ositel) 10 克 嫩駿 化1兔
[0 巧 9] 地咳醇鹽酸鹽 0.1克 硫胺鹽酸鹽 1克
[0260] 攬拌直至完全溶解
[0261] 用TC水加至I升
[0262] B5儲備液#5 每升含量
[0263] TC水 750 毫升
[0264] 維爾締（Sequestrene) 2. 8 克
[0265] 攬拌直至完全溶解 [026引用TC水加至1升
[0267] 表12木本植物培養(yǎng)基（WPM)
[0268] 用75uM草甘憐作為選擇劑
[0269] 化合物： 每升含量 WPM鹽（Phytociie姐） 2.41A 篇糖 20.0克 葡萄糖酸釣巧igma) 1。29克 Clearys殺真茵削（Cariin) 0.03 克 pH 5 6 瓊脂凝膠巧igma) :4.0兔
[0270] 局壓滅園
[0271] 襲節(jié)西林(40毫克/毫升） 5.0毫升 眷卡西林(100毫克/毫升） 1.0毫升 頭跑噓巧(50毫克/毫井） 4.0毫升 草甘禱(O.SMFS儲備液） 0.15毫升
[027引表13BRM(豆類生根培養(yǎng)基）（4升）
[0273] M沒盤 叛技兔
[0274] R醇（Myo-InoskoU 0.40 克 豆類生根培養(yǎng)基維生素儲備液 8毫升 L半膚氨酸^0毫克/毫升） 40毫升 篇搪(超純） 120克
[0275] pH5. 8
[027引洗過的瓊脂 32克
[0277] 高壓滅菌后添加：
[0278] BRM激素儲備液 20. 0毫升
[0279] 替卡西林/克拉維酸 4. 0毫升
[0280] (100毫克/毫升替卡西林）
[0281] 豆類生根培養(yǎng)基維生素儲備液（1升）
[0282] 甘義酸 ！.0克 煙酸 0.25克 化咳轉(zhuǎn)鹽酸茲 0.巧克 硫胺鹽酸鹽 0.05克
[0283] BRM激素儲備液（1升中的量）
[0284] 6. 0 毫升IAA(0. 033 毫克 / 毫升）
[0285] 4. 0 毫升SDW
[0286] 實施例9
[0287] 高通量單個種子切除
[028引也可W通過使用單個化系統(tǒng)提供單個（單個化的）種子用于加工來完成干切過 程。在單個化之后，通過真空杯系統(tǒng)操作種子（例如，大豆種子）來定位種子。之后將種子 置于一組真空杯之間，種子在杯之間夾緊，通過使用一股高壓空氣或者類似的手段來脈沖、 噴沙或空氣沖擊種子的種皮，W除去種皮。如圖2-3所示，將種子（16)放置在下部的真空 杯（6)上，通過降低上部的真空杯（6)來夾緊種子。然后種子和兩個真空杯W相反的方向 旋轉(zhuǎn)，W沿種子楠圓軸中屯、產(chǎn)生剪切力點或面巧），從而便于種子在楠圓軸上裂開。一旦裂 開，就升起上部的真空杯，和/或打開一個真空生成器（8)，允許操作外植體及其與種子其 它部分的分離。然后可W移動外植體到需要的位置，如管或孔板。在圖4-5中，使用類似的 概念，包括用銀齒狀的金屬表面幫助旋轉(zhuǎn)種子而不滑移。該系統(tǒng)包括真空放置單元和傳感 器（pickup)單元。盡管外植體除了胚組織還可W包括一些子葉組織，但它包括胚的至少一 些分生組織區(qū)，使得外植體一般可W在組織培養(yǎng)生長條件開始的12周內(nèi)生芽。
[0289] 該方法的目的是在干燥條件下、在單個種子的高速基礎(chǔ)上除去種子的分生組織， 然后將外植體放置于合適的容器中，用于另外的轉(zhuǎn)化步驟。另外的外植體處理（如消毒、篩 選和水化）也可W在從種子中除去外植體和遞送到容器運兩個步驟之間進行。另外的處理 也可W包括對外植體的希望的性狀和特征預(yù)先成像、消毒和轉(zhuǎn)化處理。另外，種子也可W在 單個化和外植體切除步驟前根據(jù)生存力和適應(yīng)力成像和分選。運樣的允許高通量外植體切 除的方法可W通過平行系統(tǒng)更加有效地進行。
[0290] 圖2-5和7-9顯示用于從種子切除可轉(zhuǎn)化的胚組織的機械分離器和清潔器/滅菌 器的實施方案。圖2-5顯示在施加剪切力時用于固定單個種子的機構(gòu)，圖7-9顯示使用例 如離子生成器、用于收集霉菌、灰塵等的帶電板或紫外線殺菌燈機械清理和消毒外植體材 料的實施方案。
[0291] 參考圖2-5,其主要說明用于從單個化的種子（16)切除胚組織的機械設(shè)備的例 子，如上所述固定單個化的種子W施加剪切力。在圖2-5中，當(dāng)單個種子相對于它們放置 或夾緊時，第一和第二真空杯（6)與第一和第二刻痕桿（7)向相反方向轉(zhuǎn)動，導(dǎo)致單個種 子破裂。也可W采用固定單個化種子的其它裝置，如允許施加合適的剪切力的滾筒或格柵 (gate)。
[0292] -旦種子破裂并切下可轉(zhuǎn)化的胚組織，即可W將包括胚組織的外植體（例如，圖 1)移動到需要的位置或容器中，立即使用或在合適的條件下儲存，例如上文的實施例6所 述。運種從單個化種子上切除外植體材料的方法允許自動化高通量制備適量的可轉(zhuǎn)化的胚 組織。
[0293] 清理、篩選、消毒和選擇程序可W應(yīng)用于大批的非切除的種子，或者在單個化之 后，或者它們可W應(yīng)用于切除后的外植體材料。圖7-9顯示在外植體材料上進行運些操作 的清潔器/消毒器的例子。
[0294] 實施例10
[0295] 高通量外植體制備的疊置式設(shè)備
[029引如圖10所示，將種子放置在上部的機械設(shè)備（例如，Cmiinman?脫殼機；參見 實施例1)中W被分裂，也在例如實施例9和圖6中描述。很多的輕質(zhì)材料，如種皮，在切除 過程中通過抽吸分離，而如子葉片和外植體等較重的種子部分落下，用于進一步從其它外 植體材料中分離子葉。在運種"疊置式"構(gòu)造中（圖10-11)，較重的部分直接落入自動分離 器中，自動分離器例如利用震動網(wǎng)篩和重力通過大小排阻從外植體中分離子葉（例如，通 過化IP陽ROFFICETEST邸或類似的部件實現(xiàn)）?？諝饬饕部捎糜趶男枰牟牧现形セ?塵和其它輕質(zhì)種子碎屑，W清洗和/或消毒材料（例如圖7-9,圖11)。也分別描述了運些 機器和方法（例如，實施例9)，然而用于連續(xù)流通的它們的疊置式組合代表了運些方法和 設(shè)備的進一步的改進。
[0297] 實施例11
[029引長時間儲存的干切大豆外植體的轉(zhuǎn)化
[0299] 干切的外植體在-20°C至4°C下儲存最長達(dá)20個月，然后測試其存活力、可轉(zhuǎn)化性 和活力。無論相比對照處理（處理1)的儲存條件或者溫度如何，外植體的存活力和總活力 似乎在所有處理組中均相似。運證明能夠儲存干切外植體幾乎2年而沒有損害。在接種4 天后測試每種處理的外植體的瞬時GUS表達(dá)。表14顯示各種處理之間分生組織特異性gus 表達(dá)的比較，W0-9級打分，0表示沒有可見的表達(dá)，9表示在胚的所有3個分生組織中都大 量表達(dá)。運證明了干切的外植體不僅可W在各種條件的長期儲存后存活而沒有明顯的活力 喪失，而且保持了對于轉(zhuǎn)化的適應(yīng)力。因此現(xiàn)在可W在非峰值期間切下大量的外植體W備 后用，運代表了在計劃和實施轉(zhuǎn)化研究中顯著的、可能的費用節(jié)約和靈活性。
[0300] 表14 :儲存持續(xù)時間和溫度對外植體轉(zhuǎn)化的影響
[0301]
[0302] 實施例12
[0303] 合適的預(yù)接種培養(yǎng)（"預(yù)培養(yǎng)"）組合物和條件的確定
[0304] 當(dāng)用±壤桿菌接種用于轉(zhuǎn)化時，干切的外植體很可能仍處于半休眠狀態(tài)。因此， 開發(fā)了一種在±壤桿菌接種前刺激干切外植體的代謝活性的方法，用于增強他們的轉(zhuǎn)化能 力。即，通過操縱干外植體的生物學(xué)，可W使每個外植體中種系陽性事件的百分比增加2-10 倍。
[030引在23°C和/或28°C溫度下，W及在1-5天的不同光照/黑暗條件下，測試幾種培養(yǎng) 基組合物-BGM(表10)、INO(表11)或OR(表巧）的增強轉(zhuǎn)化能力的能力。預(yù)培養(yǎng)步驟之 后，將外植體集中在一起，然后根據(jù)實施例5中所述的方法用±壤桿菌培養(yǎng)物接種。在外植 體上進行的瞬時GUS表達(dá)試驗表明在共培養(yǎng)2天和4天后在預(yù)培養(yǎng)處理中GUS活性增強。
[0306] 在某些預(yù)培養(yǎng)實驗中，由于真菌感染導(dǎo)致植物損失，但是與未預(yù)培養(yǎng)的干切的外 植體相比，在BGM潤濕的濾紙上、23°C下、黑暗中預(yù)培養(yǎng)5天的干切的外植體的總轉(zhuǎn)化頻率 似乎是最高的。由于真菌污染導(dǎo)致的損失可W通過在預(yù)培養(yǎng)和/或共培養(yǎng)步驟中使用諸如 各為大約1 %的BRAVO75和Captan50的抗真菌劑來減輕。用CP4探針對本實施例中產(chǎn)生 的植物進行的Southern印跡和INVAD邸分析證實了運些植物的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)。
[0307] 表15 :大豆器官生成（OR)培養(yǎng)基 [030引 化合物; 垂年業(yè);…- MS鹽 17.2g 3X次要MS鹽 40期1 煙酸（1毫克/毫升） 4 ml 化。多醇鹽酸鹽（1毫克/毫升）4勘1 硫胺鹽酸鹽(]毫克/毫升） 46.Sml 篇據(jù)(起純） 120 g 肌轉(zhuǎn)（細(xì)胞培養(yǎng)級） ，4〇g pH5.8 洗過的瓊脂 32 g.
[0309] 高壓滅菌后添加：
[0310] 脯氨酸化5m儲備液） 19. 2ml
[031。 TSG/0R激素儲備液 40.Oml
[0312] 表16 :預(yù)培養(yǎng)對于干外植體的影響；使用PM0N10343的轉(zhuǎn)化頻率
[0314] 重復(fù)研究來比較兩個構(gòu)建體：pM0N101343,其包含1個含有提供草甘麟抗性的CP4 基因和化iV復(fù)制起點的T-DNA;和PM0N107350,其包含1個在載體骨架上含有提供草甘麟 抗性的CP4基因和化iR復(fù)制起點（例如，參見，US20070074314)的T-DNA。如表17所示， 與未預(yù)培養(yǎng)的干外植體的轉(zhuǎn)化頻率相比，干外植體的預(yù)培養(yǎng)再次提高了轉(zhuǎn)化頻率。
[0315] 表17 :對于干切外植體的預(yù)培養(yǎng)的另外的研究
[0316]
[0317]如表18所示，當(dāng)在使用機器人系統(tǒng)自動除去和添加的液體再生培養(yǎng)基（除瓊脂凝 膠（AgarGeU外，表12的培養(yǎng)基）中培養(yǎng)外植體時，預(yù)培養(yǎng)的干切外植體也產(chǎn)生了較高的 轉(zhuǎn)化頻率。具有預(yù)培養(yǎng)步驟使用液體再生培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化頻率似乎甚至更高。液體培養(yǎng)基中 的濕切的外植體似乎由于污染而具有低轉(zhuǎn)化頻率。
[031引預(yù)培養(yǎng)令人驚奇地增加了轉(zhuǎn)化能力并且提高了轉(zhuǎn)化一致性。運樣的提高可減少工 業(yè)規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆植株的生產(chǎn)過程中的變異性，并且可W在選擇劑一般產(chǎn)生較低轉(zhuǎn)化 頻率的情況下提高轉(zhuǎn)化頻率。
[031引表18 :干切的外植體的預(yù)培養(yǎng)；固體和液體培養(yǎng)基的比較
[0321] 實施例13
[0322] 使用干大豆外植體和壯觀霉素選擇生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆植物
[0323] 干的活種子（適當(dāng)儲存的高質(zhì)量大豆種子包含大約10-12%的內(nèi)部含水量）用無 菌水或次氯酸鋼溶液（從化pm-~3000化pm的活性氯，包括50ppm-20化pm的活性氯）沖 洗3-20分鐘。然后排出液體。運個過程提高內(nèi)部含水量到大約16%。在此簡短的表面消 毒步驟之后，在商業(yè)種子干燥器中用除濕空氣流（溫度控制到大約60-90°巧降低種子的 內(nèi)部含水量到低于8%。
[0324] 在需要的儲存后，將外植體水化用于轉(zhuǎn)化。運一步驟中所用的培養(yǎng)基類型可W 不同，包括"豆子發(fā)芽培養(yǎng)基"度GM;表10)、大豆接種培養(yǎng)基（IN0 ;表11)和制備的對數(shù) 期±壤桿菌生長培養(yǎng)物（AGRO)?！廊罈U菌生長培養(yǎng)物在LB液體培養(yǎng)基（LB，通常也稱為 Luria-Bertani化Oth)中生長過夜達(dá)到對數(shù)期，然后離屯、并再懸浮至在660nm處的最終光 密度為0.25-0. 6。用于稀釋的培養(yǎng)基與大豆接種培養(yǎng)基一樣。水化溫度和持續(xù)時間也可W 不同，某些實驗中將外植體在4 °C下浸泡于運些溶液中的一種中過夜。在接觸相應(yīng)水化培養(yǎng) 基的持續(xù)時間、接觸過程中的溫度和相應(yīng)培養(yǎng)基的飽和程度方面進行其它變化。測試的接 觸時間為0-24小時。較長接觸時間（超過4小時）的水化在室溫（~26°C)、23°C或者4°C 下進行。4小時或少于4小時的接觸時間都在室溫下測試。作為在水化過程中用液體培養(yǎng) 基完全浸沒或基本上飽和外植體的替代，一些處理使用濕潤的濾紙（有足夠的液體濕潤， 但沒有飽和）。運用WBGM或者±壤桿菌培養(yǎng)基潤濕的濾紙來完成。水化在各種容器中進 行，包括但不限于錐形離屯、管、刻度玻璃瓶或者PLANTC0N組織培養(yǎng)容器（MPBiomedicals, Irvine，CA)。
[0325] 水化后，在適合的±壤桿菌培養(yǎng)物的存在下，對外植體進行簡短的超聲處理。共培 養(yǎng)和后續(xù)步驟在光照化rcival培養(yǎng)箱中在大約23-25°C的溫度下進行2-5天（16小時光 照，8小時黑暗，光強度為至少5yE-200y巧，且可W在最高大約35°C下進行。已知光促進 基因從±壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。在水化過程、共培養(yǎng)步驟和/或接下來的共培養(yǎng)過程 中，W15毫克/升-1000毫克/升的濃度應(yīng)用作為選擇劑的壯觀霉素。
[032引如表19所示，用W下構(gòu)建體常規(guī)回收表型陽性的芽（植物）：pM0N96999,其包含 1個含有addA基因和化iV復(fù)制起點的T-DNA;或構(gòu)建體PM0N101343,其包含1個含有CP4 基因和化iV復(fù)制起點的T-DNA。在存在壯觀霉素的情況下，"表型陽性"的意思是芽為綠色 且堅實，而表型陰性的芽如果完全伸長，則較弱且變白（白色）。壯觀霉素或草甘麟W表19 所示的濃度在再生培養(yǎng)基（固體或者液體）中使用。
[0327]表19 :使用草甘麟或壯觀霉素作為選擇劑的干大豆外植體的轉(zhuǎn)化頻率。
[0329] 壯觀霉素也作為用于干切大豆胚轉(zhuǎn)化的選擇劑，使用W下條件：在INO培養(yǎng)基中 水化1小時，在IN0、ISOppm壯觀霉素中共培養(yǎng)4天，在固體或液體WPM(表12,加入或不加 瓊脂）上培養(yǎng)。可W使用23-25或28°C、最高大約35°C的溫度。在±壤桿菌接種8-10周 后，收獲表型陽性的芽，并在含15化pm壯觀霉素的固體BRM(表13)上誘導(dǎo)生根。在兩個不 同的研究中獲得25. 05%和19. 27%的非常高的轉(zhuǎn)化頻率。沒有用細(xì)胞分裂素樣的植物生 長調(diào)節(jié)劑（如TDZ或BA巧處理本研究中所用的外植體，因而證明了在缺乏運樣的植物生長 調(diào)節(jié)劑的情況下可W獲得高轉(zhuǎn)化頻率。
[0330] 實施例14
[0331] 用干大豆胚、壯觀霉素和液體培養(yǎng)基產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆植物
[0332] 在運些研究中，外植體在開始時水化并最終在上述具有液體覆蓋層的WPM固體培 養(yǎng)基或WPM液體培養(yǎng)基上再生。在接種6周后將所有外植體轉(zhuǎn)移到含有OasisiSWedge System(Smithers-OasisUSA;Kent，OH)和簡化液體培養(yǎng)基（含有 0. 25 毫克 / 升IBA的 0. 5 克/升WPM)的淺盤上。2-4周后，獲得生根和發(fā)芽的R。植物。在所有的研究和處理中，在 如表20所示的相應(yīng)培養(yǎng)基中進行外植體的初始水化1小時。除了草甘麟被15化pm的壯觀 霉素代替外，液體培養(yǎng)基與表12中相同。在液體覆蓋處理中，使用固體和液體培養(yǎng)基；當(dāng)它 們在組織培養(yǎng)過程中如表21所示的特定時間置于固體培養(yǎng)基上時，將液體培養(yǎng)基分配在 外植體的頂部。運作為一種類型的培養(yǎng)基更新來進行，并且不需要將外植體從舊培養(yǎng)基轉(zhuǎn) 移到新培養(yǎng)基。在對照處理中，將外植體表面接種于固體WPM培養(yǎng)基上（表12)。除了草甘 麟由ISOppm的壯觀霉素代替外，幼芽在如上所述的固體BRM培養(yǎng)基上收獲并生根。
[0333] 表20 :給定水化條件下的轉(zhuǎn)化頻率
[0335] 表21:液體覆蓋時間安排
[0336]
[0337]實施例