專利名稱：在生物反應(yīng)器中增殖植物胚發(fā)生組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生物反應(yīng)器中増殖植物胚發(fā)生組織的方法。
背景技術(shù)：
體細(xì)胞克隆是自植物組織而非雌雄配子產(chǎn)生遺傳均一植株的方法。在一個(gè)體細(xì)胞克隆方法中，植物組織在包含激素，例如生長(zhǎng)素和/或細(xì)胞分裂素的起始培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以起始能發(fā)育成體細(xì)胞胚的胚發(fā)生組織，例如胚性胚柄團(tuán)的形成。然后將胚發(fā)生組織在促進(jìn)胚發(fā)生組織定殖和增殖的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)ー步培養(yǎng)以形成前子葉胚(即，未形成子葉的 胚)。然后將前子葉胚在促進(jìn)子葉體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟的發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以將所述子葉體細(xì)胞胚，例如置于萌發(fā)培養(yǎng)基中以生成萌芽(germinant)，隨后轉(zhuǎn)移到土壌中進(jìn)ー步生長(zhǎng)，或者，將其置于人工種子中并播種入土壌中，在土壌中其萌發(fā)產(chǎn)生幼苗。在實(shí)驗(yàn)室中，植物組織體細(xì)胞克隆的増殖(維持)階段通常采用分批法(也稱作分裂法(splitting))在搖瓶中進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)法的實(shí)施中，將胚發(fā)生組織在液體増殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間；將胚發(fā)生組織自増殖培養(yǎng)基中分離(例如，通過(guò)使胚發(fā)生組織自培養(yǎng)基中沉淀)；而后，胚發(fā)生組織的等分試樣被移出并接入?yún)g獨(dú)體積的新鮮増殖培養(yǎng)基中進(jìn)ー步培養(yǎng)。根據(jù)需要重復(fù)多次該方法以產(chǎn)生多重各包括分批的胚發(fā)生組織培養(yǎng)物的容器。除了容器容積小且數(shù)量多以外，該方法還難以控制搖瓶?jī)?nèi)的生長(zhǎng)條件，且不同搖瓶間存在培養(yǎng)物變異性。盡管分批培養(yǎng)法可用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，但將分批法用于體細(xì)胞胚的商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)是不切實(shí)際的。生物反應(yīng)器更適合于大規(guī)模生產(chǎn)并且與搖瓶、分批法相比具有若干優(yōu)點(diǎn)，包括自動(dòng)化以及更緊密的監(jiān)測(cè)和控制培養(yǎng)環(huán)境，例如PH值、糖濃度、溶解氧、和ニ氧化碳的能力，從而與搖瓶法相比，能獲得更均一的培養(yǎng)物和更高產(chǎn)量的高品質(zhì)體細(xì)胞胚。用于植物胚發(fā)生組織増殖的商業(yè)規(guī)模的液體生物反應(yīng)器的成功操作需要生物質(zhì)濃度的自動(dòng)化調(diào)節(jié)。在生產(chǎn)環(huán)境下，通過(guò)快速増殖有活力的胚發(fā)生組織而獲得成功。用于増殖植物胚發(fā)生組織的生產(chǎn)友好型方法是在補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中將少量植物胚發(fā)生組織和増殖培養(yǎng)基接種到所述生物反應(yīng)器中，且隨時(shí)間添加補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基直到達(dá)到足夠體積的植物胚發(fā)生組織(生物質(zhì))或達(dá)到生物反應(yīng)器的最大體積。生物質(zhì)濃度的調(diào)節(jié)是重要的，因?yàn)樯锓磻?yīng)器中的生物質(zhì)濃度與培養(yǎng)基組分和細(xì)胞外產(chǎn)物的濃度之間密切相關(guān)。有兩大類細(xì)胞外組分一類誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生以及ー類抑制體細(xì)胞胚發(fā)生。眾所周知，需要最低的生物質(zhì)濃度以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，同時(shí)也已顯示，在高的生物質(zhì)濃度下體細(xì)胞胚發(fā)生被抑制。與生物質(zhì)濃度成反比的關(guān)鍵的培養(yǎng)基組分是糖和植物激素。在高的生物質(zhì)濃度下，上述兩類培養(yǎng)基組分可能被耗盡。糖濃度是重要的，因?yàn)槠湓谝后w増殖培養(yǎng)基中是首要的滲透劑。
為了調(diào)節(jié)生物質(zhì)濃度，應(yīng)當(dāng)以與生物質(zhì)生長(zhǎng)最匹配的速度添加増殖培養(yǎng)基?？墒牵@很困難，因?yàn)樯镔|(zhì)的實(shí)際生長(zhǎng)速度可能顯著偏離先驗(yàn)的估計(jì)，且在指數(shù)増加的生物質(zhì)生長(zhǎng)條件下，生物質(zhì)濃度可能失控。另ー個(gè)困難是可能會(huì)向補(bǔ)料分批反應(yīng)器中接種少量的培養(yǎng)物，并在一段較長(zhǎng)的時(shí)間，例如，數(shù)周，補(bǔ)料培養(yǎng)基，其可能導(dǎo)致生物反應(yīng)器中生物質(zhì)嚴(yán)重供料不足或供料過(guò)多。本發(fā)明提供了在生物反應(yīng)器中増殖植物胚發(fā)生組織的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本內(nèi)容用于以簡(jiǎn)化的方式介紹在詳述中被進(jìn)ー步描述的那些概念。本內(nèi)容的目的既不在于明確要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵性特征，也不在于輔助確定要求保護(hù)的主題的范圍。
本發(fā)明提供了在生物反應(yīng)器中増殖植物胚發(fā)生組織的方法。本發(fā)明的方法各包括以下步驟(a)將植物胚發(fā)生組織和増殖培養(yǎng)基接種到生物反應(yīng)器中；(b)測(cè)量生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)，或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)；(C)使用步驟(b)中獲得的測(cè)量結(jié)果計(jì)算補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速；(d)基于步驟(C)中計(jì)算的流速向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基；以及(e)定期重復(fù)步驟(b)到(d)。生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)包括干重濃度、糖濃度(按白利糖度(Brix)測(cè)量)和電容。也可以測(cè)量其他參數(shù)，例如鮮重濃度、pH值、不透明度、電導(dǎo)和紅外吸收。本發(fā)明的方法可用于增殖任意屬/種的植物胚發(fā)生組織，包括針葉樹(shù)，例如松科(Pinacea)植物,包括松屬(Pinus)的成員(例如,火炬松(Pinus taeda)),或黃杉屬的成員(例如，花旗松(Pseudotsuga menziesii))。


參考附圖可以更容易地意識(shí)到本發(fā)明前述的各方面及與之相隨的優(yōu)點(diǎn)，就像通過(guò)參考隨后的詳述可以更好地理解一祥，其中圖I是生物反應(yīng)器中培養(yǎng)基的按百分比白利糖度測(cè)量的糖濃度與反應(yīng)器中生物質(zhì)濃度之間的相關(guān)性的圖解；圖2是生物反應(yīng)器中培養(yǎng)基的電容與反應(yīng)器中生物質(zhì)濃度之間的相關(guān)性的圖解；圖3是一段時(shí)間的生物反應(yīng)器中按白利糖度測(cè)量的培養(yǎng)基的糖濃度的圖解，其中添加到培養(yǎng)物的増殖培養(yǎng)基的量是估計(jì)的而非用比例積分控制器計(jì)算的；以及圖4是當(dāng)添加到培養(yǎng)物的増殖培養(yǎng)基的量是用比例-積分控制器計(jì)算時(shí)，一段時(shí)間的生物反應(yīng)器中按白利糖度測(cè)量的培養(yǎng)基的糖濃度的圖解。發(fā)明詳述在此使用吋，術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”是指植物胚發(fā)生組織。在此使用吋，術(shù)語(yǔ)“植物胚發(fā)生組織”指形成胚性胚柄團(tuán)的幾十個(gè)到幾百個(gè)細(xì)胞的
隹A
ロ ο在此使用吋，術(shù)語(yǔ)“胚性胚柄團(tuán)”(ESM)指在通過(guò)出芽或卵裂的增殖過(guò)程中的早期胚。在此使用吋，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)料分批過(guò)程”指組織培養(yǎng)分批過(guò)程，其中將少量植物胚發(fā)生組織和増殖培養(yǎng)基接種入生物反應(yīng)器，并且隨時(shí)間添加補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基直到達(dá)到足夠的生物質(zhì)的量或達(dá)到生物反應(yīng)器的最大容積。體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程是植物胚的體外發(fā)育過(guò)程，包括以下步驟(I)起始，以引發(fā)胚發(fā)生組織(例如胚性胚柄團(tuán)(ESM))的形成；(2)増殖，有時(shí)稱作維持，以建立和増殖胚發(fā)生組織以形成前子葉胚；(3)發(fā)育，以發(fā)育和形成成熟子葉體細(xì)胞胚；和(4)后發(fā)育步驟，例如分層處理、萌發(fā)、置于人工種子中和為進(jìn)一歩生長(zhǎng)和發(fā)育向土壤中轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明涉及體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程的增殖階段。本發(fā)明提供了ー種在生物反應(yīng)器中増殖植物胚性組織的方法，包括下列步驟(a)將植物胚發(fā)生組織和増殖培養(yǎng)基接種到生物反應(yīng)器中；(b)測(cè)量生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)，或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)；(C)使用步驟(b)中獲得的測(cè)量結(jié)果計(jì)算補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速；(d)基于步驟(c)中計(jì)算的流速向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基；以及(e)定期重復(fù)步驟(b)到(d)。在本發(fā)明中，植物胚發(fā)生組織(例如ESM)和增殖培養(yǎng)基被接種到生物反應(yīng)器中。向生物反應(yīng)器中添加植物胚發(fā)生組織和増殖培養(yǎng)基的順序無(wú)關(guān)緊要。舉例來(lái)說(shuō)，胚發(fā)生組織和增殖培養(yǎng)基可以作為一個(gè)樣品一起加入生物反應(yīng)器；或者，先向生物反應(yīng)器中加入組織，隨后加入培養(yǎng)基；或者先向生物反應(yīng)器中加入培養(yǎng)基，隨后加入胚發(fā)生組織。配制増殖培養(yǎng)基以促進(jìn)胚性胚柄團(tuán)的生長(zhǎng)和増殖。培養(yǎng)基可以包括激素。可以包括在培養(yǎng)基中的激素的實(shí)例是生長(zhǎng)素(例如，2，4_ニ氯苯氧基こ酸(2，4-D))和細(xì)胞分裂素(例如，6-芐基氨基嘌呤(BAP))。生長(zhǎng)素可以，例如，lmg/L到200mg/L的濃度使用。細(xì)胞分裂素可以，例如，O. lmg/L到50mg/L的濃度使用。増殖培養(yǎng)基包括維持胚發(fā)生組織的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。盡管不是必須的，但通常需要的是，在増殖培養(yǎng)基中包含麥芽糖作為單ー的、或主要的可代謝糖源。有用的麥芽糖濃度的實(shí)例是在大約2. 5%到大約6.0%的范圍內(nèi)。増殖培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度通常在100-250mM/kg的范圍內(nèi)。増殖培養(yǎng)基的組成是本領(lǐng)域內(nèi)公知的?？梢栽诶纾珿upta等人，U. S. 7，625，754中找到適用的增殖培養(yǎng)基。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)適用的生物反應(yīng)器是WAVE Biotch 20/50 系統(tǒng)振蕩器(WAVEBiotch 20/50 EH system rocker)和 WAVE Biotech CELLBAGS。也可以使用其他振蕩器系統(tǒng)，例如 ARMA/rock 搖床(ARMA/rock shakers),或 Sartorius BI0STAT 生物反應(yīng)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物胚發(fā)生組織是胚性胚柄團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物胚發(fā)生組織是火炬松。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物胚發(fā)生組織是花旗松。 生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織生物質(zhì)濃度的直接測(cè)量參數(shù)、或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)包括干重濃度、糖濃度(按白利糖度測(cè)量)和電容。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的參數(shù)是干重濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的參數(shù)是糖濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，以百分比白利糖度或白利糖度為單位測(cè)量糖濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的參數(shù)是電容。也可以測(cè)量其他參數(shù)，例如鮮重濃度、pH值、不透明度、電導(dǎo)和紅外吸收。干重濃度是生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)。糖濃度和電容是生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的替代變量，因?yàn)閮煞N測(cè)量都與生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織的濃度相關(guān)，但并不直接地測(cè)量植物胚發(fā)生組織的濃度。白利糖度與植物胚發(fā)生組織濃度之間的相關(guān)性；以及電容與植物胚發(fā)生組織濃度之間的相關(guān)性分別顯示在圖I和圖2。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了基于模型的方式，其中使用近期的生長(zhǎng)歷史記錄和胚發(fā)生組織生物質(zhì)的接種物計(jì)算補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用非線性的、離散的、比例-積分反饋控制器來(lái)計(jì)算補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速。將基于模型的反饋方法用于調(diào)諧控制器的響應(yīng)并考慮胚發(fā)生組織的標(biāo)稱生長(zhǎng)速度，從而允許以系統(tǒng)的方式改變控制器的響應(yīng)以配合不同的無(wú)性培養(yǎng)系的特定的生長(zhǎng)特點(diǎn)。指數(shù)地増加加入生物反應(yīng)器的補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速以配合胚發(fā)生組織的生長(zhǎng)速度，因此采用非線性反饋控制是很自然的。基于計(jì)算的流速向生物反應(yīng)器輸送補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，大約每天一次向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，大約每小時(shí)一次向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)地向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基。加入生物反應(yīng)器的補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基的組成可以與生物培養(yǎng)器的起始接種中使用的増殖培養(yǎng)基的組成相同。加入生物反應(yīng)器的補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的組成可以與生物培養(yǎng) 器的起始接種中使用的増殖培養(yǎng)基的組成不同。加入生物反應(yīng)器的補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的組成可以在整個(gè)過(guò)程中保持一祥，也可以有所改變。干重濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量的參數(shù)是干重濃度。干重濃度的測(cè)量提供了直接地確定生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的方法。干重濃度可以通過(guò)下述方式確定從生物反應(yīng)器中移出培養(yǎng)樣品；用真空過(guò)濾自組織中移除培養(yǎng)基；漂洗組織；在烘箱中干燥組織，例如，在60°C下干燥24小時(shí)；以及之后對(duì)干燥樣品進(jìn)行稱重。當(dāng)測(cè)量的參數(shù)是干重濃度時(shí)，補(bǔ)加的増殖培養(yǎng)基的流速可以使用下述公式確定
權(quán)利要求
1.對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案作如下限定，在本發(fā)明中請(qǐng)求排他性質(zhì)或特權(quán)在生物反應(yīng)器中增殖植物胚發(fā)生組織的方法，所述方法包括以下步驟 (a)將植物胚發(fā)生組織和增殖培養(yǎng)基接種到生物反應(yīng)器中； (b)測(cè)量生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)，或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)； (C)使用步驟(b)中獲得的測(cè)量結(jié)果計(jì)算補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基的流速； (d)基于步驟(C)中計(jì)算的流速向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基；以及 (e)定期重復(fù)步驟(b)到⑷。
2.權(quán)利要求I的方法，其中參數(shù)是干重濃度。
3.權(quán)利要求I的方法，其中參數(shù)選自糖濃度、白利糖度和電容。
4.權(quán)利要求I的方法，其中使用比例積分反饋控制器計(jì)算向生物反應(yīng)器中補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基的流速。
5.權(quán)利要求4的方法，其中比例積分反饋控制器是非線性的、離散的比例積分控制器。
6.權(quán)利要求5的方法，還包括對(duì)反饋控制器進(jìn)行調(diào)諧。
7.權(quán)利要求I的方法，其中植物胚發(fā)生組織是胚性胚柄團(tuán)。
8.權(quán)利要求I的方法，其中大約每天一次向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求I的方法，其中大約每小時(shí)一次向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求I的方法，其中持續(xù)地向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求I的方法，其中植物胚發(fā)生組織是火炬松。
12.權(quán)利要求I的方法，其中植物胚發(fā)生組織是花旗松。
全文摘要
本發(fā)明提供在生物反應(yīng)器中增殖植物胚發(fā)生組織的方法。所述在生物反應(yīng)器中增殖植物胚發(fā)生組織的方法具體地包括以下步驟(a)將植物胚發(fā)生組織和增殖培養(yǎng)基接種到生物反應(yīng)器中；(b)測(cè)量生物反應(yīng)器中植物胚發(fā)生組織濃度的直接測(cè)量參數(shù)，或與所述濃度相關(guān)的參數(shù)；(c)使用步驟(b)中獲得的測(cè)量結(jié)果計(jì)算補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基的流速；(d)基于步驟(c)中計(jì)算的流速向生物反應(yīng)器中輸送補(bǔ)加的增殖培養(yǎng)基；以及(e)定期重復(fù)步驟(b)到(d)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102844426SQ201180016146
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者安東尼·P·斯萬(wàn)達(dá) 申請(qǐng)人:韋爾豪澤Nr公司