15
[033引使用預(yù)培養(yǎng)步驟、使用干大豆胚、壯觀霉素和整個(gè)再生外植體轉(zhuǎn)移來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因 大豆植物
[0339] 在運(yùn)些研究中，如實(shí)施例12,使用預(yù)培養(yǎng)步驟巧天，23°C，黑暗，在BGM中）。在預(yù) 培養(yǎng)步驟前，干切的外植體也在INO培養(yǎng)基上進(jìn)行水化1小時(shí)。在共培養(yǎng)期之后，將大約12 毫升包含15化pm壯觀霉素的液體WPM直接分配到共培養(yǎng)PLANTC0N中，4天后將外植體表 面接種于包含15化pm壯觀霉素的固體WPM上。在本實(shí)施例中，在再生的大約第4周鑒別表 型陽(yáng)性的綠芽，并從WPM再生培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到包含Oasis'f'WedgeSystem(Smithers-Oasis USA;Kent，OH)和簡(jiǎn)化液體培養(yǎng)基（含有0. 25毫克/升IBA的0. 5毫克/升WPM)的淺盤(pán) 中。2-4周后，獲得生根和發(fā)芽的R。植物?？傊\(yùn)些研究中的預(yù)培養(yǎng)也提高了TF% (表 2。。下面（表22)顯示的質(zhì)量事件百分比是指通過(guò)Invader?分析證明存在1-2個(gè)拷貝的 感興趣基因（GU巧和標(biāo)記基因（aadA)的轉(zhuǎn)基因事件的比例。評(píng)估的無(wú)標(biāo)記TF(mT巧是指 沒(méi)有標(biāo)記基因的事件的百分比。在共培養(yǎng)過(guò)程中，用1.化pm的TDZ處理用于此研究的外植 體，因此證明了在可W用于促進(jìn)芽增殖的細(xì)胞分裂素樣植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的存在下，用干外 植體可W達(dá)到高轉(zhuǎn)化頻率。
[0340] 表22 :從整個(gè)再生外植體觀察到的轉(zhuǎn)化頻率和質(zhì)量
[0342] 實(shí)施例16
[0343] 使用預(yù)培養(yǎng)步驟、用儲(chǔ)存的干大豆胚、壯觀霉素和整個(gè)再生外植體轉(zhuǎn)移生產(chǎn)轉(zhuǎn)基 因大豆植物
[0344] 在本實(shí)施例中，使用儲(chǔ)存3個(gè)月的干外植體，且對(duì)干切的外植體在INO中進(jìn)行1小 時(shí)的水化步驟。預(yù)培養(yǎng)在23°C黑暗條件下、在含有50ppm的制霉菌素和IOppm的TBZ(嚷 苯咪挫）殺真菌劑（通過(guò)在純DMSO中溶解50,OOOppm制霉素和10,OOOppmTBZ制備制 霉菌素和嚷苯咪挫儲(chǔ)備液，稀釋1000倍（1LINO中的Iml儲(chǔ)備液））的BGM中進(jìn)行5天。 將TDZ(1.化pm)和硫辛酸都加到接種物和共培養(yǎng)基（INO)中。構(gòu)建體PM0N107379是包含 ori化和aadA基因的傳統(tǒng)2T載體，并進(jìn)行共培養(yǎng)5天。在共培養(yǎng)后，將外植體表面接種于 固體WPM上，然后轉(zhuǎn)移到具有簡(jiǎn)化液體培養(yǎng)基（含有0. 25毫克/升IBA的0. 5克/升WPM) 的Oasis'i、'WedgeSystem(Smithers-〇asisUSA;Kent，0H)中。如表 23 所不，預(yù)培養(yǎng)干外 植體提高了TF。因此，儲(chǔ)存3個(gè)月的干外植體的表現(xiàn)類(lèi)似于新切下的干外植體。將溶解在DMSO中的制霉菌素巧化pm)和嚷苯咪挫（IOppm)加入到INO共培養(yǎng)基中（1.0mlDMSO/升 IN0)改善了外植體的健康，運(yùn)可能是通過(guò)控制通常在種子之中和之上發(fā)現(xiàn)的酵母和真菌而 實(shí)現(xiàn)的，因此在進(jìn)行大量和/或自動(dòng)化組織培養(yǎng)時(shí)是有益的。
[0345] 表23 :預(yù)培養(yǎng)對(duì)儲(chǔ)存的干外植體的TF(%)的影響
[0347] 根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，可W在不進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)的情況下，制備和實(shí)施本文公開(kāi) 的和要求保護(hù)的全部組合物和方法。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)在上面示例性的實(shí)施 方案中詳述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不背離本發(fā)明的真正概念、精神和范圍的 情況下，可W對(duì)本文所述的組合物、方法和方法的步驟或步驟的次序進(jìn)行變化、改變、修改 和改造。更加特別的是，應(yīng)當(dāng)明白，在化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑可W代替在本文所述 的試劑，而仍可獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的所有運(yùn)些 類(lèi)似的替代和修改都被認(rèn)為落入由所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之 內(nèi)。 陽(yáng)34引 參考義獻(xiàn)
[0349] 本文特別引入W下文獻(xiàn)作為參考，其提供補(bǔ)充本文所述信息的示例性的程序上的 或其它方面的細(xì)節(jié)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種獲得可轉(zhuǎn)化的大豆植物組織的方法，包括： (a) 獲得大豆植物種子； (b) 在一定條件下從大豆植物種子制備外植體，在該條件下，外植體不發(fā)芽且保持存活 并具備遺傳轉(zhuǎn)化的能力，從而產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化的大豆植物組織；和 (c) 儲(chǔ)存所述外植體，其中所述外植體儲(chǔ)存約1小時(shí)至約20個(gè)月， 其中，從其獲得所述外植體的所述大豆植物種子具有大約3-8 %的內(nèi)部含水量，并且所 述外植體具有大約4%至大約11%的內(nèi)部含水量。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述外植體包括改良為暴露種子的至少第一可轉(zhuǎn) 化細(xì)胞的基本完整的種子。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，制備外植體包括在種子上鉆至少第一個(gè)孔。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，制備外植體包括在種子上刻痕。5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述基本完整的種子包含種子的分生組織。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟： (d) 用選擇的DNA轉(zhuǎn)化外植體的至少第一細(xì)胞。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟： (e) 從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中用選擇的DNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化該植物。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步限定為包括在制備外植體之前或之后使所述種子 和/或外植體脫水。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步限定為包括在步驟（e)之前或同時(shí)增加外植體的 含水量。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述制備外植體在沒(méi)有液體的情況下進(jìn)行。11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述種子具有大約3% -大約7%的內(nèi)部含水量。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述外植體具有大約4% -大約10%的內(nèi)部含水 量。13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述外植體在大約-80°C-大約60°C的溫度下儲(chǔ) 存。14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述外植體在儲(chǔ)存前脫水。15. 如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步限定為包括從多個(gè)種子制備多個(gè)外植體，并選擇 一個(gè)或多個(gè)顯示出指示轉(zhuǎn)化外植體和/或從外植體再生植物的能力的至少第一特征的外 植體。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述特征選自顏色、大小、形狀、密度、近似分析、 碳水化物含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、纖維（灰分）含量、含水量、生存力、種質(zhì)、完整性、病 原體存在和光學(xué)特征。17. 如權(quán)利要求5所述的方法，進(jìn)一步限定為包括在步驟（d)之前或同時(shí)引發(fā)植物種子 和/或外植體。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述引發(fā)種子包括將種子與水溶液接觸。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述水溶液包含消毒劑。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述水溶液包含漂白劑或醇。21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述制備外植體是自動(dòng)化進(jìn)行的。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述制備外植體包括自動(dòng)化過(guò)程，其中，將植物 種子定向使其通過(guò)機(jī)械分離器以提供基本均勻的可再生分生植物組織輸出。23. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述步驟（d)通過(guò)細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或者微粒轟擊 進(jìn)行。24. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，在不產(chǎn)生愈傷組織培養(yǎng)物的情況下再生所述轉(zhuǎn)基 因植物。25. 如權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步限定為包括在步驟（e)之前對(duì)植物種子和/或外 植體消毒。26. 如權(quán)利要求25所述的方法，包括消毒外植體。27. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述消毒包括應(yīng)用選自漂白劑、醇、臭氧、氯氣、 紫外線、-20°C或更低的溫度和暴露于高于50°C的溫度的消毒劑。28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述消毒包括應(yīng)用制霉菌素和/或噻苯達(dá)唑。29. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，儲(chǔ)存外植體進(jìn)行大約1小時(shí)-大約24小時(shí)。30. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法在沒(méi)有用細(xì)胞分裂素樣植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 操縱外植體發(fā)育的情況下進(jìn)行。31. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述步驟（e)包括在大約35°C下、在選擇劑的存 在下培養(yǎng)外植體。32. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述步驟（e)包括在允許正常質(zhì)體發(fā)育的光照條 件下培養(yǎng)外植體。33. -種產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化的大豆植物組織的方法，包括： (a) 從大豆植物種子獲得外植體； (b) 在所述步驟（a)之前、同時(shí)和/或之后使大豆植物種子和/或外植體脫水，以獲得 沒(méi)有發(fā)芽且保持存活并具備遺傳轉(zhuǎn)化能力的外植體；和 (c) 儲(chǔ)存所述外植體，其中所述外植體儲(chǔ)存約1小時(shí)至約20個(gè)月， 并且其中，從其獲得所述外植體的所述大豆植物種子具有大約3-8 %的內(nèi)部含水量，并 且所述外植體具有大約4%至大約11 %的內(nèi)部含水量。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟： (d) 水化所述外植體；和 (e) 從外植體再生植物。35. 如權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟： (f) 在從外植體再生植物的步驟之前，用選擇的DNA轉(zhuǎn)化外植體的至少第一細(xì)胞，其中 所述植物被選擇的DNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中，水化所述外植體在黑暗條件下進(jìn)行。37. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，至少一部分再生在最高大約40°C的溫度下進(jìn)行。38. -種從單個(gè)化的大豆種子制備包括分生組織的可轉(zhuǎn)化和可再生的外植體材料的方 法，并且其中，從其獲得所述外植體的所述大豆種子具有大約3-8 %的內(nèi)部含水量，并且所 述外植體具有大約4%至大約11 %的內(nèi)部含水量，包括： a) 使包括種皮、子葉組織和分生組織的單個(gè)化大豆種子受到足以破裂種子的力； b) 從種皮和任選的子葉組織中分離出分生組織，從而產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化和可再生的外植體材 料，其中，該方法是機(jī)械化的方法；和 C)儲(chǔ)存所述外植體材料，其中所述外植體材料儲(chǔ)存約1小時(shí)至約20個(gè)月。39. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述種子具有大約3% -大約6. 2%的內(nèi)部含水 量。40. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述外植體儲(chǔ)存在-20°C至26°C的溫度下。41. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述種子具有大約3 % -大約7 %的內(nèi)部含水量。42. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述種子具有大約3% -大約6. 2%的內(nèi)部含水 量。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及從種子上切下包括分生組織的外植體材料，和這種材料在隨后用于植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化之前的儲(chǔ)存。本發(fā)明公開(kāi)了組織制備、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化方法，通過(guò)這些方法產(chǎn)生的可轉(zhuǎn)化的分生組織，和用于組織制備的設(shè)備。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00, A01H5/00, C12N5/04, C12N5/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105219694
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510639568
【發(fā)明人】B·J·卡拉伯塔, K·L·德珀曼, E·D·德施, J·D·海斯, A·R·凱斯特爾, C·L·路德維格, B·J·瑪?shù)賰?nèi)爾, E·威廉姆斯
【申請(qǐng)人】孟山都技術(shù)公司
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2008年3月10日
【公告號(hào)】CN101675168A, CN105112438A, EP2118289A2, EP2118289B1, EP2118290A2, EP2118290B1, EP2126096A2, EP2126096B1, EP2425709A1, EP2450448A1, EP2450448B1, EP2811026A2, EP2811026A3, US8030544, US8044260, US8357834, US8362317, US8466345, US8872000, US8937216, US9006513, US20080256667, US20080280361, US20090138985, US20120054918, US20120073015, US20120077264, US20130185830, US20130198899, US20140007299, US20150113683, US20150121574, US20150184170, WO2008112628A2, WO2008112628A3, WO2008112633A2, WO2008112633A3, WO2008112645A2, WO2008112645A3, WO2008112645A8