專利名稱：一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒 pElrLCG及其制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的可以用來拯救植物胚胎致死突變的誘導(dǎo)型載體有(1)四環(huán)素誘導(dǎo)型載體(2)
糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型載體(3)雌激素誘導(dǎo)型載體(4)酒精誘導(dǎo)型(5)蛻皮(Ecdysone)激 素誘導(dǎo)型載體(6)銅誘導(dǎo)型載體等。四環(huán)素誘導(dǎo)性載體的使用對環(huán)境存在潛在的危險， 另外細(xì)胞核中必須存在大量四環(huán)素才能起作用，而高濃度的四環(huán)素是有毒的；雌激素誘導(dǎo) 型載體的缺點是局部誘導(dǎo)性強，雌激素在植物體內(nèi)不易擴(kuò)散，所以不能對植物進(jìn)行整株 誘導(dǎo)；蛻皮激素誘導(dǎo)型載體主要的缺點是葉片對蛻皮激素吸收差；而酒精誘導(dǎo)型載體對 植物有毒害作用，另外酒精易揮發(fā)；銅誘導(dǎo)型表達(dá)載體的缺點是銅只能在部分細(xì)胞起作 用，對植物有毒害作用；糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體的誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)地塞米松，可以高 效地被運輸?shù)街参锏母鱾€組織器官而且對植物無毒害作用，這正是本載體的優(yōu)點。本載體 將GR-Cre重組酶片段構(gòu)建在兩個同向loxP重組位點之間，這兩個loxP位于T-DNA之上， 目前的報道大部分都是將Cre重組酶片段和loxP位點分別構(gòu)建在兩個Ti質(zhì)粒的T-DNA上， 轉(zhuǎn)基因植株通過雜交實現(xiàn)重組。如果將GR-Cre重組酶片段和loxP位點同時構(gòu)建在同一個 載體上，那么可以人為控制重組的發(fā)生和終止，這樣既可以節(jié)省時間也可以減少工作量。 Cre重組酶是38道爾頓的DNA特異位點重組酶，是從噬菌體Pl分離出來的，loxP (locus of crossover in Pl)最早在噬菌體P1的基因組里發(fā)現(xiàn)的，loxP位點具有34個堿基，在兩端 有13個反向重復(fù)的堿基，中間核心序列是8個非回文結(jié)構(gòu)的堿基，它決定了loxP位點的 極性，Cre重組酶分別結(jié)合在loxP位點的兩端，在中間核心序列區(qū)將loxP切開(見圖3)。
如果兩個loxP位點是同向的，那么在重組酶的作用下將兩個loxP切開從而產(chǎn)生4個 粘性末端，兩個loxP位點之間的序列通過兩端的粘性末端自我連接成環(huán)，從基因組里游離 出來丟失掉(見圖4)。
由于Cre重組酶只能在細(xì)胞核內(nèi)起作用，Cre連上GR后，GR-Cre在沒有施加地塞米 松時，GR結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這時GR-Cre只存在于細(xì)胞質(zhì)中，因此不能使Loxp位點發(fā)生 重組；噴施地塞米松時，地塞米松與GR結(jié)合使得GR-Cre從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上釋放出來，Cre重組酶進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合到Loxp位點上引發(fā)重組。在Loxp位點之間還含有一個Gateway cassette 和多克隆位點(MCS)， Gateway克隆技術(shù)的優(yōu)點是不受酶切位點的限制，本載體的Gateway cassette含有attRl和attR2兩個重組位點，可以通過LR反應(yīng)克隆不同的啟動子，多克隆位 點位于Gateway cassette的后面，可以將目的基因克隆到多克隆位點(MCS)上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG及其制備 的方法。讓胚胎致死突變體在胚胎時期不致死，從而可以研究胚胎致死突變體后期的發(fā)育 狀況，同時又可以在渡過胚胎時期后的任意一個時期，在地塞米松誘導(dǎo)下Cre重組酶入核 引發(fā)loxP位點重組，將兩個loxP位點之間基因從植物基因組里敲除掉。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的。
一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG是由原始載體pJawohl8-RNAi用 Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段Xhol—loxP—Nhel—Ncol —Nos—BsiwI—Kpn1—StuI—BgIII—Mfel—AatII— lxMyc—loxP—Spel連接而成。在所述 的合成片段的Nhel和Ncol酶切位點之間接入了 GR—Cre片段，在所述的合成片段的Bsiwl 和Kpnl酶切位點之間接入了 Gateway cassette片段。
所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備方法是將原始載體 pJawohl8-RNAi用Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.21 lkb長的載體片段與合成片段Xhol— loxP—Nhel—Ncol—Nos—Bsiwl—Kpnl—Stul_BgIII—Mfel—AatII_ lxMyc—loxP—Spel 連接構(gòu)建質(zhì)粒載體pElrL，然后在合成片段的Nhel和Ncol酶切位點之間接入GR—Cre片 段構(gòu)建質(zhì)粒載體pElrLC，最后在合成片段的Bsiwl和Kpnl酶切位點之間接入Gateway cassette片段構(gòu)建所述的質(zhì)粒載體pElrLCG。
所述的質(zhì)粒載體pElrL的構(gòu)建過程為Xhol-Spel雙酶切載體pUC57-loxP消化，回收 得到合成片段Xhol—loxP—Nhel—Ncol—Nos—Bsiwl—Kpnl—Stul—BgIII _ Mfel—AatII —lxMyc—loxP—Spel，然后合成片段與經(jīng)Xhol-Spel雙酶切載體pJawohl8-RNAi消化回 收后的5.211kb的片段連接即成。
所述的質(zhì)粒載體pElrLC的制備過程為用正向引物:CGGGCTAGCATGTCCAATTTAC TGACCGTACAC和反向引物CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT以質(zhì)粒 pCre為模板PCR擴(kuò)增GR-Cre片段，然后用Nhel—Ncol酶分別將擴(kuò)增出的GR-Cre片段 和質(zhì)粒pEkL進(jìn)行雙酶切，最后將酶切后的GR-Cre片段與酶切后的pElrL質(zhì)粒長片段連接 即成。所述的pElrLCG質(zhì)粒載體的制備過程為用正向引物CGGCGTACGACAAGTTTG TACAAAAAAGCTGAACG和反向引物CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CT GAA以質(zhì)粒載體pJawohl8-RNAi為模板PCR擴(kuò)增Gateway cassette片段，然后用Bsiwl 酶在55"C分別對Gateway cassette片段和質(zhì)粒pElrLC進(jìn)行酶切，再用Kpnl酶在37"C分別 對Bsiwl酶切過的Gateway cassette片段和pElrLC酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后用T4連接 酶將酶切過的Gateway cassette片段與酶切過的pElrLC質(zhì)粒載體長片段連接即成。
所述的Gateway cassette片段含有attRl attR2。
該載體的優(yōu)點是
1) 本載體既可以使用Gateway克隆技術(shù)，也可以使用常規(guī)酶切連接克隆技術(shù)。 Gateway克隆技術(shù)優(yōu)點不受限制性內(nèi)切酶的限制，它是通過同源重組來實現(xiàn)克隆而
不是酶切和連接，Gateway cassette (attRl attR2)是用來克隆各種不同的啟動子，便于轉(zhuǎn) 入的基因的啟動表達(dá)。多克隆位點是用來克隆導(dǎo)致胚胎致死突變的基因。
2) GR-Cre重組酶表達(dá)后，其蛋白不在核內(nèi)而是通過GR結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這樣 就可以通過是否施加地塞米松來控制Cre的入核，從而控制何時把轉(zhuǎn)入的基因從基因組里 敲除掉，利用這種工具就可以得到胚胎致死突變體的純合體，可以隨時研究致突變體純合 體后期發(fā)育的情況，同時開發(fā)胚胎致死突變體潛在的特殊生物性狀。
3) 本載體在雜交育種也有很大的潛力，比如花粉不育的性狀優(yōu)良的母本，利用該載體 就可得到花粉可育(轉(zhuǎn)基因)和花粉不育(轉(zhuǎn)入的基因環(huán)出丟失)的植株，這樣花粉可育 的植株可以用來繁殖種子，而花粉不育的植株就可以用作雜交育種的母本。
4) 在C末端的Myc標(biāo)簽可以檢測轉(zhuǎn)入的基因是否表達(dá)及其表達(dá)量，同時在把轉(zhuǎn)入的基 因在Cre的作用下從基因組中環(huán)出而丟失后，為檢測轉(zhuǎn)入的基因在蛋白水平是否存在及存 在的時間提供方便。
5) 本載體在施加地塞米松誘導(dǎo)Cre入核引發(fā)loxP位點重組，loxP位點之間的DNA 片段從基因組里環(huán)出，環(huán)出的DNA片段包含了GR-Cre以及轉(zhuǎn)入的基因。由于GR-Cre已 經(jīng)沒有35S啟動子不能正常啟動表達(dá)，而目的基因這時也沒有了3，末端加尾信號，從而不 能形成mRNA，導(dǎo)致GR-Cre以及目的基因不能正常表達(dá)，所以只要Cre引發(fā)重組，GR-Cre 及目的基因的轉(zhuǎn)錄就終止了。
6) GR作為糖皮質(zhì)激素受體已經(jīng)廣泛被用于轉(zhuǎn)基因以及基因功能研究，地塞米松作為 誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)對植物無毒害作用，同是時它能對植物整株起作用而不是部分細(xì)胞。


圖1為本發(fā)明質(zhì)粒載體pElrLCG合成的流程圖； 圖2為本發(fā)明質(zhì)粒載體pElrLCG的主要部分的結(jié)構(gòu)圖； 圖3為Cre重組酶將loxP位點切開示意圖； 圖4為Cre重組酶作用示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。 實施例1
1、用XhoI-Spel雙酶切消化pJawohl8-RNAi載體(由中國農(nóng)科院傅永福研究員提供) 回收5.21 lkb長的載體片段，合成463bp的XhoI-Loxp-NheI-NcoI-Nos-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII -MfeI-AatII-lxMyc-Loxp-SpeI片段，上海生工合成，序列如下
GCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG
GTTATGGCGCCACTAGT
該合成片段位于載體pUC57 (從上海生工購買)上的Smal位點即pUC57-loxP，由于 該合成片段只能以連接在載體pUC57上的形式保存，因此pUC57-loxP也用Xhol-Spel雙 酶切消化，分別回收后將5,211kb的片段和合成片段連接構(gòu)建好質(zhì)粒pElrL。
2、 用正向引物CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC和反向引物 CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT以質(zhì)粒pCre(由美國加州大學(xué)洛杉磯分 校林辰濤教授提供)為模板PCR擴(kuò)增GR-Cre并回收PCR產(chǎn)物，用Nhel和Ncol酶分別將 GR-Cre PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pElrL進(jìn)行雙酶切，然后將GR-Cre片段連接到pElrL質(zhì)粒的 Nhel和Ncol酶切位點之間，這樣GR-Cre片段就位于2x35S啟動子控制之下，從而構(gòu)建成 pElrLC質(zhì)粒。
3、 用正向引物CGGCGTACGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG和反向引物 CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAA以質(zhì)粒pJawohl8-RNAi為模板PCR擴(kuò)增Gateway cassette (含attRl attR2)，首先用BsiwI酶在55。C下對Gateway cassette PCR 回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pElrLC進(jìn)行酶切，再用Kpnl酶在37。C對Gateway cassette和pElrLC酶切 回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用T4連接酶將Gateway cassette (含attRl attR2)片段連接到pElrLC 載體的BsiwI和Kpnl酶切位點之間，構(gòu)建成pElrLCG質(zhì)粒，見圖1 。
權(quán)利要求
1、一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG，其特征在于，所述的載體pElrLCG是由原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接而成，在所述的合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入了GR—Cre片段，在所述的合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入了Gatewaycassette片段。
2、 權(quán)利要求1所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備方法，其 特征在于，將原始載體pJawohl8-RNAi用Xhol-Spel雙酶切消化回收的5.211kb長的載體 片段與合成片段Xhol — loxP — Nhel — Ncol — Nos — Bsiwl — Kpnl — Stul — BgIII — Mfel — AatII— lxMyc—loxP—Spel連接構(gòu)建質(zhì)粒載體pElrL，然后在合成片段的Nhel和Ncol酶 切位點之間接入GR—Cre片段構(gòu)建質(zhì)粒載體pElrLC，最后在合成片段的Bsiwl和Kpnl酶 切位點之間接入Gateway cassette片段構(gòu)建所述的質(zhì)粒載體pElrLCG。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備方法， 其特征在于，所述的質(zhì)粒載體pElrL的構(gòu)建過程為Xhol-Spel雙酶切載體pUC57-loxP消 化，回收得到合成片段XhoI—loxP—Nhel—NcoI-Nos—Bsiw1—Kpnl —Stul—BgIII—MfeI —Aatll—lxMyc—loxP—SpeI，然后合成片段與經(jīng)Xhol-Spel雙酶切載體pJawohl8-RNAi 消化回收后的5.211kb的片段連接即成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備 方法，其特征在于，所述的質(zhì)粒載體pElrLC的制備過程為用正向引物CGGGCTAGCATG TCCAATTTACTGACCGTACAC禾口反向弓l物CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGA AGCTT以質(zhì)粒pCre為模板PCR擴(kuò)增GR-Cre片段，然后用NheI—NcoI酶分別將擴(kuò)增出 的GR-Cre片段和質(zhì)粒pElrL進(jìn)行雙酶切，最后將酶切后的GR-Cre片段與酶切后的pElrL 質(zhì)粒長片段連接即成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備方法， 其特征在于，所述的pElrLCG質(zhì)粒載體的制備過程為用正向引物:CGGCGTACGACAAGT TTGTACAAAAAAGCTGAACG和反向引物CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTGAA以質(zhì)粒載體pJawohl8-RNAi為模板PCR擴(kuò)增Gateway cassette片段，然后用Bsiwl 酶在55'C分別對Gateway cassette片段和質(zhì)粒pElrLC進(jìn)行酶切，再用Kpnl酶在37'C分別對Bsiwl酶切過的Gateway cassette片段和pElrLC酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后用丁4連接 酶將酶切過的Gateway cassette片段與酶切過的pElrLC質(zhì)粒載體長片段連接即成。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG的制備方法， 其特征在于，所述的Gateway cassette片段含有attRl attR2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質(zhì)粒pElrLCG及其制備方法。將原始載體pJawoh18-RNAi酶切回收的5.211kb長的載體片段與合成的XhoI-loxP-NheI-NcoI-Nos-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-loxP-SpeI片段連接，然后在兩個loxP位點之間接入GR-Cre、Gateway cassette片段，構(gòu)建成新型質(zhì)粒載體pElrLCG。利用該載體既可以得到胚胎致死突變體的純合體，也可以用來研究致死突變體純合體后期發(fā)育的情況，對于研究胚胎致死突變，雜交育種及胚胎致死突變體的特殊生物性狀具有重大意義。
文檔編號C12N15/84GK101544989SQ20091004283
公開日2009年9月30日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者萍 劉, 劉選明, 林辰濤, 王宏歸 申請人:湖南大學(xué)