臭氧氣體處理。W1-24小時的各種時間間隔將整個種子（切除前）和 干外植體（切除后）都暴露于PLEXIGLAS室（0SR-8臭氧發(fā)生器；OzoneSolutions,Sioux Center,IA)中的化氣體。〇3W467ppm濃度使用。在種子暴露于臭氧后，切下胚材料并測 定外植體的生命力。對大豆種子臭氧處理12小時或更少時間不會影響后來分離的外植體 的生命力，但會急劇減少外植體中發(fā)現(xiàn)的生物負(fù)擔(dān)。對切下的干外植體臭氧處理短至1-4 小時會降低外植體的健康（目P，活胚的數(shù)量）。
[0165] 使用2(K)ppm活性氯的漂白劑溶液對整個種子的切除前消毒進行另外的測試，隨 后是在50ppm活性氯的溶液中的過夜水化期（~9小時）。之后將運些種子在機械切除前 在層流柜中干燥（典型地為12-48小時）。也測試了 50%漂白劑浸泡方案的修改方案，其 中種子首先用70%的乙醇溶液漂洗。立即排出乙醇（與乙醇的總接觸時間不超過5秒）， 然后通過在50%的漂白劑中處理種子3-15分鐘進行50%的漂白劑浸泡，然后用水漂洗3 次，并干燥種子過夜，使得含水量低于8%。也可W采用紫外線對植物材料消毒。
[0166] 實施例4
[0167] 種子和外植體的水化
[016引測試了采用新的預(yù)培養(yǎng)水化/發(fā)芽策略的研究。用于該步驟的培養(yǎng)基的類型包 括"豆類發(fā)芽培養(yǎng)基"度GM;培養(yǎng)基表11)、大豆接種培養(yǎng)基（IN0 ;培養(yǎng)基表11)和制備好 的±壤桿菌對數(shù)期生長培養(yǎng)物（AGRO)?！廊罈U菌生長培養(yǎng)物在LB液體培養(yǎng)基（LB，通常也 稱為Luria-Bertani化Oth)中過夜生長至對數(shù)期，然后離屯、并再懸浮至660皿處的最終 光密度為0.25-0. 6。用于稀釋的培養(yǎng)基與大豆接種培養(yǎng)基相同。也W2mg/L(按照生產(chǎn)商 在標(biāo)簽上的推薦）的濃度測試了植物防腐劑混合物（PPM?，產(chǎn)品#P820;Phytotechnology L油oratories,化awneeMission,K巧。在4°C下，將外植體浸泡在該溶液中過夜。在與相應(yīng) 的水化培養(yǎng)基接觸過程中，進行其它改變：此接觸期間的各種溫度和相應(yīng)的培養(yǎng)基中的飽 和程度。測試的接觸時間為0-24小時。較長的接觸時間（超過4小時）中的溫度為室溫 (~26°C)、23°C或者4°C。4小時或更短的接觸時間全都在室溫下測試。作為在水化過程 中用液體培養(yǎng)基完全浸沒或基本上飽和外植體的替代方案，一些處理使用濕潤的濾紙（有 足夠的液體濕潤，但沒有飽和）。運使用WBGM或者±壤桿菌培養(yǎng)基潤濕的濾紙來完成。水 化在各種容器中進行，包括但不限于圓錐形離屯、管、刻度玻璃瓶或者PLANTC0N組織培養(yǎng)容 器（MPBiomedicals,Irvine,CA)。
[0169] 本實施例也證明了水化可W在多種包含如葡萄糖（INO)和薦糖度GM)等各種類型 的碳水化合物的培養(yǎng)基中進行。其它碳水化合物如半乳糖也可W用于水化培養(yǎng)基中。
[0170] 實施例5
[0171] 大豆外植體的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)
[0172] 如表4-9所示，±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化接著水化步驟。用包含提供草甘麟抗性的 CP4EPSPS基因和GUS報道基因的PM0N67438轉(zhuǎn)化大豆分生組織外植體。已經(jīng)在除±壤桿 菌培養(yǎng)基之外的培養(yǎng)基（即，大豆接種培養(yǎng)基（INO)或無菌蒸饋水（SDW)、豆類發(fā)芽培養(yǎng)基 度GM)或植物防腐劑混合物）中水化的外植體被除去液體，然后用無菌蒸饋水漂洗外植體 兩次。然后將外植體置于PLANTCON(如果不是已經(jīng)在其中）中。將制備好的±壤桿菌培養(yǎng) 物（如前述）加入到容器中（足夠覆蓋PLANTCON中的所有外植體）。在±壤桿菌培養(yǎng)物中 水化的外植體W保留在該培養(yǎng)物中開始，然后轉(zhuǎn)移到PLANTCON中。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程（美 國專利號7002058)將外植體在PLANTCON中超聲波創(chuàng)傷20秒。超聲波創(chuàng)傷之后，將外植體 轉(zhuǎn)移到包含剪成合適大小的濾紙片的新的PLANTCON中。使用2. 5mk5mL的大豆接種培養(yǎng) 基潤濕濾紙。外植體在23°C下、在黑暗或光照條件下共培養(yǎng)2-4天。共培養(yǎng)后，將外植體置 于固體木本植物培養(yǎng)基（WPM ;表12)的表面上，并在接種后大約第17天植入到固體木本植 物培養(yǎng)基中，持續(xù)組織培養(yǎng)實驗期的剩余時間。將幼芽轉(zhuǎn)移到用于生根的豆類生根培養(yǎng)基 度RM康蝴中?？蒞控制各種激素濃度W實現(xiàn)再生。例如，W在WPM中0. 04ppm(0. 18 yM) 的濃度使用BAP，W在BRM中大約0. 099ppm(0. 565 yM)的濃度使用IAA。已經(jīng)常規(guī)地利用 其它植物生長調(diào)節(jié)劑和濃度促進轉(zhuǎn)化和再生，例如，如美國專利第6, 384, 301號所述。
[0173] 在包括超聲波處理和共培養(yǎng)期的整個實驗期中，已經(jīng)置于測試孔板中用于初始水 化的外植體留在其中。對于運些實驗，使用液體培養(yǎng)基替代固體培養(yǎng)基，并在接種后~17 天后用新的培養(yǎng)基更換。運證明了外植體適合液體培養(yǎng)W及固體（基于凝膠的）組織培養(yǎng) 步驟。
[0174] 實施例6
[01巧]外植體切除、消毒、儲存和水化參數(shù)的比較
[0176] 后續(xù)研究測試了各種參數(shù)，包括種子儲存、切除和消毒方法和條件，外植體儲存條 件，和當(dāng)它們影響切下的分生組織材料開始生芽（S巧的能力時的轉(zhuǎn)化條件、是否被轉(zhuǎn)化W 及轉(zhuǎn)化頻率燈巧。對于種子和外植體材料中的任一種或兩種，運些參數(shù)包括切除前或切除 后的消毒步驟、儲存條件和后續(xù)組織培養(yǎng)條件，包括存在或不存在選擇。
[0177] 在研究SAG_709 (表4)中，在切除前通過浸于50 %的次氯酸鋼（漂白劑）溶液中 對整個大豆種子消毒。消毒后，沖洗種子，并干燥至低于8%的含水量。運些步驟后，如實 施例1和2中所述，制備并回收外植體。研究的參數(shù)包括：外植體材料轉(zhuǎn)化前的儲存時間長 度、儲存溫度和水化培養(yǎng)基。結(jié)果表明可W在寬范圍的儲存溫度下和多種水化培養(yǎng)基中使 用本發(fā)明的外植體獲得轉(zhuǎn)化的植物。DNA檢測結(jié)果表明基于樣本量的拷貝數(shù)為正態(tài)分布。
[0178] 在研究SAG_712(表5)中，在干切之前用氯氣對大豆種子消毒。消毒和干切之 后，儲存時間長度和水化條件發(fā)生變化。運是與美國公開20050005321和美國專利第 7, 002, 058號中描述的濕切方法相比（處理7)。
[0179] 在研究SAG_714 (表6)中，在切除前通過浸于50 %的次氯酸鋼（漂白劑）溶液中 對種子消毒。在消毒、沖洗、干燥和干切后，外植體在轉(zhuǎn)化前在各種溫度（如-20°C、4°C和 室溫）下儲存1-3天，而且水化條件也是變化的。W運種方式處理的外植體形成芽的能力 (出芽率"SF")或者形成轉(zhuǎn)化植株的能力（轉(zhuǎn)化頻率"TF")，與通過例如美國專利申請公 開20050005321中描述的"濕切"法制備、然后干燥并儲存（處理7和處理8)的外植體進 行比較。
[0180] 在從水化或吸水的種子（在研究SAG_714-表6的處理7和8 W及研究SAG_762-表 8的處理1和2中被稱為"濕切"）回收的外植體中也證明了轉(zhuǎn)化，但在其中，外植體適當(dāng)脫 水。濕切法在美國公開20050005321和美國專利第7002058號中描述。通過運種方法制備 外植體的典型過程如下：
[0181] 1)用無菌水或次氯酸鋼溶液（范圍從化pm-~3000化pm的活性氯，包括50ppm和 200ppm的活性氯）沖洗干燥種子3-20分鐘。然后排出液體。
[018引2)大約2小時后，施加再水化培養(yǎng)基5-24小時。運種再水化培養(yǎng)基可W是BGM、無菌去離子水、無菌或清潔的自來水，或稀釋消毒劑溶液，如活性氯含量為50-10(K)ppm的 次氯酸鋼。
[0183] 3)再水化培養(yǎng)基之后，種子可W立即切除W分離胚外植體（通過機械或手工方 法），或者可W進一步用水或其它稀釋消毒劑，如活性氯含量為50-10(K)ppm的次氯酸鋼，沖 洗15分鐘。
[0184] 4)切除和回收之后，外植體通過在空氣流下的淺盤里展開而干燥并準(zhǔn)備用于儲 存。運通常在清潔空氣組織培養(yǎng)柜中進行。外植體一般允許干燥~18-24小時。
[0185] 5)將干燥的外植體儲存（通常在密封的50毫升錐形管中）。轉(zhuǎn)化開始前的儲存 期可W是幾分鐘到幾周或幾個月。儲存期間的溫度條件可W是從室溫到-80攝氏度。
[0186] 6)在需要的儲存后，如實施例4中所述水化外植體用于轉(zhuǎn)化。
[0187] 研究716 (表7)測試了干切后的7天儲存期對外植體形成芽的能力的影響。
[018引研究762(表8)測試了 7周的儲存期對切下的外植體材料形成芽的能力的影響。 儲存多達7周的干切的胚能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
[0189] 對上面列出的研究的芽形成和轉(zhuǎn)化頻率的總體概括如表9所示。結(jié)果表明干切 W及濕切（并且然后干燥）的大豆外植體保持存活，保留出芽和成株的能力，且可W被異 源DNA成功轉(zhuǎn)化，甚至將切下的胚在多種溫度下和多種類型的水化培養(yǎng)基中干燥儲存長達 8周也是如此。干切并儲存的外植體或濕切、干燥并儲存的外植體的芽形成頻率（S巧和轉(zhuǎn) 化頻率燈巧與根據(jù)前述方法（美國公開20050005321)未儲存的外植體相比更加有利。也 通過Southern分析或通過RO代的INVAD邸分析（例如，Mein等人，2001)檢測了引入的轉(zhuǎn) 基因（例如CP4)的拷貝數(shù)和存在及載體骨架序列（例如oriV)的存在（表5-9)。Rl植物 的DNA分析產(chǎn)生了證明穩(wěn)定的和可遺傳的轉(zhuǎn)化的相同結(jié)果。
[0190]









[0204] 在±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中變化的另一個參數(shù)是±壤桿菌培養(yǎng)基開始時間的變化， 和超聲波創(chuàng)傷的開始。在一些研究中，不是等待1小時或更長時間進行干外植體水化，而是 一經(jīng)浸入水化培養(yǎng)基后立即開始超聲波創(chuàng)傷步驟。可選擇地，一些處理接受±壤桿菌培養(yǎng) 物解育開始推遲1-2天。在水化步驟之后并不是立即接種，而是在延緩期將運些外植體放 在濕潤的濾紙上，然后完成接種和超聲處理步驟。在一種不同的處理中，從程序中完全除去 超聲波創(chuàng)傷步驟，因為外植體正在被±壤桿菌培養(yǎng)物潤濕的濾紙上水化。
[0205] 也測試了選擇壓力（例如，接觸草甘麟）開始的延遲。運些研究不是在接種后2-4 天將外植體轉(zhuǎn)移到含有選擇化合物的固體培養(yǎng)基上，而是接受不含草甘麟的液體WPM另外 48小時，或在轉(zhuǎn)移到含有選擇化合物的固體WPM上之前放置1周，W終止或至少阻滯非轉(zhuǎn)化 細(xì)胞的生長。
[0206] 也測試了±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的替代方案。干切的外植體用魏豆根瘤菌 a?hizobiumIeguminosarum)菌株化 2370LBA&RL2048G，PM0N96033 接種。根瘤菌 巧hizobium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化流程與±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化流程相似，除了用根瘤菌代替細(xì)菌菌 株W外。
[0207] 也測試了細(xì)胞分裂素6-節(jié)氨基嚷嶺度AP)，其作為±壤桿菌培養(yǎng)接種培養(yǎng)基（也 稱為大豆接種培養(yǎng)基，IN0)中的添加劑（例如，McC油e和Martinell, 1993)。
[020引實施例7
[0209] 棉花外植體的制備和轉(zhuǎn)化
[0210] 在切下后干燥并干燥儲存30天或更長時間的切下的棉花（CVSTN 474)分生組織 外植體，在再水化并用±壤桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化之后是能存活的。棉花分生組織轉(zhuǎn)化的流程基 本上遵循McC油e和Martinell (1993)的方法。按照McC油e&Martinell (1993)切除并制備 種子，不同之處是將切下的胚展開，并放在一個開放的容器中直至干燥W外。儲存條件和種 子預(yù)消毒、再水化、±壤桿菌接種、共培養(yǎng)和組織培養(yǎng)程序與對于大豆所述基本相同。與大 豆結(jié)果一致，在用外源DNA轉(zhuǎn)化分生組織之后在培養(yǎng)的棉花外植體上觀察到芽和嫩葉。
[0211] 實施例8
[0212] 使用的培養(yǎng)基 郵1引表10:豆類消毒培養(yǎng)基度GM)
[0214] 化合物海升的量
[021引 BT傭備液禁IiO毫子- BT傭備液粧 ID蒙井
[0216] 投T儲備液#3 3毫升 BT儲備液#4 3毫升 段T儲備液#5 1毫升 篇糖 25克
[0引7] 調(diào)整到抑5.8
[0引引使用前添加： 每IL
[0引引頭抱嚷目虧（50暈克/毫升） 2. 5毫升
[0220] 殺真菌劑儲備液 3毫升
[0221] 用于豆類發(fā)芽培養(yǎng)基的BT儲備液
[0222] 化儲備液1 (1升）
[0223] KNO, 50.5 克 NH4NO3 -24.0 克 MgS〇4*7H乂） 49,3 克 1。時〇4 2:.7 克
[0224] 化儲備液2(1升）
[022引CaCl2*2H20 17. 6克
[0226] 化儲備液3(1升）
[0227] H:;B03 0,62t MnSCM!:;0 1.69 .屯 ZnS〇47H2〇 0.86 克 KI 0.083 克 NaMo〇4*2H:0 0,072 克 打iS〇4*5化O 0.25毫升1.0毫克/毫升的儲備液 (:〇(;:!4*6!--!2〇 0.25毫升1,0毫克/毫升的儲備液
[022引化儲備液4(1升）
[0229] NazEDTA 1. 116 克
[0230] FeS〇4*7H2〇 0. 8：34 克
[0231] 化儲備液5巧00毫升）
[0232] 硫胺-肥1 0. 67克
[0233] 煙酸 0. 25 克
[0234] 化唉醇-肥1 0. 41克
[0235] 殺真菌劑膽備液（100毫升）
[0236] 百菌清殺菌劑（Chlorothalonil)度ravo) 75%WP1. 0 克
[0237] 克菌丹（Captan) 50 %WP1.0 克
[023引添加無菌蒸饋水到100毫升
[0239] 表11大豆接種培養(yǎng)基（INO)
[0240] 每升含量 儲備裴#i(主要物） I毫升 B5儲備液粧（氯化媽） 1毫升 B5儲備液#3 (次要物） 1毫升 B5儲備液#5 (鐵） 1毫升 硝酸鐘(kn〇3) 1克 葡萄糖 30克 MES 3.9 克
[0241] 加水到IL
[024引 起始抑：用KOH調(diào)整到5. 4
[0243] 高壓滅菌
[0244] B5儲備液#4 (維生素）（F.S. ) 1毫升
[0245] 室溫儲存
[0246]B5儲備液#1 每升含量：
[0247] TC水 750毫外 硫酸鎮(zhèn) 100克 硫酸矮 3 3.食龍 無水蹲酸二氨鋼 ㈱兔
[024引攬拌直至完全溶解
[0249] 加TC水至1升
[0250] B5儲備液#2 每升含量
[0巧1] TC水 750毫升
[0巧引氯化巧 60克
[0巧3] 攬拌至完全溶解
[0254] 用TC水加至1升 [0 巧 5] B3傭備激鮮； 每升含量 TC水 750毫升 瑚酸 0.3克 硫酸短 1兔 毛水合硫酸辭 0。2克 鴻化鐘 0.075克 二水合銅酸銅 化025克 硫酸銅（1毫克/毫升） 2.5毫升 氯化鞋(1毫克/毫升） 2.5毫子-
[0巧6] 攬拌直至完全溶解
[0257] 用TC水加至1升[0巧引 B5儲備液斜 每升含量 TC水 八0毫井 肌醇（Myo-ln