用于轉(zhuǎn)化的植物胚外植體的制備和用圖
【專利說明】用于轉(zhuǎn)化的植物胚外植體的制備和用途
[0001] 本申請是申請日為2008年3月10日、申請?zhí)枮?008800075994、發(fā)明名稱為"用 于轉(zhuǎn)化的植物胚外植體的制備和用途"的發(fā)明專利申請的分案申請。
【背景技術(shù)】
[0002] 本申請要求于2007年3月9日提交的美國臨時申請60/894, 096和于2007年4 月30日提交的60/915, 066的優(yōu)先權(quán)，在此引入其全部公開內(nèi)容作為參考。
[000引 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明主要設及制備和儲存植物胚組織的方法及其在再生和轉(zhuǎn)化中的后續(xù)應用。 本發(fā)明主要設及直接從干種子制備和儲存植物胚組織的方法及其在再生和轉(zhuǎn)化中的后續(xù) 應用。產(chǎn)生的新外植體可W儲存，且在提供適宜的條件時可W發(fā)芽和/或轉(zhuǎn)化。
[000引 2.相關(guān)技術(shù)描述
[0006] 可W通過直接處理植物胚的分生組織獲得轉(zhuǎn)化的植物（例如，美國專利 6, 384, 301)。分生組織包含形成性植物細胞，形成性植物細胞可W分化產(chǎn)生多種植物結(jié)構(gòu)， 包括莖、根、葉、種系組織和種子?？蒞處理和選擇或篩選植物胚，W確定運些處理過的胚中 哪些已將新的遺傳信息引入種系組織中。美國專利第6, 384, 301號和第7, 002, 058號和美 國公開20060059589描述了直接對大豆胚的分生細胞應用細菌介導的基因轉(zhuǎn)移來遺傳轉(zhuǎn) 化大豆（Glycinemax)的方法。
[0007] 在典型的大豆轉(zhuǎn)化操作中，使種子水化/吸水來軟化種皮并允許提取外植體組 織。水化之后，從種子上切下胚或胚組織。當分生組織用作外植體時，可W除去初生葉組織 W暴露大豆胚的分生組織。大量的研究設及胚的切除、將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入胚中和胚的培養(yǎng)。處 理可W對外植體組織造成損傷，運會對后續(xù)的轉(zhuǎn)化和再生步驟造成負面影響。因此，減少外 植體組織損傷是重要的，運種損傷可能導致轉(zhuǎn)化和/或再生的措施施加在非存活組織上。
[0008] 因此植物胚的切除通常是手工操作的。在運一過程中，戴上手套，一次一個地對表 面滅菌的種子進行無菌操作。然后小屯、切下外植體。對于分生組織，仔細地將種子定向，W 使用施加的力彈出種皮，然后除去初生分生組織附近的胚葉（子葉），W留下包含分生組織 的種胚。但是即使小屯、處理每個種子，仍導致活胚的回收低于期望，而且甚至使用高質(zhì)量的 種子回收率可能仍低于70%。
[0009] 切下之后胚的細菌污染也是一個重要的考慮方面。為保持外植體的較高生命力和 回收率而增加的處理也增加了破壞性污染的可能性（運將會在后面的操作步驟中表現(xiàn)出 來）。運樣的污染會導致顯著的損失，因為一個污染的外植體會在組織培養(yǎng)過程中污染其它 樣品。運會導致產(chǎn)率和/或轉(zhuǎn)化頻率的降低，最終降低轉(zhuǎn)化效率。而且，手工切除是極其勞 動密集和耗費時間的，并且為轉(zhuǎn)化過程的規(guī)模放大設置了障礙，在運種放大中許多植物一 般必須要經(jīng)過處理來達到理想的結(jié)果。
[0010] 另外，目前的操作是有限制的，因為收獲的外植體必須要快速轉(zhuǎn)移到后續(xù)轉(zhuǎn)化步 驟，否則生命力就會喪失。典型地，一旦收獲外植體（如美國專利申請公開20050005321和 相應的PCT公開WO2005/000471)，就將其放在培養(yǎng)基上，并且在切下后數(shù)小時內(nèi)與轉(zhuǎn)化細 菌共培養(yǎng)。因此，無論什么時候進行轉(zhuǎn)化，都必須首先制備所有需要的外植體，所W它們準 備好立即轉(zhuǎn)移到解育或轉(zhuǎn)化操作。運一時間控制可能是非常復雜的和不可變動的，尤其是 如果出現(xiàn)突然的需求且外植體不能及時制備時。顯然，不能將運樣的外植體儲存幾個小時 W上是現(xiàn)有技術(shù)的一個主要缺陷。
[0011] 迫切需要能夠在沒有不可接受的總費用增加和/或用于轉(zhuǎn)化的外植體制備時間 限制的同時增加可轉(zhuǎn)化胚的有效性的方法。儲存切下的分生組織（外植體）W備后續(xù)使用 的能力是目前特別缺少的。運樣的方法將會顯著增加可轉(zhuǎn)化胚的可用性，并允許有效的計 劃和實施大規(guī)模的轉(zhuǎn)化研究。運樣的方法應該使外植體儲存能夠滿足在繁忙的操作時間或 在生產(chǎn)線無意中斷和運輸外植體的過程中（例如，運往不同地點來維持生產(chǎn)運行）產(chǎn)生的 要求。另外，由于現(xiàn)有技術(shù)中的常識是用"濕"外植體進行轉(zhuǎn)化，因此使用干燥的胚外植體 (人工種子）來進行轉(zhuǎn)化不是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。
[001引發(fā)巧概沐
[0013] 一方面，本發(fā)明提供了具有特定的含水量的種子外植體。在一個實施方案中，外植 體可W包含大約3 % -大約20 %的內(nèi)部含水量。在一個進一步的實施方案中，可W限定本文 提供的外植體為可儲存的、基本上完整的胚軸，其包含從具有本文所述的例如大約3% -大 約20 %的內(nèi)部含水量的種子中提取的至少一些分生組織。
[0014] 另一方面，本發(fā)明包括用來生產(chǎn)獲得植物的方法，包括W下步驟：(a)獲得干燥的 植物種子；和化）在一定條件下從植物種子制備外植體，在該條件下，外植體不發(fā)芽且保持 存活并具備發(fā)芽和/或遺傳轉(zhuǎn)化的能力。植物種子可W是大豆、油菜、玉米、棉花、洋蔥、胡 椒、番茄、葫蘆、水稻或者小麥的種子。
[0015] 在某些實施方案中，外植體包括改良為暴露種子的至少第一可轉(zhuǎn)化細胞的基本完 整的種子。在其它實施方案中，制備外植體的方法可W包括在種子上鉆至少第一個孔或者 在種子上刻痕。種子或者外植體包含分生組織。
[0016] 在某些實施方案中，該方法可W進一步包括W下步驟：（c)用選擇的DNA轉(zhuǎn)化外植 體的至少第一細胞，和（d)從所述細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中用選擇的DNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化再生 的植物。再生可W在最高大約35°C的溫度下進行。外植體可W進一步包含分生組織，例如 胚分生組織。在一個實施方案中，可W在不使用一種或多種例如改變外植體發(fā)育的植物生 長調(diào)節(jié)劑的情況下再生植物。
[0017] 在其它實施方案中，該方法可W包括在步驟（C)和（d)之前，在外植體不發(fā)芽的條 件下儲存外植體。在其它的實施方案中，種子或外植體可W在制備外植體之前或之后脫水。 通過該方法產(chǎn)生的可轉(zhuǎn)化和可再生的外植體也是本發(fā)明的一個方面。
[0018] 在某些實施方案中，步驟（a)或化）中的條件可W包括種子或者外植體的大約 3%-大約20%的內(nèi)部含水量。在特定的實施方案中，步驟（a)或化）中的條件可W包括種 子或者外植體的大約4% -大約16%的含水量。在某些實施方案中，可W限定該方法包括 在步驟（C)之前降低植物種子和/或外植體的含水量。在其它實施方案中，可W進一步限 定該方法包括在步驟（d)之前、同時和/或之后增加外植體的含水量。
[0019] 更進一步地，可W限定該方法為步驟（a)和/或化）在沒有液體的情況下進行。或 者，可W限定該方法為步驟（a)和/或化）在存在液體的情況下進行。在其它的實施方案 中，可W限定該方法為步驟（a)和化）在沒有液體的情況下進行。步驟（a)或化）中的條件 可W包括大約-80°C-大約60°C的溫度。在特定實施方案中，溫度可W是從大約-20°C-大 約 40〇C。
[0020] 在其它實施方案中，可W限定該方法為：步驟（b)進一步包括從植物種子中獲得 多個外植體，并根據(jù)與轉(zhuǎn)化外植體和/或從外植體再生植物的能力有關(guān)的特征從多個外植 體中選擇外植體。在特定的實施方案中，所述特征選自顏色、大小、形狀、密度、近似分析、碳 水化物含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、揮發(fā)物含量、纖維（灰分）含量、含水量、生命力、種質(zhì)、 完整性、病原體存在和光學特性。
[0021] 在某些實施方案中，可W進一步限定該方法包括在步驟（C)之前或同時消毒 (sanitizing)植物種子和/或外植體。該方法可W進一步包括通過將種子與水溶液接觸來 引發(fā)（priming)種子。水溶液可W包含如漂白劑和醇的消毒劑?？蒞進一步限定該方法包 括在步驟（C)前消毒植物種子和/或外植體。在某些實施方案中，該方法可W包括消毒外 植體，其中消毒包括應用選自漂白劑、醇（如乙醇）、臭氧、氯氣、紫外線、-20°C或更低的溫 度和暴露于高于40°C或50°C的溫度的消毒劑。
[0022] 從種子中獲得外植體的方法可W是自動化的。在某些實施方案中，該方法包括自 動化過程，其中植物種子在通過機械分離器時定向，W提供基本均勻的可再生分生植物組 織的輸出。該方法可W如圖6所示使用反向滾筒產(chǎn)生的力對大批的種子進行，W及如圖2-5 所示對單個化的（Singulated)種子進行。
[0023] 在某些實施方案中，可W通過細菌介導的轉(zhuǎn)化，或者通過微粒轟擊進行轉(zhuǎn)化方法。 可W在外植體消毒之前或之后進行外植體轉(zhuǎn)化?？蒞通過器官發(fā)生或通過直接的分生組織 轉(zhuǎn)化和隨后的芽生長進行該方法，其中，在不產(chǎn)生愈傷組織培養(yǎng)物的情況下再生轉(zhuǎn)基因植 物。
[0024] 更進一步地，該方法可W包括在步驟（C)或（d)之前儲存外植體大約1小時-大 約2年。在某些實施方案中，該方法可W包括儲存外植體大約1小時-大約24小時。外植 體在儲存后可W水化或預培養(yǎng)。
[00巧]本發(fā)明的另一方面包括用于從單個化的種子制備可轉(zhuǎn)化的植物胚組織的設備，包 括：(a)用于單個化的種子的固定器；化）用于向被固定的種子施加力使得種子分成分離的 子葉、種皮和胚組織的裝置。該設備還可包括：（C)用于將胚組織與種皮和子葉分離的裝 置，和（d)用于清洗和/或消毒組織的裝置。圖2-5顯示用于從單個化的種子制備可轉(zhuǎn)化 的植物胚組織的設備。如圖3所示，設備（1)包括用于單個化的種子（16)的固定器（2)。 如圖2所示，固定器（2)包括上部和下部種子定位器（3,4);和用于在切力點或平面巧）向 種子（16)施加力W使種子（16)分成分離的子葉、種皮和胚組織的裝置。固定器可W包括 在向種子（16)施加切力時保持種子（16)的位置的真空杯化）。圖4顯示固定器似的一 個替代實施方案，其中銀齒狀的有刻痕的桿（7)在施加切力時保持種子（16)的位置。真空 杯或銀齒狀桿反向轉(zhuǎn)動，產(chǎn)生導致種子（16)在切力點（5)處或附近分離的力。該設備還包 括用于從固定器（2)附近除去剪切的單個化種子的成分W使下一個種子可W置于其中的 真空生成器（8)或類似裝置。
[0026]圖6顯示用于大量分離胚分生組織與子葉組織和種皮組織的方法。在滾筒間產(chǎn)生 剪切。在運個例子中，一個是金屬，另一個是彈性體。干燥的種子在適合種子類型設定的縫 隙處通過運兩個滾筒之間，應用剪切使得種子裂開且種皮和子葉部分可W與需要的包含分 生組織的胚軸進一步分離，比如，利用可調(diào)節(jié)的空氣流和適當大小的篩子等。
[0027] 圖7顯示用于從子葉、種皮或其它碎屑中分離胚組織和清洗該組織的裝置。如圖 7中的分離器（13)所示，無菌空氣流過歧管（9)進入外植體傳遞和回收室（10)。氣流推動 包含胚組織的植物材料進入外植體自由飛行區(qū)（11)，材料在此分離。該設備可W進一步包 括防止外植體損失卻允許灰塵和氣流流出分離器（13)之外的外植體排除室（12)，和例如 離子發(fā)生器（17)的除靜電裝置。圖8顯示分離器（13)的一個替代實施方案，包括收集灰 塵、霉菌抱子等的帶電板（14)。圖9顯示分離器的另外一個實施方案，進一步包括用于對組 織消毒的裝置。如圖9所示，如殺菌紫外燈（15)的消毒裝置可W置于分離器（13)中，例如 外植體自由飛行區(qū)（11)中，W對外植體組織消毒。
[0028] 本發(fā)明的另一方面是從單個化的種子制備包含分生組織的可轉(zhuǎn)化和可再生的外 植體材料的方法，包括：a)使包括種皮、子葉組織和分生組織的單個化的種子受到足W破 裂種子的力；和b)從種皮和任選的子葉組織中分離分生組織，其中，該方法是機械化的方 法。通過該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物也是本發(fā)明的一方面，其中該方法進一步包括轉(zhuǎn)化和再 生外植體材料，W產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在某些實施方案中，植物可W是大豆、棉花、洋蔥、胡椒、 水稻、小麥、葫蘆、油菜或玉米植物。
[0029] 本發(fā)明還設及W下項目：
[0030] 1.一種獲得可轉(zhuǎn)化的植物組織的方法，包括：
[OOW(a)獲得植物種子訊
[0032] 化）在一定條件下從植物種子制備外植體，在該條件下，外植體不發(fā)芽且保持存活 并具備遺傳轉(zhuǎn)化的能力。
[0033] 2.如項目1所述的方法，其中，所述外植體包括改良為暴露種子的至少第一可轉(zhuǎn) 化細胞的基本完整的種子。
[0034] 3.如項目2所述的方法，其中，制備外植體包括在種子上鉆至少第一個孔。
[003引 4.如項目2所述的方法，其中，制備外植體包括在種子上刻痕。
[0036] 5.如項目2所述的方法，其中，所述基本完整的種子包含種子的分生組織。
[0037] 6.如項目1所述的方法，進一步包括W下步驟：
[003引 （C)用選擇的DNA轉(zhuǎn)化外植體的至少第一細胞。
[003引7.如項目6所述的方法，進一步包括W下步驟：
[0040] (d)從所述細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中用選擇的DNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化該植物。
[0041] 8.如項目7所述的方法，進一步限定為包括在步驟（d)之前，在其中外植體不發(fā)芽 的條件下儲存外植體。
[0042] 9.如項目1所述的方法，進一步限定為包括在制備外植體之前或之后使所述種子 和/或外植體脫水。
[0043] 10.如項目7所述的方法，進一步限定為包括在步驟（d)之前或同時增加外植體的 含水量。
[0044] 11.如項目1所述的方法，其中，所述制備外植體在沒有液體的情況下進行。
[004引 12.如項目1所述的方法，其中，所述種子或外植體具有大約3%-大約25%的內(nèi) 部含水量。
[004引 13.如項目12所述的方法，其中，所述種子或外植體具有大約4%-大約16%的內(nèi) 部含水量。
[0047] 14.如項目8所述的方法，其中，所述外植體在大約-80°C-大約60°C的溫度下儲 存。
[004引15.如項目8所述的方法，其中，所述外植體在儲存前脫水。
[0049] 16.如項目1所述的方法，進一步限定為包括從多個種子制備多個外植體，并選擇 一個或多個顯示出指示轉(zhuǎn)化外植體和/或從外植體再生植物的能力的至少第一特征的外 植體。
[0050] 17.如項目16所述的方法，其中，所述特征選自顏色、大小、形狀、密度、近似分析、 碳水化物含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、纖維（灰分）含量、含水量、生存力、種質(zhì)、完整性、病 原體存在和光學特征。
[0051] 18.如項目6所述的方法，進一步限定為包括在步驟（C)之前或同時引發(fā)植物種子 和/或外植體。
[005引 19.如項目18所述的方法，其中，所述引發(fā)種子包括將種子與水溶液接觸。
[0053] 20.如項目19所述的方法，其中，所述水溶液包含消毒劑。
[0054] 21.如項目20所述的方法，其中，所述水溶液包含漂白劑或醇。
[00巧]22.如項目1所述的方法，其中，所述植物種子是大豆、油菜、玉米、棉花、洋蔥、胡 椒、番茄、葫蘆、水稻或小麥的種子。
[005引 23.如項目1所述的方法，其中，所述制備外植體是自動化進行的。
[0057] 24.如項目23所述的方法，其中，所述制備外植體包括自動化過程，其中，將植物 種子定向使其通過機械分離器W提供基本均勻的可再生分生植物組織輸出。
[0058] 25.如項目6所述的方法，其中，所述步驟（C)通過細菌介導的轉(zhuǎn)化或者微粒轟擊 進行。
[0059] 26.如項目7所述的方法，其中，在不產(chǎn)生愈傷組織培養(yǎng)物的情況下再生所述轉(zhuǎn)基 因植物。
[0060] 27