專利名稱：漿細胞鑒定和分離用熒光探針以及使用該探針的漿細胞的鑒定或分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漿細胞和漿母細胞的鑒定和分離用熒光探針以及使用該探針的漿細胞和漿母細胞的鑒定或分離方法。
背景技術(shù)：
抗體通過與靶抗原特異性結(jié)合，在生物體防御中發(fā)揮重要的作用。近年來，利用抗 體對抗原的特異性結(jié)合性的抗體藥物是作為自身免疫疾病或癌癥等疑難病的治療藥開發(fā)，其有用性得到很高評價。近年來，對于可制成這樣的抗體藥物的、高特異性·高親和性單克隆抗體的高效制作技術(shù)的開發(fā)需求日益增高，因此，正在建立使用基因克隆法，由人和小鼠的抗體生成細胞制作抗原特異性單克隆抗體的方法。該方法主要包含以下3個步驟(I)由完成了免疫的動物的末梢血、淋巴組織分離抗體生成細胞，(2)由抗體生成細胞克隆免疫球蛋白基因，(3)通過免疫球蛋白基因?qū)胨拗骷毎麃砩煽贵w。為了采用本技術(shù)高效率地制作單克隆抗體，首先必須高純度地分離抗體生成細胞。抗體生成細胞通常采用B淋巴細胞或其最終分化而成的漿細胞和漿母細胞。漿細胞和漿母細胞是B淋巴細胞最終分化所得，是為抗體生成而特化的細胞。由于已經(jīng)進行了被稱為親和力成熟的抗體基因的體細胞突變和由抗原進行的選擇，因此，這些細胞對于結(jié)合能力高的抗體的分離特別有用。但是，漿細胞和漿母細胞是含有若干亞型的不均一的細胞群，在淋巴組織內(nèi)的存在率低，為O. 1%以下，因此難以高純度分離。目前，對于從末梢血或淋巴結(jié)中鑒定·分離漿細胞和漿母細胞，必須進行至少將3種以上的細胞表面標記物的抗體組合的多個階段的正向·反向篩選操作(非專利文獻I)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻 非專利文獻
非專利文獻 I :Sanderson, R. D. , Lalor, P. , Bernfield, Μ. B lymphocytesexpress and lose syndecan at specific stages of differentiation: CellRegulation 1: 27-35 (1989)
非專利文獻 2 :Horst，A. Hunzelmannj N. Arcej S. Herberj M. Manzj R. A.Radbruchj A. Nischtj R. Schmitz, J. Assenmacherj M. Clin. Exp. Immunol. 130:370—378 Detection and characterization of plasma cells in peripheral blood:correlation of IgE+ plasma cell frequency with IgE serum titre (2002)
非專利文獻I和2的全部記載均作為特別公開引用到本說明書中。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，從末梢血或淋巴結(jié)中鑒定·分離漿細胞和漿母細胞時，必須進行多個階段的正向·反向篩選操作，因此，漿細胞和漿母細胞的鑒定·分離需要時間和繁雜的步驟。并且，使用細胞表面標記物抗體進行的漿細胞和漿母細胞的分離方法在目前階段僅在人和小鼠中建立(非專利文獻1、2)。因此，目前在采用基因克隆法制作單克隆抗體時，只使用來自人和小鼠的漿細胞和漿母細胞。但是，大部分作為抗體藥物靶標的人蛋白質(zhì)的功能性抗原表位在人-小鼠間的同源性高，因此，即使用其對小鼠免疫，由于免疫耐受，大多也難以獲得特異性高的抗體。因此，為了避免免疫耐受的限制，作為新的抗體藥物開發(fā)的目標，由使用小鼠以外的動物種類進行的免疫得到的單克隆抗體正顯示其重要性。但是，由于尚未制作出兔、大鼠、綿羊、山羊、雞等動物的抗體生成細胞表面標記物抗體，從這些動物中鑒定·分離抗體生成細胞一·漿細胞和漿母細胞的方法尚未建立。因此本發(fā)明的目的在于提供無需利用細胞表面標記物，可高效率、高純度地從包括人和小鼠在內(nèi)的哺乳類直至鳥類的各種動物中分離漿細胞和漿母細胞的方法。漿細胞和漿母細胞具有其它細胞中未見的以下的特征形態(tài)。(I)與蛋白質(zhì)的翻譯·折疊·成熟有關(guān)的細胞器一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常發(fā)達，占有細胞質(zhì)的大部分。(2)細胞核小型且偏于細胞的一側(cè)存在，核內(nèi)有染色體聚集，可見車輪輻狀的異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人認為，這些特征是漿細胞和漿母細胞由于為大量的抗體生成而特化的原因出現(xiàn)的形態(tài)，因此利用該形態(tài)，不管動物種類如何，均具有可分離漿細胞和漿母細胞的可能性?；谏鲜隹紤]，本發(fā)明人對于很多的熒光探針、對于對漿細胞和漿母細胞的選擇性染色進行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在這樣的熒光探針(熒光探針I(yè)):其對于漿細胞和漿母細胞強烈染色，而對于可能與漿細胞和漿母細胞共存的其它細胞的染色程度低，兩者間所得的熒光強度比顯示可識別程度的差異。進一步發(fā)現(xiàn)，存在這樣的熒光探針(熒光探針2):其對于可能與漿細胞和漿母細胞共存的其它細胞的核強烈染色，但對于漿細胞和漿母細胞的核則親和性低。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，通過使用這些熒光探針，無需使用細胞表面標記物抗體，即可高效率地從淋巴結(jié)組織或血細胞試樣中鑒定漿細胞和漿母細胞，并且可以將鑒定的漿細胞和漿母細胞分離，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[I]熒光探針，該熒光探針是對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性比對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用于漿細胞和/或漿母細胞的鑒定或分離。[2] [I]的熒光探針，該熒光探針選自(1)兩親性和陽離子性、并且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)；以及(2)對于顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。[3] [2]的熒光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(shù)(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數(shù)在O. ΙμΜ-O. InM的范圍。[4] [1]-[3]中任一項的熒光探針，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、內(nèi)體或聚集體。[5] [1]-[4]中任一項的熒光探針，其中，上述熒光探針選自熒光標記格列本脲、熒光標記布雷菲德菌素A、熒光探針和熒光蛋白。[6]熒光探針，該熒光探針是對細胞核的染色選擇性比對細胞核以外的細胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用于漿細胞和/或漿母細胞的鑒定或分離。[7] [6]的熒光探針，其中，熒光探針是對DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)。[8] [7]的熒光探針，其中，上述對DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)是如下的物質(zhì)兩個氮通過聚亞甲基鏈連接，各個氮獨立形成芳環(huán)，至少一個氮具有正電荷作為季銨基。[9] [8]的熒光探針，其中，對于上述物質(zhì)，兩親性指數(shù)(Al)〈8，疏水性指數(shù)(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。[10] [6]-[9]中任一項的熒光探針，其中，上述熒光探針為SYTO(注冊商標)59或SYTO (注冊商標)24。[11] [1]-[5]中任一項的熒光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞為選自紅細胞、血小板、單核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。[12] [6]-[10]中任一項的熒光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞是選自單核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。[13] [1]-[12]中任一項的熒光探針，該熒光探針用于來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的漿細胞和漿母細胞的分離。[14]鑒定淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用[1]_[5]中任一項的熒光探針或其組合對來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[15]漿細胞和漿母細胞的制備方法，該方法包括收集按照[14]所述方法鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[16] [15]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞的收集。[17]鑒定淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項的熒光探針或其組合對來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[18]漿細胞和/或漿母細胞的制備方法，該方法包括收集按照[17]所述方法鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。[19] [17]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞的收集。
[20]漿細胞和/或漿母細胞的制備方法，該方法包括使用[6]_[10]中任一項的熒光探針或其組合對[15]或[16]中收集的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞，收集所鑒定的細胞，將剩余的細胞作為漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞進行收集。[21] [20]的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞的收集、以及剩余細胞的收集。[22][13]-[21]中任一項的方法，其中，淋巴結(jié)組織、血細胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負鼠、臭駒鼯(suncus)、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。 在本發(fā)明中，無需使用細胞表面標記物的抗體，而是關(guān)注于熒光探針對細胞器等的染色選擇性，即可鑒定漿細胞和漿母細胞。因此，不需要用于漿細胞和漿母細胞鑒定的細胞表面標記物的抗體本身，不限于特定的動物的種類，即可以鑒定且分離漿細胞和漿母細胞。因此，根據(jù)本發(fā)明，可制成不依賴特定的動物種類的單克隆抗體。目前，只有人和小鼠抗體應(yīng)用于抗體藥物的開發(fā)，但采用本發(fā)明，則可以將由很多動物種類得到的單克隆抗體用于抗體藥物的開發(fā)。繼而，本發(fā)明對于占新藥開發(fā)主流的抗體藥物開發(fā)提供了新的的有力的技術(shù)。附圖
簡述
圖I表示實施例I中使用選擇性染色內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針鑒定漿細胞和漿母細胞的試驗結(jié)果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細胞群用ER-Tracker (注冊商標)Blue-White DPX/lipid染色，通過熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。圖2表示實施例2中使用選擇性染色內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針和常染色質(zhì)親和性熒光探針鑒定漿細胞和漿母細胞的試驗結(jié)果。是將⑶49b陰性、⑶45R陰性、⑶138陽性細胞群用SYTO (注冊商標)59以及ER-Tracker (注冊商標)Blue-White DPX/lipid染色，通過熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。圖3表示實施例3中存在于通過細胞分選儀分選的Blue-White DPX/lipid強陽性且SYTO(注冊商標)59弱陽性細胞群中的免疫球蛋白的檢測結(jié)果。圖4表示實施例4中存在于通過細胞分選儀分選的ER-Tracker (注冊商標)Blue-White DPX/lipid強陽性大鼠細胞群中的免疫球蛋白的檢測結(jié)果。圖5表不實施例5中存在于通過細胞分選儀分選的ER-Tracker(注冊商標)Blue-White DPX/lipid強陽性豚鼠細胞群中的免疫球蛋白的檢測結(jié)果。實施發(fā)明的方案 <熒光探針1>
本發(fā)明的方案I的熒光探針(熒光探針I(yè))是用于漿細胞和漿母細胞的鑒定或分離的熒光探針，對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的親和性比對其它細胞器的親和性高，換言之，是選擇性染色細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針。漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常發(fā)達，結(jié)果，通過熒光探針I(yè)的染色所得到的熒光強度與漿細胞和漿母細胞以外的細胞用熒光探針I(yè)染色時的熒光強度相比，顯示出可以識別漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的程度的差異。熒光探針I(yè)所顯示的上述熒光強度比(漿細胞和漿母細胞的熒光強度/漿細胞和漿母細胞以外的細胞的熒光強度)例如為3倍以上。漿細胞和漿母細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對于熒光探針I(yè)的親和性沒有很大差異，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達程度的不同產(chǎn)生了上述熒光強度的差異。因此，根據(jù)上述熒光強度比、通過用熒光探針I(yè)染色，可以識別漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞。用熒光探針I(yè)染色，則可以通過來自漿細胞和漿母細胞以外的細胞的熒光強度與來自漿細胞和漿母細胞的熒光強度的強弱差異，來將共存有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的漿細胞和漿母細胞兩者進行識別。因此，通過用熒光探針I(yè)染色，可以容易地從共存有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的細胞群中鑒定出漿細胞和漿母細胞，并且可以收集所鑒定的漿細胞和漿母細胞，由此可以獲得較多含有漿細胞和漿母細胞的細胞群。 如果來自染色的漿細胞和漿母細胞的熒光強度為來自染色的漿細胞和漿母細胞以外的細胞的熒光強度的3倍以上，則熒光探針I(yè)可以識別兩者，從容易識別的角度考慮，優(yōu)選4倍以上，進一步優(yōu)選5倍以上。不過，根據(jù)漿細胞和漿母細胞以外的細胞的種類不同，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達程度也不同，因此，該熒光強度比隨著漿細胞和漿母細胞以外的細胞的種類不同而變化。上述熒光強度比越高，則可以更高效率地從含有漿細胞和漿母細胞以外的細胞的細胞群中鑒定漿細胞和漿母細胞。漿細胞和漿母細胞以外的細胞例如可舉出紅細胞、血小板、T淋巴細胞、B淋巴細胞、粒細胞、巨曬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等。本發(fā)明中，使用本發(fā)明的熒光探針I(yè)的漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別可如下進行。將熒光探針I(yè)加于細胞懸液中，在37 °C下進行30分鐘染色。適合染色的熒光探針I(yè)的濃度根據(jù)熒光探針I(yè)的種類而不同，例如IOOnM-I μ M0染色后，將細胞用PBS洗滌。洗滌后的細胞例如可以(I)使用熒光顯微鏡觀察細胞中熒光探針的定位，或者(2)根據(jù)細胞發(fā)出的熒光的強度來判別是漿細胞和漿母細胞，或者是漿細胞和漿母細胞以外的細胞。漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別方法在漿細胞和漿母細胞的鑒定·分離方法中詳述?？梢赃M一步應(yīng)用上述漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞的判別方法，由對漿細胞和漿母細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性未知的物質(zhì)篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高、適合作為本發(fā)明的熒光探針I(yè)的熒光探針的篩選可利用以下方法進行通過后述的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)的免疫染色(在漿細胞和漿母細胞中為免疫球蛋白)，或者使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移性的重組熒光蛋白在培養(yǎng)細胞中表達，由此鑒定細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用該方法求出細胞全體的熒光強度A與來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強度B的比例(Β/Α)。篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)的方法中，既可以只使用漿細胞和漿母細胞，也可只使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞實施。不過，漿細胞和漿母細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，可通過染色獲得高熒光強度，因此，使用漿細胞和漿母細胞更容易進行物質(zhì)對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性的評價。但是，漿細胞和漿母細胞的獲得并不容易，因此也可以使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞，評價對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性(染色力)，篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。例如，在使用常規(guī)的培養(yǎng)細胞(例如Hela細胞)的染色試驗中，通過求出上述細胞全體的熒光強度A和來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強度B的比例(B/A)，可以篩選可用作熒光探針I(yè)的物質(zhì)。不過，在使用漿細胞和漿母細胞以外的細胞作為細胞時，根據(jù)細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的發(fā)達程度，將作為閥值的B/A的值適當設(shè)定為比在使用漿細胞和漿母細胞的篩選方法中所采用的閥值B/A的值低的值(例如為50%左右)是適當?shù)?。漿細胞和漿母細胞以外的細胞的例子可舉出紅細胞、血小板、T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等作為其它的細胞。并且，上述方法中的篩選也可以使用雜交瘤細胞、漿細胞瘤或多發(fā)性骨髓瘤細胞代替漿細胞和漿母細胞。這是由于，雜交瘤細胞、漿細胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤細胞也生成免疫球蛋白，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，因此可通過染色獲得高熒光強度，更容易進行物質(zhì)對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性的評價。作為對漿細胞和漿母細胞以及漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高的熒光探針I(yè)的物質(zhì)的例子，可舉出(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性 的物質(zhì)，以及(2)對顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。具有上述(I)或(2)的性質(zhì)的物質(zhì)對于漿細胞和漿母細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性、以及對于漿細胞和漿母細胞以外的細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色性兩者均比對于細胞的其它細胞器的染色性高。上述(I)中的“兩親性和陽離子性”具體來說是指兩親性指數(shù)(Al)例如為+6>AI>0。其中，兩親性指數(shù)是通過計算分子的脂溶性結(jié)構(gòu)域表觀上的IogP值所得到的值。具體來說，是根據(jù)Hansch等人提出的碎片值，考慮碳鏈的長度及其位置關(guān)系與陽離子性季銨基的極性效果，根據(jù)Morrall等人的模型計算的值。[Hansch C，Leo AJ. ExploringQSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, p.160， AmericanChemical Society: Washington, DC, 1995. ， Morrall SWj Herzog RRj Kloepper-SamsPj Rosen MJ. Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance totoxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress, vol.3. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227。上述⑴中的“中等程度的脂溶性”是指疏水性指數(shù)(IogP)例如為+6>logP>0。疏水性指數(shù)是根據(jù)Hansch等人的碎片推算法計算的分子全體的疏水性值。具體來說，是在以Al所示的疏水基團上加上其附帶的結(jié)構(gòu)的影響而得出的。上述(2)中的“對顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性”具體來說是指具有解尚常數(shù)為O. I μ Μ-0. InM的未和性。對顯不內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)也是選擇性染色細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光探針。(I)兩親性和陽離子性、且具有中等程度脂溶性的物質(zhì)的例子可舉出下述Α、Β或C所示的化合物。式A所示的化合物是Di0C6 (3) ( 3，3’ - 二己基氧雜碳菁碘化物)，在低濃度下聚集于線粒體，但在高濃度聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。式B所示的化合物是羅丹明B己酯，在低濃度下聚集于線粒體，在高濃度下聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。式C所示的化合物是ER-Tracker Blue whiteDPX，主要聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在高濃度也對高爾基體染色。是實施例中使用的熒光探針。這些A、B或C所示的化合物均為兩親性和陽離子性，具有中等程度的脂溶性(參考文獻，參照Whyfluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental andQSAR-modeling study)。A所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為4. 5和4. 4，具有I價陽離子。B所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為4. 8和5. 9，具有I價陽離子。C所示的化合物的兩親性指數(shù)(Al)和疏水性指數(shù)分別為5. I和O. 7，具有I價陽離子。C所示的化合物如實施例所示，對漿細胞和漿母細胞染色時的熒光強度為對漿細胞和漿母細胞以外的細胞染色時的熒光強度的4倍以上。[化I]
權(quán)利要求
1.熒光探針，所述熒光探針是對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性比對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用于漿細胞和/或漿母細胞的鑒定或分離。
2.權(quán)利要求I的熒光探針，其中，所述熒光探針選自(1)兩親性和陽離子性、并且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)；以及(2)對于顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)具有一定以上的親和性的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的熒光探針，其中，上述兩親性是兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性是疏水性指數(shù)(IogP)為+6>logP>0，一定以上的親和性是解離常數(shù)在O. I μ M-ο. InM 的范圍。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的熒光探針，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、內(nèi)體或聚集體。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的突光探針,其中，上述突光探針選自突光標記格列本脲、熒光標記布雷菲德菌素Α、熒光探針和熒光蛋白。
6.熒光探針，所述熒光探針是對細胞核的染色選擇性比對細胞核以外的細胞器的染色選擇性高的熒光探針，通過用該熒光探針染色，可識別漿細胞和漿母細胞與漿細胞和漿母細胞以外的細胞，用于漿細胞和/或漿母細胞的鑒定或分離。
7.權(quán)利要求6的熒光探針，其中，熒光探針是對DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的熒光探針，其中，上述對DNA具有結(jié)合性的物質(zhì)是如下的物質(zhì)兩個氮通過聚亞甲基鏈連接，各個氮獨立形成芳環(huán)，至少一個氮具有正電荷作為季銨基。
9.權(quán)利要求8的熒光探針，其中，對于上述物質(zhì)，兩親性指數(shù)(Al)〈8，疏水性指數(shù)(IogP)為-5〈logP(陽離子)〈0。
10.權(quán)利要求6-9中任一項的熒光探針，其中，上述熒光探針為SYTO(注冊商標)59或SYTO (注冊商標)24。
11.權(quán)利要求1-5中任一項的熒光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞為選自紅細胞、血小板、單核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。
12.權(quán)利要求6-10中任一項的熒光探針，其中，漿細胞和漿母細胞以外的細胞是選自單核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的至少一種細胞。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的熒光探針，其中，所述熒光探針用于來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的漿細胞和漿母細胞的分離。
14.鑒定淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-5中任一項的熒光探針或其組合對來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和/或漿母細胞或者衆(zhòng)細胞和/或衆(zhòng)母細胞的候選細胞。
15.漿細胞和漿母細胞的制備方法，所述方法包括收集按照權(quán)利要求14所述方法鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。
16.權(quán)利要求15的方法，該方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和/或衆(zhòng)母細胞或者衆(zhòng)細胞和/或衆(zhòng)母細胞的候選細胞的收集。
17.鑒定淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓中的漿細胞和漿母細胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6-10中任一項的熒光探針或其組合對來自淋巴結(jié)組織、血細胞試樣或骨髓的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和/或漿母細胞或者衆(zhòng)細胞和/或衆(zhòng)母細胞的候選細胞。
18.漿細胞和漿母細胞的制備方法，所述方法包括收集按照權(quán)利要求17所述方法鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母細胞的候選細胞。
19.權(quán)利要求17的方法，所述方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或漿母 細胞的候選細胞的收集。
20.漿細胞和漿母細胞的制備方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6-10中任一項的熒光探針或其組合對權(quán)利要求15或16中收集的細胞實施染色，接著，根據(jù)來自細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞，收集所鑒定的細胞，將剩余的細胞作為漿細胞和/或漿母細胞或者漿細胞和/或者漿母細胞的候選細胞進行收集。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，所述方法是通過細胞分選儀的分選來進行所鑒定的漿細胞和漿母細胞以外的細胞或者漿細胞和漿母細胞以外的細胞的候選細胞的收集、以及剩余細胞的收集。
22.權(quán)利要求13-21中任一項的方法，其中，淋巴結(jié)組織、血細胞或骨髓來自人、類人猿、猴、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、驢、駱騎、大羊騎、羊騎、馴鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、紹、小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、金倉鼠、亞美尼亞倉鼠、雪貂、小型豬、浣熊、負鼠、臭駒鼯、袋鼠、海豚、雞、鵪鶉或鴕鳥。
全文摘要
本發(fā)明提供無需利用細胞表面標記物，可以高效率、高純度地由哺乳類或鳥類分離漿細胞和漿母細胞的方法。熒光探針，與對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器的染色選擇性相比，其對細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高。涉及鑒定漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用該熒光探針，對來自淋巴結(jié)組織等的細胞進行染色，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和漿母細胞。熒光探針，與對細胞核以外的細胞器的染色選擇性相比，其對細胞核的染色選擇性高。鑒定淋巴結(jié)組織等中的漿細胞和漿母細胞的方法，該方法包括使用該熒光探針，對來自淋巴結(jié)組織等的細胞染色，根據(jù)來自染色的細胞的熒光強度來鑒定漿細胞和漿母細胞。
文檔編號C12N5/078GK102947463SQ20118001581
公開日2013年2月27日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者黑澤信幸, 磯部正治 申請人:國立大學(xué)法人富山大學(xué)