感應(yīng)膜的電極有C1—電極和F—電極;(D液態(tài)膜電極,將環(huán)氧樹(shù)脂或內(nèi)裝 聚氯乙稀為感應(yīng)膜的Ca"電極;④用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述 電極均有一定的壽命,因?yàn)殡姌O使用一段時(shí)間就會(huì)自動(dòng)老化,有效期 長(zhǎng)短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測(cè)血清K+、 Na+,操作 繁雜,誤差較大,不及火焰光度法簡(jiǎn)便。
鉀測(cè)定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。冊(cè)0推薦 的方法是火焰光度計(jì)法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍,但是電
極成本昂貴。
酶測(cè)定法和火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法均有較好的一致性,且 抗干擾性強(qiáng),穩(wěn)定性好,彌補(bǔ)了生化分析儀不能同時(shí)測(cè)定鉀鈉的不足。 有較好的分析性能,易于自動(dòng)化,在臨床化學(xué)分析中必定取代火焰光 度計(jì)法成為常規(guī)分析項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),監(jiān)測(cè) 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化,得 以測(cè)定鉀濃度的方法,同時(shí),本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鉀診 斷/測(cè)定試劑盒,采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自 動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鉀濃度測(cè)定,而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高,因而 可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鉀濃度測(cè)定方法原理如下
色氨酸+水色氨酸酶丙酮酸+氨離子+吲哚 丙酮酸+還原型輔酶乳酸脫氫酶L-乳酸+輔酶
這種方法利用需要鉀離子激活的色氨酸酶(tryptophanase ; EC 4丄99.1)酶(偶)聯(lián)乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase ; EC l丄1.27 ; EC l丄1.28)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速率比色法。色氨酸酶酶解色氨酸 反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸,再通過(guò)(偶)聯(lián)合乳酸脫氫酶的作用,最終將還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收 峰),從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度,通過(guò)
測(cè)量340nm處吸光度下降的速度,可以測(cè)算鉀的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明,從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮,無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀診斷/測(cè)定
試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
色氨酸酶 12000 U/L
乳酸脫氫酶 12000 U/L
色氨酸 10mmol/L
本發(fā)明的鉀診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫 酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成 液體試劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、乳酸脫氫酶。 還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑: 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、色氨酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、乳酸脫氫酶。 還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶在試劑l、試劑2或
試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶 解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測(cè)定鉀濃度的方法,其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmd/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
12000 U/L
乳酸脫氫酶 12000 U/L
10 mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進(jìn)行冷凍干燥,制成干粉試劑; 使用前,加入純凈水,復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始 吸光度1.8±0.7,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)鉀樣 品與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng)),延遲時(shí) 間大約O分鐘左右,檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度,從而測(cè)算出鉀的濃 度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為雙試劑,包括-
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔!
0.25 mmol/L
20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
色氨酸酶 24000 U/L
乳酸脫氫酶 24000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始
吸光度1.8±0.7,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)鉀樣 品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反 應(yīng)),延遲時(shí)間大約l分鐘左右,檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度,從而測(cè)算出鉀的濃 度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的鉀診斷/測(cè)定試劑為三試劑,包括-試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 還原型輔酶
50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
12 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
乳酸脫氫酶
50 mmol/L 30000 U/L 30000 U/L 試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。 測(cè)定鉀濃度時(shí),在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反應(yīng)時(shí)
間10分鐘,起始吸光度1.8±0.7,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng) 405nm,被測(cè)鉀樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5, 反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng)),延遲時(shí)間大約l分鐘左右,檢測(cè)時(shí)間 2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度,從而測(cè)算出鉀的濃 度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的,鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同,不另一一例舉。
總之,實(shí)驗(yàn)證明,采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果,并且靈敏度高、精確度好,便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀濃度測(cè)定方法,其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968950002C1.gif" wi="118" he="16" top= "49" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度,測(cè)算出鉀的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種鉀診斷/測(cè)定試劑盒,主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L色氨酸酶 1000——80000 U/L乳酸脫氫酶 1000——80000 U/L 色氨酸 1——50mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒,其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶 組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶組成雙劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、 組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、乳酸脫氫酶組成。 還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶 組成多劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成;試 劑2,由緩沖液、色氨酸組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨 酸酶、乳酸脫氫酶組成。還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫 氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀診斷/測(cè)定試劑盒,其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1^000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀診斷/測(cè)定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定鉀濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下,檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度,從而測(cè)算出鉀的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101169431SQ20061009689
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司
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