>[0077](I)試驗(yàn)藥物:實(shí)施例2制備的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物、ES-2以及ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物與ES-2按質(zhì)量比為1:1混合的混合物。
[0078](2)試驗(yàn)方法:
[0079]收集對(duì)數(shù)期人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5X 14/孔，接種于6孔板中，每孔2ml，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;將直尺提前放入超凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30min后，取6孔板細(xì)胞，棄上清，用PBS清洗2遍，在無菌直尺比對(duì)的同時(shí)用黃槍頭輕輕劃過細(xì)胞表面，形成一條無細(xì)胞的直線，每個(gè)孔畫3條直線，PBS清洗2遍以去掉劃掉的細(xì)胞。分別加入2ml含有的0-HTCC-ES-2修飾物和ES-2的DMEM培養(yǎng)基(含10 % FBS )，并以PBS作為陰性對(duì)照，藥物濃度調(diào)整到125yg/mL，并加入bFGF使其終濃度為5ng/ml，每種藥物設(shè)置3個(gè)平行孔，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h。取出6孔板，棄上清，置于倒置熒光顯微鏡下拍照，觀察劃痕的寬度。重復(fù)試驗(yàn)5次，取平均值。
[0080]抑制內(nèi)皮細(xì)胞迀移試驗(yàn)的結(jié)果見圖3，由圖3可以看出，相同藥物濃度作用下，0-HTCC-ES-2抑制內(nèi)皮細(xì)胞迀移的作用最強(qiáng)。
[0081 ] 3.熱穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0082]取適量的ES-2和0-HTCC-ES-2(實(shí)施例2制備)分別溶于等體積的pH7.4的I3BS緩沖液中，分別于37°C水浴孵育，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，按照CCK-8法測定其對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性。將所測的不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率與Omin時(shí)的抑制率相比計(jì)算得到活性保留百分比，以此為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制穩(wěn)定性曲線。
[0083]結(jié)果見圖4，可以看出，0-HTCC-ES-2修飾物與ES-2在37 °C環(huán)境中孵育相同時(shí)間后，0-HTCC-ES-2修飾物的保留活性百分比更高，也就是其熱穩(wěn)定性強(qiáng)于ES-2。
[0084]4.細(xì)胞親和性試驗(yàn)
[0085](I)試驗(yàn)藥物:實(shí)施例2制備的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物、ES-2以及ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物與ES-2按質(zhì)量比為1:1混合的混合物。
[0086](2)試驗(yàn)方法:
[0087]1)FITC標(biāo)記內(nèi)皮抑素及其結(jié)合物
[0088]稱取0-HTCC-ES-2修飾物、ES-2以及兩者混合物各3mg，分別用蒸餾水I mL溶解后，對(duì)pH 9?9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，透析后溶液液移入小燒杯中:稱取FITC Img，加入二甲亞砜(DMSO) lmL，使終濃度為Img FITC/ImL DMS0，按照FITC/ES-2約為50ygFITC/lmg蛋白質(zhì)的比例，將FITC-DMS0溶液逐滴加入透析后的ES-2及其修飾物、混合物溶液中，將標(biāo)記物用PBS加置至2.5mL，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h，用Scphadex GlO柱除去游離焚光素，先用25mLPBS淋洗GlO柱收集PBS洗脫第一個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰，測定F/P比值。計(jì)算:F/P =2.87 XΑ495/[Α280-0.35XA495]，該值應(yīng)介于2.5?4.5之間。
[0089]2)流式細(xì)胞儀檢測0-HTCC-ES-2修飾物、ES-2以及兩者混合物的FITC標(biāo)記物對(duì)EAhy926的結(jié)合能力
[0090]內(nèi)皮細(xì)胞接種于12孔板中(30X 14個(gè)/孔)，加入無血清培養(yǎng)基(內(nèi)含F(xiàn)ITC標(biāo)記后的0-HTCC-ES-2修飾物、ES-2以及兩者混合物，各用藥組按照蛋白濃度125yg/mL) I mL。分別于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，冰凍的PBS漂洗3次，轉(zhuǎn)移至流式管中，流式細(xì)胞儀測定各組陽性率。結(jié)果見圖5，ES-2經(jīng)O-HTCC修飾后，與內(nèi)皮細(xì)胞親和性明顯增加，藥物更容易進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮作用。
[0091]與天然的ES-2相比，ES-2經(jīng)O-HTCC通過酰胺鍵修飾后，相同質(zhì)量濃度梯度的0-HTCC-ES-2，在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和迀移等的作用方面，均比ES-2本身都有了明顯的增強(qiáng)和提高;0-HTCC-ES-2的熱穩(wěn)定性較ES-2有了顯著增強(qiáng)，此外0-HTCC-ES-2的細(xì)胞親和性也得到了很大的改善，藥物更加容易進(jìn)行細(xì)胞，發(fā)揮藥物作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物，其特征在于，由ES-2肽分子上的羧基與季銨化殼寡糖分子的氨基通過酰胺鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)式如下: (ES-2)n-C0-NH-0-HTCC； 式中，η = I?1; ES-2的分子量為1223Da，等電點(diǎn)為10.42; O-HTCC的分子量為100Da以上，自由氨基摩爾含量為不小于20%。2.如權(quán)利要求1所述的ES-2肽的季錢化殼寡糖修飾物，其特征在于，所述η= I?5 ； O-HTCC的分子量為100Da?100Da，自由氨基摩爾含量為不小于50%。3.權(quán)利要求1或2所述的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物的制備方法，其特征在于，步驟為: (1)向ES-2肽溶液中加入EDC和NHS進(jìn)行羧基活化，ES-2肽與EDC的摩爾比為1:(1-100)，EDC與NHS的摩爾比為3:(0.1-5)，反應(yīng)溫度為20°(:?30°(:，緩慢攪拌且避光反應(yīng)15?451^11; (2)將步驟(I)反應(yīng)后的溶液加入到季銨化殼聚糖溶液中，使ES-2肽與季銨化殼寡糖的質(zhì)量比為1: (0.1?30)，反應(yīng)4?8h，得粗品，經(jīng)分離純化，即得ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物。4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述ES-2肽溶液的pH為4.0-6.0，其中ES-2肽的濃度為0.5?5mg/ml。5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述季銨化殼聚糖溶液的pH為7.0-9.0，其中季銨化殼聚糖的濃度為I?5mg/ml。6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述分離純化的具體方法為:采用SephadexG-25或Sephadex30凝膠層析柱進(jìn)行分離純化；用pH為6.0，濃度25mmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行線性洗脫，流速1.0ml/min，檢測波長254nm，收集洗脫峰組分。7.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，ES-2肽與EDC的摩爾比為I:(10?50)，EDC與NHS的摩爾比為3:(0.2?2)。8.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，ES-2肽與季銨化殼寡糖的質(zhì)量比為1:(0.5?5)。9.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述季銨化殼聚糖的制備方法為:將殼聚糖溶于醋酸水溶液中，加入乙醇，室溫?cái)嚢?，充分溶脹后加入苯甲醛，制得乳白色膠狀反應(yīng)液;將上述乳白色膠狀反應(yīng)液干燥后研磨，加入異丙醇、2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)過濾、洗滌、干燥后，再加入鹽酸乙醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)沉淀、干燥后得季銨化殼聚糖粗品；上述季銨化殼聚糖粗品溶于水中，采用截留分子量為100?500D透析袋中透析48h，去除小分子雜質(zhì)，透析液冷凍干燥，制得季銨化殼聚糖。10.權(quán)利要求1或2所述的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物在制備伴隨新生血管生成疾病的治療藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用;優(yōu)選的，所述伴隨新生血管生成疾病包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑病變或關(guān)節(jié)炎。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物，由ES-2肽分子上的羧基與季銨化殼寡糖分子的氨基通過酰胺鍵結(jié)合，結(jié)構(gòu)式為：(ES-2)n-CO-NH-O-HTCC；式中，n＝1～10；ES-2的分子量為1223Da，等電點(diǎn)為10.42；O-HTCC的分子量為1000Da以上，自由氨基摩爾含量為不小于20％。本發(fā)明還公開了ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物的制備方法。本發(fā)明的ES-2肽的季銨化殼寡糖修飾物與ES-2相比，保留了ES-2分子抗新生血管生成活性和抗腫瘤活性，整合了O-HTCC的良好特性，使其具有穩(wěn)定性高、半衰期長、細(xì)胞親和性強(qiáng)、靶向性強(qiáng)等的特性；與TMC相比，O-HTCC修飾ES-2的效率更高，因此具有更好的使用效果和應(yīng)用范圍。
【IPC分類】A61P35/00, C07K14/78, A61P9/10, A61K47/48, A61P19/02, A61K38/39, C07K1/107, A61P27/02
【公開號(hào)】CN105669857
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610144349
【發(fā)明人】譚海寧, 王娟, 張叢叢, 劉純慧, 于洋, 孫鳳
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日