包含高濃度的生物活性分子的組合物及其制備工藝的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年5月23日的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200880016945.5 "包含高濃度 的生物活性分子的組合物及其制備工藝"的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求于2007年5月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/939，792號(hào)的利益，其內(nèi) 容在此通過(guò)引用并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及包含高濃度的諸如質(zhì)粒的生物活性分子的大批組合物（bulk composition)以及制備這樣的組合物的工藝。
【背景技術(shù)】
[0005] 在細(xì)胞中產(chǎn)生并從細(xì)胞分離的生物活性分子存在許多用途。通過(guò)引用在此并入的 美國(guó)公布序列號(hào)20050014245公開(kāi)了用于生物材料制備的設(shè)備和方法。生物活性分子包括 蛋白和核酸分子。在活細(xì)胞中制備這樣的分子提供了相對(duì)可選擇的制備方法的許多優(yōu)勢(shì)， 但當(dāng)從細(xì)胞中提取生物活性分子時(shí)出現(xiàn)了分離和純化問(wèn)題。在細(xì)胞中存在多種組分，這阻 礙實(shí)現(xiàn)感興趣的生物活性分子的高產(chǎn)率，也表示可能的不希望的污染物進(jìn)入最終產(chǎn)品。
[0006] 由于非病毒性基因療法和DNA疫苗領(lǐng)域的出現(xiàn)，質(zhì)粒制備是感興趣的領(lǐng)域。質(zhì)粒是 大的并且復(fù)雜的高分子，除非斷裂，其保持超螺旋DNA結(jié)構(gòu)。與其使用合成方法，在多種情況 下，在生物系統(tǒng)中制備它們并隨后從那些系統(tǒng)中分離并純化它們是更具有成本效益的。質(zhì) 粒的生物制備通常采取使包含感興趣的質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli)( "E.coli"） 發(fā)酵的方式。
[0007] 細(xì)胞溶胞和隨后的用于制備用于純化的工藝流的處理步驟是在任何質(zhì)粒工藝中 最困難、復(fù)雜和重要的步驟。在該過(guò)程中，對(duì)于每次質(zhì)粒制備的運(yùn)行定義產(chǎn)率和質(zhì)量。對(duì)最 佳方法的探求已經(jīng)成為獲得商業(yè)能力可接受的工藝的障礙，所述最佳方法是連續(xù)的、可縮 放的并且產(chǎn)生可以不管質(zhì)粒尺寸以高濃度配制的高質(zhì)量產(chǎn)品。
[0008] 使用堿和洗滌劑溶解細(xì)菌以純化質(zhì)粒是常用的技術(shù)。令人遺憾地，該方法對(duì)于大 規(guī)模制備(或放大生產(chǎn))呈現(xiàn)出顯著的挑戰(zhàn)。首先，含有溶胞溶液的懸浮細(xì)胞的完全混合在 小規(guī)模下通過(guò)簡(jiǎn)單地使包含該細(xì)胞的容器渦旋或顛倒而容易操控。然而，這在其中體積可 以在幾十升或幾百升范圍內(nèi)的大規(guī)模下是不現(xiàn)實(shí)的。用于混合大體積液體的常用技術(shù)，例 如葉輪混合，是有問(wèn)題的，因?yàn)楫?dāng)某些細(xì)胞在最初的混合后開(kāi)始溶解時(shí)，它們釋放顯著增加 溶液粘度的基因組DNA。這種粘度上的增加顯著妨礙了進(jìn)一步混合。另一挑戰(zhàn)在于，在加入 堿性溶胞溶液后在高pH下過(guò)多的孵育可導(dǎo)致質(zhì)粒的永久變性，使其不適于大部分隨后的用 途，特別是用于治療目的的用途。此外，眾所周知，在該步驟的混合應(yīng)當(dāng)是完全的但足夠溫 和的（即，低剪切）以防止大量來(lái)自絮狀沉淀的物質(zhì)進(jìn)入含質(zhì)粒的溶液。大量的宿主基因組 DNA和內(nèi)毒素存在于絮狀沉淀中并且如果它們與質(zhì)?；旌希鼈?cè)陔S后的純化期間可能難 以從質(zhì)粒中分離。因此，質(zhì)粒的大規(guī)模制備以某種方式使大量細(xì)胞暴露于溶胞溶液、使其混 合并中和溶胞產(chǎn)物以最優(yōu)化質(zhì)粒產(chǎn)率、最小化質(zhì)粒降解和最大化除去其他細(xì)胞成分以便該 物質(zhì)可被進(jìn)一步純化而以相對(duì)大的體積制備尚濃度、尚質(zhì)量、尚純度的最終廣品。
[0009] 存在多種純化質(zhì)粒的現(xiàn)有方法;然而，這些方法不適于大規(guī)模制備。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的 純化技術(shù)不能簡(jiǎn)單地放大用于涉及大規(guī)模質(zhì)粒制備的體積。大規(guī)模制備需要產(chǎn)率和分子完 整性的最優(yōu)化而同時(shí)使污染物的去除和質(zhì)粒濃度最大化。在制備大量高濃度的質(zhì)粒DNA中， 存在將質(zhì)粒維持為超螺旋形式和開(kāi)環(huán)松弛形式的問(wèn)題。儲(chǔ)存條件通常需要高鹽，并且即使 在鹽存在下，隨時(shí)間的分子降解仍然是個(gè)問(wèn)題。許多現(xiàn)有的純化方法依賴(lài)于使用潛在地危 險(xiǎn)的、毒性的、誘變的或污染的物質(zhì)和/或昂貴的物質(zhì)或設(shè)備，這又是對(duì)于大規(guī)模制備所不 期望的。某些現(xiàn)有的純化方法利用酶的使用以消化蛋白用于最終的消除，而這樣的酶對(duì)于 大規(guī)模生產(chǎn)是昂貴的并且可造成生物污染的危險(xiǎn)。
[0010] 存在對(duì)諸如質(zhì)粒的感興趣的生物活性分子的大規(guī)模制備方法的需求，其中最終產(chǎn) 品可以具有成本效益的方式制備，所述具有成本效益的方式例如最少的設(shè)備和/或最少的 工藝步驟、高產(chǎn)率、高濃度和最少降解并且不存在雜質(zhì)、污染物和不希望的物質(zhì)。存在對(duì)具 有高濃度和最少降解及存在最少雜質(zhì)、污染物和不希望的物質(zhì)的大量質(zhì)粒溶液的需求以及 對(duì)這樣的溶液的制備方法的需求。對(duì)大量質(zhì)粒的需求大于對(duì)是低拷貝數(shù)質(zhì)粒的那些質(zhì)粒的 需求，所述低拷貝數(shù)質(zhì)粒需要非常大量的細(xì)胞以得到毫克（"mg"）范圍和以上的質(zhì)粒量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一方面包括用于從細(xì)菌細(xì)胞中制備至少一種感興趣的生物活性分子的 高純度樣品的大規(guī)模工藝。所述大規(guī)模工藝包括以下步驟：
[0012] a)通過(guò)使所述大量細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液與溶胞溶液接觸制備溶胞產(chǎn)物溶液；
[0013] b)用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片 的分散體；
[0014] c)通過(guò)至少一個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾所述分散體；
[0015] d)對(duì)所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進(jìn)行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液;和
[0016] e)對(duì)所述離子交換洗出液進(jìn)行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。在該方面的某 些實(shí)施方案中，大規(guī)模工藝還包括通過(guò)所述疏水作用溶液的超濾制備至少一種生物活性分 子的溶液的步驟。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步方面包括用于從細(xì)菌細(xì)胞制備至少一種感興趣的生物活性分子的 高純度樣品的大規(guī)模工藝，其包括以下步驟:使細(xì)菌細(xì)胞以細(xì)胞分散體與溶胞溶液接觸以 形成溶胞產(chǎn)物溶液;通過(guò)用泡罩塔混合器將中和溶液混入所述溶胞產(chǎn)物溶液而中和所述溶 胞產(chǎn)物溶液以形成被中和的混合物;通過(guò)初級(jí)過(guò)濾器和二級(jí)過(guò)濾器過(guò)濾所述被中和的混合 物以形成濾過(guò)的溶液;使所述濾過(guò)的溶液通過(guò)離子交換柱以形成離子交換溶液;使所述離 子交換溶液通過(guò)疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液;和超濾所述疏水作用溶液 以形成至少一種感興趣的生物活性分子的高純度樣品；其中在從接觸步驟到使濾過(guò)的溶液 通過(guò)的步驟的大規(guī)模工藝中的一個(gè)步驟向隨后的步驟的每次過(guò)渡基本上連續(xù)發(fā)生。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面中，提供了組合物，其包含通過(guò)本文描述和公開(kāi)的方法制備 的至少一種感興趣的生物活性分子，其中至少一種感興趣的生物活性分子是DNA質(zhì)粒。在某 些實(shí)施方案中，所述組合物包含在溶液中的至少一種約l〇mg或更多的量的DNA質(zhì)粒，其中高 純度的所述質(zhì)粒是以大于約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存 在的質(zhì)粒。
【附圖說(shuō)明】
[0019]通過(guò)參考附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員可更好地理解本發(fā)明的多個(gè)目的和優(yōu)勢(shì)，其中： [0020]圖1顯示用于以連續(xù)流工藝從細(xì)菌細(xì)胞中分離和純化感興趣的生物活性分子的一 個(gè)實(shí)施方案的示意圖。
[0021 ]圖標(biāo)含義如下：
[0022] 101:細(xì)胞重懸罐 102:溶胞溶液罐 103:NP溶液罐 104:用于細(xì)胞重懸的栗 105:用于溶胞溶液的栗 106:用于NP溶液的栗 107:串聯(lián)混合器 108:保持盤(pán)管 109:泡罩塔混合器 110:壓縮氣體罐 111:用于粗溶胞產(chǎn)物的容器 112:用于初級(jí)過(guò)濾的栗 113:初級(jí)過(guò)濾器 114:用于二級(jí)過(guò)濾的栗 115:二級(jí)過(guò)濾器 116:用于三級(jí)過(guò)濾器的栗(可選擇的） 117:三級(jí)過(guò)濾器(可選擇的） 118:用于凈化的溶胞產(chǎn)物的栗 119:用于凈化的溶胞產(chǎn)物的容器 120:水罐 121:混合器 122:用于稀釋的溶胞產(chǎn)物的容器 123:用于Mustang Q的栗 124:Mustang Q柱 圖2顯示包含來(lái)自以下實(shí)施例1的樣品的電泳凝膠的圖。第1泳道表示超螺旋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 梯帶（supercoiled plasmid ladder) (Invitrogen);第2泳道含有質(zhì)粒A的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物； 第3泳道:含有質(zhì)粒A的Q陰離子交換后的產(chǎn)物;第4泳道:用疏水作用純化后的質(zhì)粒A的產(chǎn)物； 和第5泳道:UF后混合的含有質(zhì)粒A的最終產(chǎn)物。 圖3顯示包含來(lái)自實(shí)施例3的樣品的電泳凝膠的圖。第1泳道表示超螺旋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)梯帶 (Invitrogen);第2泳道表示在使用48μηι裙裙式濾筒(pleated cartridge)的初級(jí)過(guò)濾之后 的溶胞產(chǎn)物;第3泳道表示在使用Ιμπι褶裙式濾筒的二級(jí)過(guò)濾之后的濾液;第4泳道表示在使 用COHC Pod過(guò)濾器的三級(jí)過(guò)濾之后的濾液;第5泳道表示在經(jīng)過(guò)Mustang Q陰離子交換步驟 之后的洗出液產(chǎn)物級(jí)分#1;和第6泳道表示Q洗出液的第二級(jí)分。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 提供了從細(xì)胞中純化感興趣的生物活性分子的方法以便從該細(xì)胞中以高水平的 純度與濃度純化感興趣的生物活性分子。優(yōu)選地，所述感興趣的生物活性分子是質(zhì)?；駾NA 質(zhì)粒。所述細(xì)胞可以是包含感興趣的生物活性分子的任何細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì) 胞是微生物細(xì)胞，例如諸如細(xì)菌細(xì)胞的原核細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，它們是大腸桿菌細(xì) 胞。所述細(xì)胞可以通過(guò)諸如發(fā)酵的任何方式制備或產(chǎn)生。用于發(fā)酵細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員眾所周知的。可使用本發(fā)明從細(xì)胞中提取任何感興趣的生物活性分子。在某些實(shí)施 方案中，可使用本發(fā)明提取超過(guò)一種感興趣的生物活性分子。所述感興趣的生物活性分子 可以是諸如核酸分子或蛋白的高分子。在某些實(shí)施方案中，所述感興趣的生物活性分子可 以是質(zhì)粒。
[0024] 可互換使用的術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"或"DNA質(zhì)粒"是指環(huán)狀DNA分子，其為能夠獨(dú)立于染色體 DNA復(fù)制的、與染色體DNA分離的染色體外DNA分子。編碼序列或轉(zhuǎn)基因通常包含在DNA質(zhì)粒 內(nèi)，并且在存在時(shí)，DNA質(zhì)粒被提及為表達(dá)質(zhì)?；虮磉_(dá)構(gòu)建體。編碼序列或"編碼核酸序列" 可包括可操作地與調(diào)節(jié)元件連接的起始和終止信號(hào)，所述調(diào)節(jié)元件包括能夠指導(dǎo)在核酸分 子所施用于的個(gè)體的細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)。
[0025] 提及所描述的工藝時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)"大規(guī)模"是指從細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液 中產(chǎn)生約1克或更多量的至少一種生物活性分子(特別是DNA質(zhì)粒)的純化工藝和/或需要約 1千克或更多量的細(xì)菌細(xì)胞糊(cell paste)的溶胞的純化工藝。
[0026] 提及生物活性分子(特別是DNA質(zhì)粒)的純度水平時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)"高純度"是指以至 少大于或等于約90% ;并且優(yōu)選地大于或等于約91%，大于或等于約92%，大于或等于約 93%，大于或等于約94%，大于或等于約95%，大于或等于約96%，大于或等于約97%，大 于或等于約98%或大于或等于約99%的水平純化來(lái)自宿主細(xì)菌細(xì)胞的分子。
[0027] 提及本文所述工藝時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)"連續(xù)的"或"基本上連續(xù)的"是指物質(zhì)(或溶液或 懸浮液)在純化工藝的每個(gè)步驟至每個(gè)隨后的步驟之間的連續(xù)流動(dòng)，所述步驟起始于純化 工藝的開(kāi)始直到加載離子交換色譜柱的步驟。例如，隨著分散體的細(xì)菌細(xì)胞與溶胞溶液在 接觸步驟中接觸以形成溶胞產(chǎn)物溶液，這樣的溶胞產(chǎn)物溶液將直接流入用中和溶液中和的 下一步驟。這些在步驟之間的連續(xù)過(guò)渡消除了在純化工藝步驟之間的保持步驟或孵育步 驟。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"生物活性分子"是指包含在細(xì)菌內(nèi)的、在其功能狀態(tài)的分子或生物分子，并 且在某些實(shí)施方案中，特別是指DNA質(zhì)粒。這樣的DNA質(zhì)?？杀环蛛x并用于轉(zhuǎn)染感興趣的細(xì) 胞。本發(fā)明的組合物包含至少一種類(lèi)型的生物活性分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合 物包含超過(guò)一種類(lèi)型的生物活性分子。
[0029]質(zhì)粒在它們的拷貝數(shù)上變化很大，取決于它們包含的復(fù)制起點(diǎn)，例如，ρΜB1或 PSC101，所述復(fù)制起點(diǎn)決定它們是在松弛控制下還是在嚴(yán)緊控制下;并取決于質(zhì)粒及其相 關(guān)的插入序列的尺寸。諸如puc系列及衍生質(zhì)粒的某些質(zhì)粒存在變異，這允許它們?cè)诩?xì)菌細(xì) 胞內(nèi)達(dá)到很高的拷貝數(shù)。基于PBR322的質(zhì)粒通常保持在較低的拷貝數(shù)。很大的質(zhì)粒通常保 持在每個(gè)細(xì)胞很低的拷貝數(shù)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及質(zhì)粒純化工藝，該質(zhì)粒純化工藝 允許以具有成本效益和最少步驟的制備工藝從細(xì)胞(優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞）中大規(guī)模地純化質(zhì)粒 以得到例如克量級(jí)的大量質(zhì)粒（目的是保持較高產(chǎn)率）。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒是低拷貝 數(shù)的質(zhì)粒。對(duì)提供的工藝和由此制備的生物活性分子來(lái)說(shuō)，低拷貝數(shù)質(zhì)粒是獲得小于或等 于約300、小于或等于約100、小于或等于約50、小于或等于約20、小于或等于約10、或小于或 等于約5的拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
[0030]本發(fā)明的一方面包括用于從細(xì)菌細(xì)胞中制備至少一種感興趣的生物活性分子的 高純度樣品的大規(guī)模工藝。所述大規(guī)模工藝包括以下步驟：
[0031 ] a)通過(guò)使所述大量細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液與溶胞溶液接觸制備溶胞產(chǎn)物溶液；
[0032] b)用中和溶液中和所述溶胞產(chǎn)物溶液以制備包含被中和的溶胞產(chǎn)物溶液和碎片 的分散體；
[0033] c)通過(guò)至少一個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾所述分散體；
[0034] d)對(duì)所述被中和的溶胞產(chǎn)物溶液進(jìn)行離子交換分離以產(chǎn)生離子交換洗出液;和
[0035] e)對(duì)所述離子交換洗出液進(jìn)行疏水作用分離以產(chǎn)生疏水作用溶液。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大規(guī)模工藝包括制備溶胞產(chǎn)物溶液步驟，該步驟包括在 高剪切串聯(lián)混合器中將所述細(xì)胞懸浮液與溶胞溶液混合。
[0037] 在某些實(shí)施方案中，制備步驟包括在混合器中使所述細(xì)胞懸浮液與所述溶胞溶液 接觸約1分鐘至約20分鐘，優(yōu)選地從約4分鐘至約8分鐘，并且更優(yōu)選地約5分鐘的持續(xù)時(shí)間。 在某些實(shí)施方案中，所述中和步驟包括在泡罩混合器(bubble mixer)中將所述溶胞產(chǎn)物溶 液與所述中和溶液混合。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行疏水作用分離的步驟包括使用疏水作用 柱或疏水作用膜進(jìn)行疏水作用分離以形成疏水作用溶液。疏水作用分離步驟可以是感興趣 的生物活性分子通過(guò)結(jié)合至疏水作用膜或柱的分離，這使雜質(zhì)能夠流過(guò)或被洗掉。在某些 實(shí)施方案中，感興趣的生物活性分子可流過(guò)疏水作用柱而雜質(zhì)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，感 興趣的生物活性分子流過(guò)疏水作用膜(或HIC膜）（本文稱(chēng)為"方法Γ )。在某些實(shí)施方案中， 感興趣的生物活性分子結(jié)合至HIC柱，例如丁基柱(butyl column)(本文稱(chēng)為"方法II"）。在 某些實(shí)施方案中，可使用HIC膜和HIC柱(例如丁基柱）的組合(本文稱(chēng)為"方法III"）以得到 大規(guī)模量的、具有高純度的感興趣的生物活性分子，例如克或更大量級(jí)的DNA質(zhì)粒。在某些 實(shí)施方案中，疏水作用分離包括至少使用丁基疏水作用色譜的分離，目的是產(chǎn)生疏水作用 溶液，