一種基因重組長(zhǎng)效人促腎上腺皮質(zhì)激素及其制備方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種基因重組長(zhǎng)效人促腎上腺皮質(zhì)激素及其制備方法 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明采用基因工程、分子生物學(xué)等方法，制備出保留了人促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH)促進(jìn)糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的作用并且在血液中不易被代謝的基因重組長(zhǎng)效ACTH。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液當(dāng)中存在多種降解蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，天然存在的野生型人ACTH的體內(nèi)半衰期很 短，只有約15分鐘。ACTH在血液中的降解主要是由血液中的蛋白酶引起的，我們?cè)诜治鯝CTH 結(jié)構(gòu)當(dāng)中的血液蛋白酶降解位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了野生型W及定點(diǎn)突變的多種ACTH- 祀T30a原核表達(dá)質(zhì)粒，從中篩選出不易被蛋白酶降解的ACTH點(diǎn)突變體。ACTH是一種多膚，分 子量只有4.化D，在工程菌中不易單獨(dú)表達(dá)純化;所W我們?cè)贏CTH cDNA的5 '端連接一段編 碼6個(gè)組氨酸的組氨酸標(biāo)簽化is化g)W及一段多膚連接物（簡(jiǎn)稱(chēng)Linker,核巧酸序列共計(jì) 144bp，表達(dá)5.3kD的多膚）的核巧酸序列，表達(dá)的融合蛋白不但可W抑制發(fā)酵階段降解，同 時(shí)提高ACTH在裂解液中的溶解度，還可W用Μ柱初步純化帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白。為了在 多膚表達(dá)W后去除組氨酸標(biāo)簽，我們?cè)诨痵Tag-Linker與ACTH序列之間加入一段腸激酶 化K)底物"天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一賴(lài)氨酸化DDDK)"的編碼核巧酸序 列（簡(jiǎn)稱(chēng)邸St)。運(yùn)樣得到的融合序列簡(jiǎn)稱(chēng)為巧isTag-Linker-EKst-ACTH(融合核巧酸序列 共計(jì)28化P，表達(dá)的融合蛋白約10.6kD)"。因?yàn)槟c激酶的切割位點(diǎn)恰好在D孤DK氨基酸序列 之后，工程菌中表達(dá)出來(lái)的帶有組氨酸標(biāo)簽的ACTH融合蛋白在基因重組腸激酶 (recombinant EK)的作用下可W去除全部的化sTag-Linker膚鏈和孤孤K序列，得到不帶有 多余氨基酸殘基的ACTH多膚。
[0003] 采用柱層析方法分離純化出野生型W及各種點(diǎn)突變的ACTH多膚W后，通過(guò)動(dòng)物體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)W及小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，篩選出保留ACTH促進(jìn)糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生作用 并且在血液中不易被代謝的基因重組長(zhǎng)效人ACTH。經(jīng)過(guò)與野生型人ACTH對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)： ACTH的第5位谷氨酸突變?yōu)樘於彼峄?D)不但可W保留天然ACTH的生物學(xué)活性，而且在血 液中比野生型更加穩(wěn)定，可W作為長(zhǎng)效ACTH應(yīng)用。
[0004] 本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)描述一種保留了天然ACTH促進(jìn)糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生作用的在血液中不 易被代謝的突變型ACTH化抓)及其制備工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 1.發(fā)明的目的
[0006] 制備高純度的、保留了天然ACTH促進(jìn)糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的生物活性的、在血液中不 易被降解的基因重組長(zhǎng)效人促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH)。
[0007] 2.發(fā)明的技術(shù)方案 [000引見(jiàn)附圖1。
[0009] 3.發(fā)明的有益效果
[0010] 本發(fā)明所制備的基因重組長(zhǎng)效人ACTH，因其不但具備天然野生型ACTH的生物學(xué)活 性而且在血液中降解較慢，所W可W降低患者接受ACTH注射給藥的劑量和次數(shù)，降低成本。
[0011] 另外，醫(yī)藥市場(chǎng)上現(xiàn)有流通的ACTH是從豬的腦垂體中提取，可能攜帶動(dòng)物病毒。本 發(fā)明所采用的基因工程制備方法，不但可W獲得高純度的基因重組長(zhǎng)效人ACTH，并且在制 備過(guò)程當(dāng)中不使用動(dòng)物材料，所W基本上消除了傳播動(dòng)物病毒的隱患。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 1 .ACTH突變體的設(shè)計(jì)、原核表達(dá)體系構(gòu)建W及及表達(dá)純化 [001引 1. 1ACTH突變體的設(shè)計(jì)
[0014] ACTH的活性區(qū)域是氨基(N)端的1-24膚段，簇基末端的第25-39膚段即使被去除或 代謝掉依然具有活性，所W我們針對(duì)ACTH的1-24膚段設(shè)計(jì)點(diǎn)突變位點(diǎn)，不但要使其不易被 血液中的蛋白酶降解，還要保留ACTH的活性。我們利用化tDB蛋白酶數(shù)據(jù)庫(kù)分析了人ACTH中 可能的酶切位點(diǎn)（見(jiàn)表1)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了多種氨基酸點(diǎn)突變ACTH多膚，包括本發(fā)明專(zhuān)利 所描述的第5位谷氨酸突變?yōu)樘於彼岬腁CTH化5D)。（參見(jiàn)"說(shuō)明書(shū)核巧酸和氨基酸序列 表"）
[001引表1 .ACT腫的血液蛋白酶切割位點(diǎn)
[0016] 1.2ACTH原核表達(dá)體系的構(gòu)建及其表達(dá)純化
[0017]我巧達(dá)了野生型(WT)ACTH、ACT肥4(具有活性的氨基末端1-24膚段似及人工設(shè) 計(jì)的ACTH化加），后者與野生型僅相差1個(gè)氨基酸，采用同樣的表達(dá)和分離純化方法進(jìn)行制 備，具體如下：
[001引 1.2.1構(gòu)建表達(dá)載體
[0019] 一方面，用Bam化、Sail雙酶切攜帶組氨酸標(biāo)簽化is化g)的祀T30a空白質(zhì)粒；另一 方面WACTH為模版，設(shè)計(jì)分別包含上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)W及邸St核巧酸序列的引物，PCR擴(kuò)增 出結(jié)構(gòu)為"BamHl酶切位點(diǎn)-EKst-ACTH-Sal 1酶切位點(diǎn)"的融合片段，然后用BamHl、Sal 1雙酶 切。用T4連接酶將切得片段邸st-ACTH連接到前述切開(kāi)的pET30a質(zhì)粒上，構(gòu)建出化sTag- Linker-EKst-ACTH-祀T30A質(zhì)粒（其中的Linker是HisTag與ACTH之間的連接序列，核巧酸序 列長(zhǎng)度為123bp，表達(dá)出的Linker膚鏈包含41個(gè)氨基酸）dACTH化加)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，是W 構(gòu)建好的ACTH(WT)質(zhì)粒為模板，利用引入突變位點(diǎn)的引物，用重疊 PCR的方法擴(kuò)增出E5D突 變目的片段，再按照前述方法將其連接到pET30a載體上。構(gòu)建好的化sTag-Linker-邸st- ACTH-祀T30A全質(zhì)粒環(huán)形示意譜圖如附圖2a所示；BamHl及Sail雙酶切鑒定結(jié)果參見(jiàn)附圖 2b。構(gòu)建好的ACTH(WT)及ACTH化5D)的測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)附圖3及附圖4。在上述實(shí)驗(yàn)中所用到的 擴(kuò)增引物如表2所示。
[0020] 表2.PCR擴(kuò)增引物表
[0021] 1.2.2誘導(dǎo)表達(dá)
[0022] 將構(gòu)建好的載體采用熱轉(zhuǎn)化的方法(42°C，45秒）導(dǎo)入化21-DE3工程菌株。37°C恢 復(fù)比后接種到LB培養(yǎng)板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆菌落，接種到250mL LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D值為0.4~0.6之間時(shí)，加入ImM的IPTG，并將溫度降至25°C誘導(dǎo)表達(dá)化。
[0023] 1.2.3菌體破碎
[0024] 菌液在10000rpm，4°C下離屯、15min，棄去上清，加入菌體漂洗液（lOmM Tris-HCl， lOmM抓ΤΑ, lOOmM化Cl)洗涂Ξ次。按照每克濕菌加10ml裂解液的比例，加入菌體裂解液 (50mM Tris-Cl，300mM NaCiaOmM咪挫，ImM PMSF'pH 8.0)。
[00巧]因?yàn)镹末端的化sTag-Linker提高了 ACTH的溶解度，表達(dá)的ACTH主要存在于裂解液 的上清液當(dāng)中，所W1200化pm離屯、15min后，棄去包涵體沉淀，保留上清液用于下一步分離。
[0026] 1.2.4分離純化
[0027] 1.2.4.1M 柱純化
[0028] Μ柱用2倍柱體積20%乙醇清洗，再用2倍柱體積去離子水沖洗。更換流動(dòng)相為平 衡緩沖液(50mM化is-HCl、300mM化ClUOmM咪挫，pH 8.0)，平衡5個(gè)柱體積。加樣后，更換 流動(dòng)相為漂洗液巧OmM化is-Cl、300mM化Cl、30mM咪挫，pH 8.0)，漂洗20個(gè)柱體積。更換流 動(dòng)相為洗脫液巧OmM Tris-Cl、300Mm化Cl、250mM咪挫，pH 8.0)，棄去最初3血洗脫液后，收 集洗脫組分，每管ImL，收集10管，洗脫組分當(dāng)中的ACTH融合蛋白條帶如附圖5所示。
[00 巧]1.2.4.2 脫鹽
[0030] lOmL合并后的洗脫組分在1倍柱體積的腸激酶切緩沖液（20mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2，pH 6.0)中透析平衡。
[0031] 1.2.4.3腸激酶酶切
[0032] 向透析過(guò)的樣品中加入基因重組腸激酶(每0.5mg目的蛋白加入1U腸激酶），37°C， 在腸激酶酶切緩沖液中（20mM Tris-Cl，50mM化Cl，2mM CaC12，pH 6.0)切割16h，切得的 ACTH經(jīng)Western-Blot鑒定，如附圖6所示。
[0033] 1.2.4.4 超濾濃縮
[0034] 10血樣品用分子量截留為3kD的超濾管(Amicon叫tra-15 3K)在25°C，4000g離屯、 30min，濃縮后樣品體積約60化L。
[0035] (注:此步驟的替代方法是將樣品在聚乙二醇溶液中透析，可用于工藝放大。）
[0036] 1.2.4.5CM弱陽(yáng)離子柱層析純化
[0037] CM-cellulose(Sigma-Al化ich)離子交換層析柱(40 X 1cm)，用5個(gè)柱體積的抑3.5 的0.05M醋酸-醋酸鋼平衡緩沖液沖洗CM-cellulose層析柱(Sigma-Al化ich)，控制流速為 Iml/min。
[0038] 濃縮后的樣品用平衡緩沖液稀釋到1ml，用0.4微米濾膜過(guò)濾后加樣，控制流速為 Iml/min，1.5個(gè)柱體積后用抑6.0的0.5M醋酸-醋酸鋼緩沖液洗脫，控制流速I(mǎi)ml/min。待流 過(guò)22