所述疏水作用溶液是丁基疏水作用色譜溶液洗出液。
[0038] 在某些實(shí)施方案中，所描述的大規(guī)模工藝還可包括通過(guò)所述疏水作用溶液的超濾 而制備含有至少一種生物活性分子的溶液的步驟。此外，可以進(jìn)行通過(guò)所述生物活性分子 的溶液的無(wú)菌過(guò)濾而制備生物活性分子的無(wú)菌溶液的步驟。
[0039] 在某些實(shí)施方案中，所述大規(guī)模工藝包括保持步驟，所述保持步驟需要將分散體 保持一段時(shí)間以使被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與碎片分離并然后通過(guò)至少一個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾被 中和的溶胞產(chǎn)物溶液。
[0040] 在某些實(shí)施方案中，所述進(jìn)行離子交換分離步驟是使用陰離子交換膜而進(jìn)行的。 優(yōu)選地，離子交換分離步驟包括離子交換柱的使用，并優(yōu)選地使用Mustang K> Q柱。
[0041] 在某些實(shí)施方案中，所述大規(guī)模工藝包括連續(xù)過(guò)程或被稱(chēng)為連續(xù)大規(guī)模工藝，其 用于從細(xì)菌細(xì)胞制備高純度生物活性分子。所述方法包括從大規(guī)模工藝的一個(gè)步驟向隨后 的步驟基本上連續(xù)地過(guò)渡，并且包括通過(guò)在容器中收集溶胞產(chǎn)物并使分散體通過(guò)初級(jí)過(guò)濾 器而使分散體中的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液與碎片分離以產(chǎn)生最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn) 物溶液。在某些實(shí)施方案中，所述工藝還包括使最初的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液通過(guò)二 級(jí)過(guò)濾器以產(chǎn)生隨后的粗的被中和的溶胞產(chǎn)物溶液。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于從細(xì)菌細(xì)胞制備感興趣的生物活性分子的高 純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟:使細(xì)菌細(xì)胞以細(xì)胞分散體與溶胞溶液接觸以形 成溶胞產(chǎn)物溶液;通過(guò)用泡罩塔混合器將中和溶液混入所述溶胞產(chǎn)物溶液而中和所述溶胞 產(chǎn)物溶液以形成被中和的混合物;通過(guò)初級(jí)過(guò)濾器和二級(jí)過(guò)濾器過(guò)濾所述被中和的混合物 以形成濾過(guò)的溶液;使所述濾過(guò)的溶液通過(guò)離子交換柱以形成離子交換溶液;使所述離子 交換溶液通過(guò)疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液;和超濾所述疏水作用溶液以 形成感興趣的生物活性分子的高純度樣品；其中在從接觸步驟到使濾過(guò)的溶液通過(guò)的步驟 的大規(guī)模工藝中的一個(gè)步驟向隨后的步驟的每次過(guò)渡基本上連續(xù)發(fā)生。
[0043] 在本發(fā)明的另一方面中提供了包含由本文所述的大規(guī)模工藝制備的感興趣的生 物活性分子的組合物，其中所述感興趣的生物活性分子是DNA質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中，所 述組合物包含在溶液中的約l〇mg或更多量的DNA質(zhì)粒，其中高純度的所述質(zhì)粒是以大于約 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存在的質(zhì)粒。權(quán)利要求 18所述的 組合物，其中所述質(zhì)粒的濃度為約5、6、7、8、9、10、11、12或1311^/111匕某些組合物包含超螺 旋質(zhì)粒水平大于約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94% 或 95% 并且優(yōu)選地大于 80% 的質(zhì)粒。某 些組合物包含小于或等于約10EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒，并且某些實(shí)施方案，所述組合物包含小 于或等于約1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。某些實(shí)施方案小于或等于約0.1EU內(nèi)毒素每mg質(zhì)粒。在某 些實(shí)施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1.0%RNA或小于或等于約0.4%RNA的溶 液。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1.0%蛋白、優(yōu)選小于或 等于約0.20%蛋白的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含含有小于或等于約1%基因 組DNA、優(yōu)選地小于或等于約0.01 %基因組DNA的溶液。
[0044]包括許多本文提供的工藝步驟的本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)例包括以下步驟:第一步， 制備并收獲感興趣的細(xì)胞;第二步，溶解細(xì)胞以將其內(nèi)容物(包括感興趣的生物活性分子） 釋放至溶液;第三步，將固體細(xì)胞碎片和沉淀的細(xì)胞成分與含有至少一種感興趣的生物活 性分子的流體分離;第四步，使含有感興趣的生物活性分子的溶液經(jīng)過(guò)離子交換色譜;第五 步，使由離子交換色譜產(chǎn)生的部分純化的物質(zhì)經(jīng)過(guò)疏水作用色譜;第六步，使由疏水作用色 譜產(chǎn)生的物質(zhì)經(jīng)過(guò)超濾和滲濾以濃縮至少一種類(lèi)型的感興趣的生物活性分子并從溶液中 除去過(guò)量的鹽；第七步，使?jié)饪s并脫鹽的產(chǎn)物可選擇地經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾以使其適于藥用，包 括，例如，肌肉內(nèi)遞送、靜脈內(nèi)遞送、鼻內(nèi)遞送、心臟內(nèi)遞送、氣溶膠遞送、經(jīng)皮遞送、體內(nèi)電 穿孔促進(jìn)的向肌肉的遞送、體內(nèi)電穿孔促進(jìn)的向皮下組織或皮內(nèi)組織的遞送以及其他已知 的藥物施用的方法。
[0045]本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括本文公開(kāi)的工藝步驟，所述工藝步驟包括但不限于以 導(dǎo)致不受工藝保持步驟限制的生產(chǎn)規(guī)模的連續(xù)方式操作步驟組合。這樣的工藝使醫(yī)藥級(jí)生 物分子能夠大規(guī)模制備，例如制備約1克或更多的質(zhì)粒。本發(fā)明的某些實(shí)施方案排除了可證 明對(duì)大規(guī)模制備或藥物產(chǎn)品是有害的任何物質(zhì)或過(guò)程，包括，例如，酶的包含、熱變性、機(jī)械 分離(做這樣的分離的機(jī)器），諸如離心設(shè)備，或諸如異丙醇的有機(jī)溶劑或揮發(fā)性溶劑。
[0046] 感興趣的細(xì)胞可以通過(guò)例如常規(guī)的發(fā)酵和收集方式而制備或收獲。制備足量的感 興趣的細(xì)胞完全是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)的。例如，細(xì)胞可以是含有高拷貝數(shù)的感興 趣的質(zhì)粒的大腸桿菌，并且可以使用分批或補(bǔ)料分批技術(shù)將含質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)酵至高密度。 用于制備這樣的含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞的方法和進(jìn)行這樣的分批或補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法 是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。細(xì)胞可以通過(guò)諸如離心或過(guò)濾的常規(guī)方式收獲以形成細(xì)胞 糊。這樣的收獲方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，收 獲的細(xì)胞或細(xì)胞糊可以立即處理，或者以冷凍狀態(tài)或冷藏狀態(tài)貯存用于以后處理。
[0047] 可使用溶胞溶液將收獲的細(xì)胞溶解以將其內(nèi)容物(包括感興趣的生物活性分子） 釋放至溶液。
[0048] 通常，在溶解細(xì)胞前，細(xì)胞糊可用于制備含有感興趣的生物活性分子的細(xì)胞懸浮 液。細(xì)胞可懸浮于任何合適的溶液中。在懸浮溶液中含有細(xì)胞的懸浮液可保持在罐中或其 他貯存容器中?？墒褂脙蓚€(gè)容器，其中第二容器可用于再懸浮額外量的細(xì)胞，而第一容器用 于溶胞過(guò)程。在某些實(shí)施方案中，所述懸浮溶液可包含中等濃度的緩沖液、中等濃度的螯合 劑或兩者。在某些實(shí)施方案中，所述懸浮溶液可包含約25mM Tris-鹽酸鹽（"Tris-HCl"）和 約10mM乙二胺四乙酸二鈉（"Na2EDTA"），pH約為8。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞懸浮液可通 過(guò)將已知重量的細(xì)胞糊懸浮于已知重量的懸浮緩沖液中而制備。例如，1份細(xì)胞糊可再懸浮 于約4-10份緩沖液中，在某些實(shí)施方案中，使用約6-8份緩沖液。在某些實(shí)施方案中，所得細(xì) 胞懸浮液的光密度可以是約50-800D6QO單位。在某些實(shí)施方案中，其可以是約60-70OD 6q0單 位。
[0049] 溶胞溶液優(yōu)選地包含一種或多種溶胞劑（lysis agent)，例如堿、酸、酶、有機(jī)溶 劑、洗滌劑或其混合物。然而，動(dòng)物衍生酶或有機(jī)溶劑的使用不是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儗?duì)藥物 產(chǎn)品的制備是有害的。在某些實(shí)施方案中，溶胞溶液包含堿、洗滌劑或其混合物。合適的堿 包括，但不限于，氫氧化鈉或氫氧化鉀。洗滌劑可以是非離子的、陽(yáng)離子的或陰離子的。合適 的洗滌劑包括，但不限于十二烷基硫酸鈉（"SDS"）、三硝基甲苯(Triton)、吐溫或聚氧丙烯 型試劑(基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物）。對(duì)合適的堿或洗滌劑的選擇完全在本領(lǐng) 域的普通技術(shù)范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，溶胞溶液可包含氫氧化鈉（"NaOH"）和SDS。在某 些實(shí)施方案中，NaOH的濃度可以是約0.1N至約0.3N，并且在某些實(shí)施方案中是約0.2N。在某 些實(shí)施方案中，SDS的濃度可以是約0.1 %至約5%，并且在某些實(shí)施方案中，是約1 %。在某 些實(shí)施方案中，溶胞溶液可以保持在罐中或其他貯存容器中。
[0050]可以合并細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液以溶解細(xì)胞并產(chǎn)生溶胞產(chǎn)物溶液。在某些實(shí)施方 案中，它們被合并、混合并保持為混合物，持續(xù)足以促進(jìn)高水平的細(xì)胞溶解并釋放生物物質(zhì) 的時(shí)間，從而形成溶胞產(chǎn)物溶液。
[0051 ]在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液被保持在分離的罐中并使用一個(gè)或多 個(gè)栗從這樣的罐中取出。可使用?'形連接器使細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液互相接觸。在某些實(shí) 施方案中，等體積的細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液可以使用雙頭栗以相等的流速被栗送。然而，本 領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，如果需要，不同體積的細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液可以使用單獨(dú)的栗 以不同的速率被栗送。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液通過(guò)雙頭栗以約〇. 3L/ min至約2L/min同時(shí)被栗送，并且接觸過(guò)的流體以約0.6L/min至約4L/min的速率離開(kāi)?'形 連接器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些流速可容易地增加或減少，并且管道尺寸可容易地 增加或減少，以滿足任何處理量需求。在離開(kāi)?'形連接器以后，接觸過(guò)的細(xì)胞懸浮液和溶 胞溶液可通過(guò)高剪切的串聯(lián)混合器。該混合器可以是以流通模式(與分批模式相對(duì))提供快 速、高剪切混合的任何設(shè)備。在某些實(shí)施方案中，該混合器是轉(zhuǎn)子/定子混合器或乳化器。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多種這樣的高剪切串聯(lián)混合器是商業(yè)可得的。任何這樣的混合器 的使用完全在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，該混合器是配備標(biāo)準(zhǔn)乳化器篩網(wǎng) (standard Emulsor screen) (Silverson Machines，Inc .East Longmeadow，MA)和串耳關(guān)組 件的Si Iverson L4R轉(zhuǎn)子/定子混合器。轉(zhuǎn)子可以諸如以下的速率運(yùn)轉(zhuǎn)：從約500rpm至約 900rpm、500-600rpm、從約500rpm至約700rpm、從約500rpm 至約800rpm、從約600rpm至約 700rpm、從約600rpm至約800rpm、從約600rpm至約900rpm、從約700rpm至約800rpm或從約 700rpm至約900rpm。這樣的混合器適于處理從約0.3L/min至約2L/min的細(xì)胞懸浮液。然而， 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以替換更大規(guī)模的混合器用于處理明顯更大體積的細(xì)胞懸浮 液。這樣的替換將由本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅用普通試驗(yàn)而容易地實(shí)現(xiàn)。使用高剪切的串聯(lián)混 合器促進(jìn)了細(xì)胞懸浮液和溶胞溶液的完全的且快速的混合，使細(xì)胞與溶胞劑緊密接觸以獲 得有效的溶胞。此外，混合器能夠容易地適應(yīng)不同的流體流速并提供用于不同流速的變速 混合的靈活性。離開(kāi)高剪切的串聯(lián)混合器的物質(zhì)然后可通過(guò)保持盤(pán)管。該盤(pán)管可簡(jiǎn)單地包 括長(zhǎng)度足以提供流體以確定的時(shí)間通過(guò)該盤(pán)管的管道。該盤(pán)管的功能是提供細(xì)胞與溶胞劑 之間足夠的接觸時(shí)間以保證基本上完全的溶胞。同時(shí)，該盤(pán)管保證接觸時(shí)間不是太長(zhǎng)以至 于具有負(fù)面結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，例如細(xì)胞是含質(zhì)粒的細(xì)胞并且溶胞溶液包含堿的實(shí) 施方案，期望保證在堿中的暴露持續(xù)得足夠長(zhǎng)以獲得基本上完全的細(xì)胞溶胞以及蛋白、基 因組DNA和其他細(xì)胞成分基本上完全的變性。然而，還期望在堿中的暴露不太長(zhǎng)以至于導(dǎo)致 大量永久變性的質(zhì)粒。盤(pán)管可以是一個(gè)完整的管道或被分割為2-10個(gè)管道以允許流體流速 的靈活性。保持盤(pán)管使該接觸時(shí)間能夠被控制。在某些實(shí)施方案中，該接觸時(shí)間可以是從約 2分鐘至約10分鐘。在某些實(shí)施方案中，該接觸時(shí)間可以是從約2分鐘至約9分鐘、從約2分鐘 至約8分鐘、從約2分鐘至約7分鐘、從約2分鐘至約6分鐘、從約3分鐘至約10分鐘、從約3分鐘 至約9分鐘、從約3分鐘至約8分鐘、從約3分鐘至約7分鐘、從約3分鐘至約6分鐘、從約4分鐘 至約10分鐘、從約4分鐘至約9分鐘、從約4分鐘至約8分鐘、從約4分鐘至約7分鐘、從約4分鐘 至約6分鐘、從約5分鐘至約10分鐘、從約5分鐘至約9分鐘、從約5分鐘至約8分鐘、從約5分鐘 至約7分鐘或從約5分鐘至約6分鐘。優(yōu)選地，接觸時(shí)間是從約4分鐘至約8分鐘或從約4分鐘 至約6分鐘。在某些實(shí)施方案中，接觸時(shí)間是約5分鐘。在某些實(shí)施方案中，保持盤(pán)管的長(zhǎng)度 和直徑是這樣的：當(dāng)溶解的細(xì)胞以所期望的速率流過(guò)時(shí)獲得了所期望的暴露時(shí)間。在某些 實(shí)施方案中，保持盤(pán)管可以具有從約10英尺的長(zhǎng)度至約150英尺的長(zhǎng)度、從約25英尺的長(zhǎng)度 至約100英尺的長(zhǎng)度或從約40英尺的長(zhǎng)度至約60英尺的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，保持盤(pán) 管具有約50英尺的長(zhǎng)度，并且在某些實(shí)施方案中，保持盤(pán)管具有約100英尺的長(zhǎng)度。保持盤(pán) 管可具有從約0.5英寸至約2英寸的內(nèi)徑，并且在某些實(shí)施方案中為0.625英寸。還在某些實(shí) 施方案中，溶解的細(xì)胞可以以下的速率離開(kāi)高剪切的串聯(lián)混合器并通過(guò)保持盤(pán)管：從約 100mL/min至約 10L/min、從約 200mL/min至約 8L/min、從約 300mL/min至約6L/min、從約 400mL/min至約4L/min、從約400mL/min至約2L/min或從約600mL/min至約 1 · 2L/min。優(yōu)選 地，經(jīng)過(guò)保持盤(pán)管的速率是從約0.6L/min至約10L/min。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)保 持盤(pán)管的速率是約600mL/min并且在某些實(shí)施方案中，其為約1200mL/min。當(dāng)生物活性分子 的制備被放大時(shí)，盤(pán)管長(zhǎng)度和直徑的調(diào)整可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)以適應(yīng)或適合較大流 速。從保持盤(pán)管收集溶胞產(chǎn)物溶液。
[0052] 溶胞產(chǎn)物溶液通過(guò)將其與中和溶液(還稱(chēng)為中和沉淀溶液)合并而被中和，以制備 含有被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片的分散體。然后可保持所得分散體以促進(jìn)被中和的溶胞 產(chǎn)物溶液與碎片分離。
[0053] 在某些實(shí)施方案中，包含溶解的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物溶液可通過(guò)將其與中和溶液在中 和室中混合而被中和。溶胞產(chǎn)物溶液的這種中和可通過(guò)在中和室中混合而促進(jìn)。在某些實(shí) 施方案中，這種中和可在后面接著在泡罩塔混合器中泡罩混合(bubble mixing)。優(yōu)選地， 中和與泡罩混合在泡罩塔混合器中一起發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，離開(kāi)保持盤(pán)管的溶胞產(chǎn) 物溶液可進(jìn)入泡罩塔混合器中而同時(shí)，栗可將中和/沉淀溶液從另一個(gè)罐中遞送至泡罩塔 混合器中。在某些實(shí)例中，還同時(shí)地，來(lái)自另一個(gè)罐的壓縮氣體可鼓泡進(jìn)入泡罩塔混合器的 底部。在某些實(shí)施方案中，溶胞產(chǎn)物溶液可從一側(cè)進(jìn)入塔的底部，而中和/沉淀溶液可從相 對(duì)側(cè)進(jìn)入底部。壓縮氣體可經(jīng)過(guò)燒結(jié)的鼓泡器被鼓泡進(jìn)入，所述燒結(jié)的鼓泡器設(shè)計(jì)為基本 上均勻地沿塔的橫截面遞送氣泡。包含溶解的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物溶液和中和溶液垂直向上流 過(guò)塔并且經(jīng)過(guò)頂部附近的一側(cè)上的出料口離開(kāi)。經(jīng)過(guò)垂直的液體柱的氣泡通道用于混合溶 胞產(chǎn)物溶液和中和/沉淀溶液。由上升的氣泡提供的混合是完全但溫和和低剪切的。當(dāng)中 和/沉淀溶液與溶胞產(chǎn)物溶液的溶解的細(xì)胞混合時(shí)，細(xì)胞成分從溶液中沉淀。可在泡罩塔 混合器的頂部提供通氣管以排出過(guò)量的氣體。
[0054] 在某些實(shí)施方案中，溶胞產(chǎn)物溶液包含用堿、洗滌劑或其混合物溶解的含質(zhì)粒的 細(xì)胞，并且中和/沉淀溶液中和堿