F快速標(biāo)記Cys-Annexin V的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于陽Τ顯像領(lǐng)域，具體設(shè)及一種1中快速標(biāo)記切S-Annexin V的方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞調(diào)亡(Apoptosis)又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death,PCD)，是不 同于壞死和意外死亡的、由基因調(diào)控的細(xì)胞主動性死亡過程。作為細(xì)胞生命周期中的重要 組成部分，細(xì)胞調(diào)亡的過程中伴隨著一系列的生物分子及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。其中，細(xì)胞膜 脂質(zhì)雙層中的憐脂酷絲氨酸(PS)由細(xì)胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)至外層，進(jìn)而暴露于細(xì)胞表面，是細(xì)胞 調(diào)亡早期事件，發(fā)生在調(diào)亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變之前，也是調(diào)亡級聯(lián)反應(yīng)的初始事件。的外 翻作為調(diào)亡細(xì)胞被吞隧細(xì)胞識別的標(biāo)志，將會進(jìn)一步引起胞漿的皺縮、染色質(zhì)的濃集及核 內(nèi)DNA降解等現(xiàn)象。因此，外翻的PS作為調(diào)亡檢測的祀點(diǎn)，具有較高的時效性，可早期檢測細(xì) 胞調(diào)亡。目前，在利用檢測外翻的PS來獲知細(xì)胞調(diào)亡情況的技術(shù)中，正電子斷層顯像 (positron emission tomogra地y，陽T)是常用的技術(shù)手段之一，其主要是利用iiC、i3N、i5〇 或1中等放射性核素標(biāo)記的、可與PS特異性結(jié)合的物質(zhì)作為顯像劑，通過顯像劑在代謝中聚 集與分布的呈像，來獲知細(xì)胞調(diào)亡的情況，從而達(dá)到診斷的目的。
[0003] 在可與PS特異性結(jié)合的物質(zhì)中，WAnnexin V作為PET顯像劑的相關(guān)技術(shù)具有良好 的應(yīng)用前景。Annexin V(膜聯(lián)蛋白V，又稱Annexin A5和AnxA5)是一種人體內(nèi)源性蛋白，屬 于化依賴性憐脂結(jié)合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80個氨基酸重復(fù)單元，分子量 約為35kD。研究表明，Annexin V與PS特異性結(jié)合的親和力高達(dá)l(T9mol/L，其在被放射性核 素標(biāo)記、進(jìn)而作為PET顯像劑進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞調(diào)亡的顯像時，可實時監(jiān)測體內(nèi)調(diào)亡的發(fā)生并且 可實現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡的活體無創(chuàng)顯像，因此，已成為監(jiān)測活體細(xì)胞調(diào)亡領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在對 Annexin V進(jìn)行正電子核素標(biāo)記的技術(shù)中，1^1中標(biāo)記Annexin V的"F-SFB-AnnexinV最為常 見。但是，由于"F-SFB-Annexin V是通過功能基團(tuán)（"F-SFB)連接Annexin V中賴氨酸殘基 上的氨基，進(jìn)而標(biāo)記上放射性核素的，而一分子的Annexin V蛋白中含有21個賴氨酸殘基， 因此，isF-SFB標(biāo)記在Annexin V上的位置是不確定的，甚至標(biāo)記上的個數(shù)也不確定。另外， Annexin V中的一些賴氨酸殘基處在Annexin V與PS結(jié)合的活性區(qū)域附近，i8F-SFB與該處的 賴氨酸殘基連接則會影響Annexin V與PS的親和性。運(yùn)些均會導(dǎo)致1中-SFB-Annexin V在細(xì) 胞調(diào)亡顯像時特異性較低。
[0004] 為實現(xiàn)對Annexin V的定位標(biāo)記，且不影響Annexin V與PS的親和性，進(jìn)而提高 Annexin V調(diào)亡顯像的特異性，現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)了對Annexin V進(jìn)行修飾，研究新的Annexin V蛋白變體的相關(guān)技術(shù)。例如，2008年Li，Xuehe等用isF-FBABM對N端接一個半脫氨酸的 Annexin V蛋白進(jìn)行標(biāo)記，研究結(jié)果顯示，Annexin V經(jīng)上述修飾后不影響其與PS結(jié)合的親 和力，但是"F-FBABM與蛋白的標(biāo)記率比較低，僅為37 %，無法實現(xiàn)更為高效標(biāo)記。
[0005] 為解決上述問題，中國專利文獻(xiàn)CN104193820A中公開了一種1中標(biāo)記切S-Annexin V的方法及其應(yīng)用，其中采用1中定位標(biāo)記的輔助基團(tuán)是N-[2-(4-[i8F]氣苯甲酯氨基）乙基] 馬來酷亞胺(i8F-F肥Μ)標(biāo)記切s-Annexin V，然而isF-FBEM合成步驟復(fù)雜，合成時間長達(dá)2小 時左右，而且由于標(biāo)記的輔助基團(tuán)1SF-F邸Μ的脂溶性大，導(dǎo)致其不易溶于蛋白溶液中，不利 于該標(biāo)記輔基與蛋白溶液中的切s-Annexin V進(jìn)行反應(yīng)，影響切s-Annexin V的標(biāo)記，使得 所述Cys-Annexin V的標(biāo)記率低，標(biāo)記所用時間長，效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的1中定位標(biāo)記切S-Annexin V的標(biāo)記率低，標(biāo)記時間長，效率低的缺陷，從而提供一種標(biāo)記率高、標(biāo)記時間短、效率高的 1申快速標(biāo)記切s-Annexin V的方法與應(yīng)用。
[0007] 為此，本發(fā)明提供了一種"F快速標(biāo)記切S-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide標(biāo)記Cys-Annexin V。
[000引所述的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的緩沖溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均勻，于80-100°C下加熱5-20min，即得含有所述i8F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后進(jìn) 行純化，備用；
[0010] (2)取步驟（1)中純化后的所述"F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys- Annexin V的緩沖溶液中，混合均勻得到反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液置于35-37Γ下水浴反應(yīng)至 生成具有如i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記產(chǎn)物。
[0011] 所述"F-A1-N0TA-切s-Annexin V也可W表示為"F-A1F-N0TA-切s-Annexin V。 [0012]優(yōu)選的，所述的方法，包括如下步驟：
[OOU] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的緩沖溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均勻，于90°C下加熱lOmin，即得含有所述標(biāo)記前體i8F-Al-N0TA-Maleimide的溶液，然后 進(jìn)行純化，備用；
[0014] (2)取步驟（1)中純化后的所述1 8F-A 1 -NOTA-Ma 1 e imi de溶液，加入到含Cy S - Annexin V的緩沖溶液中，混合均勻得到反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液置于36°C下水浴反應(yīng)20- 40min，即得如"F-A1-N0TA-切s-Annexin V所示結(jié)構(gòu)的所述標(biāo)記產(chǎn)物。
[0015] 所述步驟（1)中，將制備的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制備型HPLC法進(jìn) 行純化，色譜條件為：制備型反相C18柱，W含質(zhì)量濃度為0.05%-0.3%Ξ氣乙酸和質(zhì)量濃 度為5 % -20 %的乙臘溶液為流動相進(jìn)行洗脫，流速為1.5-5血/min，檢測波長為210-230皿， 收集出峰時間為8-13min下流出的組分，即為純化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，還包括將制備的所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制 備型HPLC法純化的步驟，色譜條件為:制備型反相C18柱，W含質(zhì)量濃度為0.1%Ξ氣乙酸的 質(zhì)量濃度為10 %的乙臘溶液為流動相進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min，檢測波長為220nm，收集出 峰時間為12.34min下流出的組分，即為純化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0017] 所述的方法，所述步驟(1)中，加入的所述含1中的溶液、所述含有A1C13的緩沖溶液 和所述NOTA-Maleimide溶液的體積比例為1:1:1，其中所述NOTA-Maleimide的濃度為3- lOmg/mL，所述含有A1C13的緩沖溶液中A1C13的濃度為5-15mg/mL。
[001引所述的方法，所述步驟（2)中，所述1咕-41-^了4-]\1曰16；[1111(16溶液與所述〔73- Annexin V溶液的體積比為1:1-10，所述切s-Annexin V的濃度為0.2-20mg/mL，所述"F-A；L- NOTA-Ma 1 e imi de溶液的放射性活度為1 -1 OOOMBq/mL。
[0019]優(yōu)選的，所述含有A1C13的緩沖溶液中A1C13的濃度為lOmg/mL所述NOTA- Maleimide的濃度為7mg/ni;所述Cys-Annexin V的濃度為lOmg/mL。
[0020] 優(yōu)選的，所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液的放射性活度為500MBq/mL。
[0021] 所述的方法，所述含有AICI3的緩沖溶液為醋酸鹽緩沖液、憐酸鹽緩沖液或巧樣酸 鹽緩沖液中的一種或幾種的混合液;所述含切s-Annexin V的緩沖溶液為水、醋酸鹽緩沖 液、憐酸鹽緩沖液或巧樣酸鹽緩沖液中的任意一種或幾種的混合液；所述含N0TA- maleimide的溶液為乙臘、乙醇或水。所述含A1C13的緩沖溶液抑值為3-5,抑值優(yōu)選為4。所 述含Cys-Annexin V的緩沖溶液抑值為6-8，pH值優(yōu)選為7。
[0022] 優(yōu)選的，所述含有A1C13的緩沖溶液為乙酸鋼-乙酸緩沖液，濃度為0.2-0.5mol/L， pH值在3-5范圍內(nèi)。
[0023] 所述NOTA-maleimide的中文名稱為馬來酷亞胺基乙基酷胺單1，4,7-Ξ氮雜環(huán)壬 燒-1，4,7-Ξ乙酸。
[0024] 所述的方法，還包括采用緩沖液調(diào)節(jié)混合均勻的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide和含 切s-Annexin V的溶液的混合液即反應(yīng)液的抑值至5-9的步驟。優(yōu)選的，所述緩沖液為憐酸 鹽緩沖液或巧樣酸鹽緩沖液中的一種或兩種的混合液。
[0025] 本發(fā)明提供了一種由上述的方法制備得到的標(biāo)記產(chǎn)物i8F-A^N0TA-切s-Annexin V。
[0026] 本發(fā)明提供了一種所述的iSp-Al-NOTA-切s-Annexin V在制備陽T顯像劑中的應(yīng)用
[0027] 本發(fā)明還提供了一種陽T顯像劑，包括標(biāo)記產(chǎn)物"F-A1-N0TA-切s-Annexin V。
[0028] 本發(fā)明技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[00巧](1)本發(fā)明所述的"F快速標(biāo)記Cys-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide標(biāo)記切s-Annexin V，首先，Annexin V的Ξ維結(jié)構(gòu)顯示，其N-端和C-端都位于分 子膜結(jié)合點(diǎn)的對面，在重組過程中對Annexin V的兩端進(jìn)行修飾并不影響重組蛋白在 Escherichia colli的表達(dá)或折疊，也不改變其與膜PS結(jié)合的親合性，因此，在Annexin V的 C-末端添加1個半脫氨酸得到的切s-Annexin V，其與PS結(jié)合的親合性并未受到影響，與此 同時，經(jīng)過修飾得到的切s-Annexin V可與所述標(biāo)記前體1中-4^側(cè)了4-]\1曰16；[1]11(16的基團(tuán)實 現(xiàn)高選擇性的連接，Cys-Annexin V的C端的游離琉基與所述標(biāo)記前體"F-Al-NOTA- Maleimide上的雙鍵發(fā)生特異性連接，可較好的保證正電子顯像核素1中的定位標(biāo)記，避免了 標(biāo)記位置、標(biāo)記數(shù)量的不確定帶來的顯像特異性低的問題，同時顯著提高了標(biāo)記率，大大縮 短了標(biāo)記時間，提高了標(biāo)記效率，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的正電子顯像核素1中定位標(biāo)記Cys- Annexin V的標(biāo)記率低，標(biāo)記時間長，效率低的問題；
[0030] 雖然現(xiàn)有技術(shù)中i8F-F邸M-切s-Annexin ￥，1中斗邸1也是定位標(biāo)記切3-4]1]1糾;[]1￥ 半脫氨酸上游離的琉基，但是從"F離子到isF-FBEM-切s-Annexin V的標(biāo)記時間大約120分 鐘，而本發(fā)明從1中離子到i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V的標(biāo)記時間約為60分鐘，與現(xiàn)有技術(shù) 相比，本發(fā)明的標(biāo)記時間大大縮短，操作