一種es-2肽的季銨化殼寡糖修飾物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)是一種內(nèi)源性的新生血管生成抑制因子，能夠有效地抑制新生血管的形成，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給途徑和廢物代謝途徑，起到抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。ES-2肽(IVRRADRAAVP)是ES結(jié)構(gòu)中一個(gè)具有明顯抗新生血管生成、抗腫瘤活性的短肽段，更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，且更容易獲得和改造，但是同ES—樣，ES-2肽也存在體內(nèi)半衰期短和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)大大的限制了ES-2肽進(jìn)一步的應(yīng)用。
[0003]殼寡糖是目前發(fā)現(xiàn)的自然界存在的唯一一種陽(yáng)離子多糖，結(jié)構(gòu)明確且有靶向性，經(jīng)季銨化后能進(jìn)一步提高其帶正電荷的能力。
[0004]N,N, N-三甲基季銨化殼聚糖(TMC)制備過(guò)程中，殼寡糖的2_冊(cè)2被甲基化后首先生成2-NH( CH3)甚至2-N( CH3) 2，然后才能進(jìn)一步形成2-N( CH3) 3+季銨基團(tuán)，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基數(shù)量極少(一般〈10% )，導(dǎo)致其對(duì)ES-2的結(jié)合效率較低、結(jié)合物活性保持率差，制約了季銨化殼寡糖對(duì)ES-2肽分子進(jìn)行化學(xué)修飾。
[0005]而且，由于ES-2短肽分子量較小，且等電點(diǎn)位10.42，屬于堿性蛋白，所以用同帶正電荷的季銨化殼寡糖對(duì)其進(jìn)行修飾的難度相較于對(duì)其他非堿性蛋白修飾的難度要大的多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物及其制備方法。
[0007]由于在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，新生血管的生成會(huì)為腫瘤組織提供營(yíng)養(yǎng)并運(yùn)走廢物，因此如果抑制腫瘤引起的新生血管的生成，就可以起到“餓死腫瘤”的作用;在糖尿病等疾病過(guò)程中，新生血管的生成會(huì)導(dǎo)致出血等嚴(yán)重反應(yīng)，對(duì)于新生血管的生成的抑制可以明顯治療病人視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物在制備抗新生血管生成和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0009]一種ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物，由ES-2肽分子上的羧基與季銨化殼寡糖(0-HTCC)分子的氨基通過(guò)酰胺鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)式如下:
[0010](ES-2)n-C0-NH-0-HTCC；
[0011]式中，n = l?10;ES-2的分子量為1223Da，等電點(diǎn)為10.42;0-HTCC的分子量為100Da以上，自由氨基摩爾含量為不小于20%。
[0012]優(yōu)選的，所述η= I?5，即一分子O-HTCC與I?5分子ES-2共價(jià)結(jié)合形成修飾物;0-HTCC的分子量為100Da?1000Da，自由氨基摩爾含量為不小于50%。
[0013]季銨化殼聚糖的分子量會(huì)影響所修飾的ES-2肽的活性，若季銨化殼聚糖的分子量過(guò)大，會(huì)造成嚴(yán)重的空間位阻和構(gòu)象變化，使小分子的ES-2肽的活性顯著降低;但季銨化殼聚糖的分子量也不宜過(guò)低，需保證一定量的自由氨基數(shù)量。本發(fā)明綜合考慮所修飾的ES-2肽的活性以及與季銨化殼聚糖結(jié)合率，優(yōu)選O-HTCC的分子量為100Da?lOOOODa，在較好保持ES-2肽活性的同時(shí)，還提高了與季銨化殼聚糖的結(jié)合率。
[0014]除非另外指出，術(shù)語(yǔ)一自由氨基”:伯胺基團(tuán)(即一順2)，亦稱一級(jí)胺基。
[0015]術(shù)語(yǔ)“季銨化殼寡糖”:殼寡糖的C6-OH上接枝一個(gè)含有季銨鹽的基團(tuán)而得到的衍生物。
[0016]上述ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物的制備方法，步驟為:
[0017](I)向ES-2肽溶液中加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)進(jìn)行羧基活化，ES-2肽與EDC的摩爾比為1:(1-100)，EDC與NHS的摩爾比為3: (0.1-5)，反應(yīng)溫度為20°C?30°C，緩慢攪拌且避光反應(yīng)15?45min;
[0018](2)將步驟(I)反應(yīng)后的溶液加入到季銨化殼聚糖溶液中，使ES-2肽與季銨化殼寡糖的質(zhì)量比為1:(0.1?30)，反應(yīng)4?8h，得粗品，經(jīng)分離純化，即得ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物。
[0019]步驟(I)中，所述ES-2肽溶液為將ES-2肽溶于I3BS緩沖液而得到的溶液;ES-2肽溶液的pH為4.0-6.0，其中ES-2肽的濃度為0.5?5mg/ml。
[0020]步驟(2)中，所述季銨化殼聚糖溶液為將季銨化殼聚糖溶于PBS緩沖液而得到的溶液;季銨化殼聚糖溶液的PH優(yōu)選為7.0-9.0，其中季銨化殼聚糖的濃度為I?5mg/ml。由于中性偏堿性環(huán)境有利于ES-2肽分子的羧基與季銨化殼寡糖分子的氨基的酰胺鍵的形成，故本發(fā)明將季銨化殼聚糖溶液的pH選擇為7.0-9.0。
[0021 ] 步驟(2)中，所述分離純化的具體方法為:采用SephadexG-25或Sephadex30凝膠層析柱進(jìn)行分離純化；用pH為6.0，濃度25mmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行線性洗脫，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，收集洗脫峰組分;采用截留分子量為500?1000D透析袋中透析48h，去除鹽分，冷凍干燥。由于SephadexG-25和Sephadex30凝膠層析柱的分離純化范圍是O?10000，ES-2和季氨化殼寡糖以及修飾物的分子量正好處于這兩種凝膠層析柱的分子范圍之中，所以本發(fā)明選擇SephadexG-25或Sephadex30作為凝膠層析柱進(jìn)行分離純化，其分離純化效果較好。
[0022]優(yōu)選的，步驟(I)中，ES-2肽與EDC的摩爾比為1: (10?50)，EDC與NHS的摩爾比為3:(0.2 ?2)0
[0023]優(yōu)選的，步驟(2)中，ES_2肽與季銨化殼寡糖的質(zhì)量比為I: (0.5?5)。
[0024]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述季銨化殼聚糖的制備方法為:將殼聚糖溶于醋酸水溶液中，加入乙醇，室溫?cái)嚢?，充分溶脹后加入苯甲醛，制得乳白色膠狀反應(yīng)液;將上述乳白色膠狀反應(yīng)液干燥后研磨，加入異丙醇、2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干燥后，再加入鹽酸乙醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)沉淀、干燥后得季銨化殼聚糖粗品；上述季銨化殼聚糖粗品溶于水中，采用截留分子量為100?500D透析袋中透析48h，去除小分子雜質(zhì)，透析液冷凍干燥，制得季銨化殼聚糖(O-HTCC)。
[0025]本發(fā)明制備的季銨化殼聚糖，將2，3_環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)接枝到殼寡糖C6-0H上得到O-(羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼寡糖(O-HTCC)衍生物，水溶性更好，自由氨基率在90%以上。
[0026]采用EDC-NHS對(duì)羧基進(jìn)行活化，是有機(jī)合成反應(yīng)中的常用方法，但也是難點(diǎn)所在，EDC和NHS的加入量、反應(yīng)體系的pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素都會(huì)影響活化的效率;而且不同條件活化后的羧基與氨基的結(jié)合率也存在較大差異。本發(fā)明針對(duì)ES-2肽為堿性蛋白，采用同帶正電荷的季銨化殼聚糖對(duì)其進(jìn)行修飾的難度較對(duì)其他非堿性蛋白進(jìn)行修飾難度要大的多的問(wèn)題，優(yōu)化了 H)C和NHS的加入量、反應(yīng)溫度和純化手段，通過(guò)上述條件的協(xié)同作用，成功制備出穩(wěn)定性更高、半衰期更長(zhǎng)、細(xì)胞親和性更高、生物活性更強(qiáng)的季銨化殼聚糖-ES-2肽修飾物。
[0027]上述ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物在制備伴隨新生血管生成疾病的治療藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體的，所述伴隨新生血管生成疾病包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑病變和關(guān)節(jié)炎等。
[0028]本發(fā)明的有益效果:
[0029](I)本發(fā)明通過(guò)調(diào)整EDC和NHS加入的摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等條件，可以制備得到ES-2與季銨化殼寡糖不同結(jié)合率的修飾物。
[0030](2)本發(fā)明制備的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物與ES-2肽相比，其穩(wěn)定性更高、半衰期更長(zhǎng)、細(xì)胞親和性更高、生物活性更強(qiáng)。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1:本發(fā)明實(shí)施例2制備的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物的MALD1-T0F-MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0032]圖2:抗細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果。
[0033]圖3:抑制內(nèi)皮細(xì)胞迀移試驗(yàn)結(jié)果，圖中，a為空白，13為混合物，c為ES_2，d為0_HTCC-ES-2o
[0034]圖4:熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。
[0035]圖5:細(xì)胞親和性試驗(yàn)結(jié)果。