一種油菜根系細(xì)胞質(zhì)膜純化和鑒定的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種油菜根系細(xì)胞質(zhì)膜的分離純化 和質(zhì)膜蛋白的鑒定及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了一個用于分離純化油菜根系質(zhì)膜的技術(shù)體系及 其在膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 質(zhì)膜（plasma membrane, PM)是區(qū)分許多重要的生理生化過程的細(xì)胞內(nèi)部與周 圍環(huán)境的動態(tài)屏障，調(diào)節(jié)細(xì)胞與其所處的環(huán)境之間進(jìn)行細(xì)胞物質(zhì)交換和信息傳遞。質(zhì)膜 位置的特殊性賦予質(zhì)膜上的質(zhì)膜蛋白在信號傳導(dǎo)、離子和代謝物的跨膜運輸中起著非常 關(guān)鍵的作用。在植物中，質(zhì)膜蛋白除了上述功能外，對植物細(xì)胞壁的形成、生物病原體和 致病菌的侵染W(wǎng)及非生物逆境的脅迫等都起著重要的信號傳導(dǎo)與調(diào)控作用（Smallwood M,Knox肝，Bowles DJ. Membranes:specialized functions in plants. BIOS Scientific Publishers,化化rd.，1996, p578)。然而，質(zhì)膜蛋白具有疏水性強(qiáng)、蛋白豐度低等特 征，從而使得質(zhì)膜蛋白組學(xué)研究舉步維艱。到目前為止，進(jìn)行質(zhì)膜蛋白組分析的有效 方法是先通過特定的方法將質(zhì)膜從組織中富集純化出來，然后再對所富集的質(zhì)膜進(jìn)行 蛋白分析（Yadeta KA, Elmore JM, Coaker G. Advancements in the analysis of the Arabidopsis plasma membrane proteome. Front Plant Science, 4:86 ；Drissi R, Dubois ML,Boisvert FM. Proteomics methods for subcelIular proteome analysis.FEES Journal, 280:5626-5634)。
[0003] 傳統(tǒng)的膜分離方法主要是基于細(xì)胞內(nèi)各種膜組分之間的大小和密度不同，通過 差速離屯、及密度梯度離屯、獲得質(zhì)膜組分，然而通過運種方法獲得的質(zhì)膜純度不高，因為在 離屯、過程中沉降速率相似的膜組分都會富集到一起，Sze(SzeH,化gericin-stimulated ATPaseactivityinmicrosomalvesiclesoftobaccocallus.Pro.Natl.Acad.Sci. USA. 1980,77:5904-5908)進(jìn)一步在密度梯度離屯、過程中引入葡聚糖值extran)W代替薦 糖進(jìn)行膜組分的分離。之后便出現(xiàn)了基于膜表面的表面靜電學(xué)特征W及膜的親水性/疏水 性進(jìn)行細(xì)胞膜分離的兩相體系。通過比較兩相分配體系與薦糖梯度離屯、對燕麥根系質(zhì)膜組 分的分離發(fā)現(xiàn)，兩相分配體系法獲得的質(zhì)膜純度遠(yuǎn)比薦糖梯度離屯、法高OlodgesTtMills D.Isolationoftheplasmamembrane.MethodsinEnzymology,PlantMolecular BiologyAcademicPress, 41-54)。目前，質(zhì)膜分離純化的兩相分配體系主要由葡聚糖 值extranT-500)和聚乙二醇（PEG3350)構(gòu)成，但不同的植物在質(zhì)膜純化過程中對聚合物 濃度的要求與配比存在很大的差異。
[0004] 油菜是世界上最重要的油料作物之一，在我國已成為繼水稻、玉米、小麥、大豆之 后的第五大作物。根系是植物吸收水分和無機(jī)養(yǎng)分的主要器官，研究油菜根系質(zhì)膜蛋白的 變化對解析優(yōu)良根構(gòu)型的發(fā)生發(fā)育、養(yǎng)分吸收和運轉(zhuǎn)的生理分子機(jī)理具有重要的意義。而 質(zhì)膜蛋白組的研究是當(dāng)今科學(xué)研究中的難點，因質(zhì)膜蛋白具有豐度低、疏水性強(qiáng)等特點，油 菜的根系質(zhì)膜蛋白研究更是未見報道。因此，發(fā)展一種高效分離純化油菜根系質(zhì)膜的技術(shù) 體系，W獲得高純度的根系質(zhì)膜，是開展油菜根系質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究的先決條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，建立一種油菜根系質(zhì)膜純化的技術(shù)體 系，獲得高純度的油菜根系質(zhì)膜W用于質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方面。
[0006] 本發(fā)明人通過研究兩相分配體系中聚合物濃度對甘藍(lán)型油菜根系質(zhì)膜純化的影 響，獲得了適合甘藍(lán)型油菜根系質(zhì)膜純化的兩相純化系統(tǒng)，經(jīng)質(zhì)膜特異的AWase酶抑制劑 和蛋白分析對純化的質(zhì)膜進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果表明該系統(tǒng)獲得的質(zhì)膜具有較高的純度，適 合進(jìn)行膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 陽007] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下：
[0008] 取50g甘藍(lán)型油菜根系鮮樣，按根系鮮樣與勻漿液即緩沖液I質(zhì)量比為1:4的 比例加入預(yù)冷的緩沖液I，在低溫（4°C及W下）下用高速組織勻漿器研磨成勻漿，用孔徑 為210ym的四層尼龍布過濾，所得濾液加入2mL0.IMPMSF溶液混勻后用高速冷凍離屯、 機(jī)度eckman,Avanti?J-30IJA30.SOrotor)在 10,OOOg下離屯、15min，將所得上清液再 經(jīng)超高速冷凍離屯、機(jī)度eckman,OptimaLE-80K叫tracentrifuge,Type70Tirotor)在 100,OOOg下離屯、30min，離屯、后的沉淀重懸于9血的緩沖液lU〇. 33M的薦糖，5mMpH7. 8 的憐酸鐘緩沖液）中得到微粒體重懸液（Microsome)，取9g所得的該微粒體重懸液加入 到27g緩沖液III中充分混勻形成一個36g的兩相分配體系（圖1中的管2)，同時為了獲 得新的上相及下相，分別用9g的緩沖液II(0. 33M的薦糖，5mMpH7. 8的憐酸鐘緩沖液） 替換微粒體重懸液與27g緩沖液III中充分混勻形成一個新的36g體系即圖1中管1和 管3。用水平轉(zhuǎn)頭度eckman，Avanti?J-30IJS7. 5rotor)在1，500g下分別離屯、管1，管 2和管3各5min促進(jìn)分層，管2中的細(xì)胞質(zhì)膜分配到上層聚乙二醇牌G)相中，其它膜組 分分配到下層葡聚糖值extran)相中（圖1中的管5)，新的上相及下相為圖1中的管4及 管6。將圖1中的管5中獲得的上相扣1)與圖1中的管4下相化2)混勻后用水平轉(zhuǎn)頭 度eckman,Avanti?J-30IJS7.Srotor)在 1, 500g下離屯、5min，獲得的上相（圖 1 中的管 8 上相U2')與圖1中的管7下相化3)(注：圖1中的管7是管6移除上相后的管）混勻后 再用水平轉(zhuǎn)頭度eckman,Avanti?J-30IJS7.Srotor)在1, 500g下離屯、5min獲得圖1中 的管10上相做即為含質(zhì)膜的組分。另外將圖1中的管5下相化1)與圖1中的管6上相 扣3)混勻后用水平轉(zhuǎn)頭度eckman,Avanti?J-30IJS7.Srotor)在1, 500g下離屯、5min，然 后將獲得的上相（圖1中的管9上相U3')與圖1中管8下相化2')混勻后用用水平轉(zhuǎn) 頭度eckman,Avanti?J-30IJS7.Srotor)在 1, 500g下離屯、5min，獲得的上相（圖 1 中的 管11上相U4)與圖1中的管10下相化3')混勻后再用水平轉(zhuǎn)頭度eckman，Avanti?J-30I JS7. 5rotor)在1，500g下離屯、5min獲得圖I中的管12上相扣'）。將上述獲得的上相 U與U'混合并用緩沖液IV(20mMpH7. 5的化is-HCl溶液）稀釋4倍，然后用100,OOOg 的超高速冷凍離屯、機(jī)度eckman,OptimaLE-80K叫tracentrifuge,Type70Tirotor)離屯、 30min。沉淀物即為純化的質(zhì)膜組分，將所得的純化的質(zhì)膜組分重懸于100yL膜緩沖液（緩 沖液V:0. 25M薦糖，20mMpH7. 5的Tris-HCl)并保存于-80°C備用。上述所有操作均在低 溫環(huán)境下（4°C及W下）或冰上進(jìn)行。
[0009] 參照化a壯ord報道的蛋白測定方法度ra壯ordMM.Arapidandsensitive methodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingthe principleofprotein-dyebinding.AnalBiochem. 1976,72:248-254)測定上述純化 的細(xì)胞質(zhì)膜中蛋白含量。通過測定細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)志性酶ATPase的活性并計算酶活性抑制 率來評價所得的細(xì)胞質(zhì)膜的純度。分別W0.ImM的正饑酸鋼（Vanadate)、50mM的硝酸鐘 (Nitrate)、5mM的疊氮化鋼（Azide)溶液作為鑒定油菜根系細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜和線粒體膜 AWase酶特異的酶抑制劑，W0.ImM的鋼酸鋼（Molybdate)溶液作為非特異憐酸酶的抑 制劑，測定加入抑制劑前后質(zhì)膜水解ATP釋放的無機(jī)憐（Pi)含量來計算其抑制率。具體 步驟為：反應(yīng)體系為（總體積500yL) :50mMpH6. 5的MES-Tris緩沖液（緩沖液VI)， SmM的ATP(S憐酸腺巧），5mM的M拆〇4,上述提到的對應(yīng)酶抑制劑和10yg質(zhì)膜蛋白。W 未加任何酶抑制劑的反應(yīng)作對照，加入質(zhì)膜蛋白后啟動反應(yīng)，在30°C水浴中反應(yīng)20min后 加入ImL