每個子葉，例如多達1/4的子葉。運些外植體被認為是基本相似的，因為它們均可產(chǎn)生穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化的植物。然而，外植體應該包含胚的分生組織區(qū)中的至少一部分，使得外植體一般可 在組織培養(yǎng)生長條件開始后的12周內(nèi)生芽。
[0121] 外植體可W從水化的種子、干燥儲存的種子、干燥水化的外植體的部分水化中回 收，其中，"水化"定義為任何導致種子和/或外植體的含水量增高的動作，不限于待水化的 種子和/或外植體是否已經(jīng)脫水。外植體可來自"引發(fā)的"種子；即，已經(jīng)開始發(fā)芽，但已適 當?shù)靥幱谕顟B(tài)，等待有利條件W完成發(fā)芽過程的種子。本領域的技術人員能夠使用不 同的水化方法并且優(yōu)化轉(zhuǎn)化前的解育時間長度。產(chǎn)生的新的外植體是可儲存的，并且在提 供適當?shù)臈l件時可W發(fā)芽和/或被轉(zhuǎn)化。因此，新的、干燥的、可儲存的分生組織外植體可 稱為人工種子。
[0122] 運樣的水化和引發(fā)條件的例子如下文的表4-8所示。例如，表4說明將外植體切 下后置于含有5毫升無菌蒸饋水（SDW)的15毫升錐形管中4小時。機器切除的典型方案， 如"SOP"處理，可W包括將種子置于2(K)ppm活性氯的漂白溶液中15分鐘，然后是不接觸液 體的2小時，隨后在豆類發(fā)芽培養(yǎng)基度GM)或50ppm活性氯的漂白溶液中水化過夜。
[0123] 切下后，本領域的技術人員可W根據(jù)公開的方法在隨后的使用前儲存外植體。干 燥、儲存和使種子發(fā)芽的方法和參數(shù)是本領域中已知的（例如，Senaratna等人，1983 ; V&rtucci和Roos, 1990;化ai等人，1998)。需要時可W使用運些儲存條件的修改條件儲存 本發(fā)明的切下的分生組織?？蒞按所需使用任何運樣的條件，包括在例如大約-80°C-大約 60°C的溫度下。尤其發(fā)現(xiàn)大約-20°C到室溫的溫度運行良好，但本發(fā)明并不限于運些溫度。
[0124] 實施例中所述的數(shù)據(jù)表明，例如，儲存的包括分生組織的種子外植體可W保持存 活并且可用于在種子切下后的幾周或幾個月的時間里進行遺傳轉(zhuǎn)化和再生（例如，實施例 11和表14)。切除、滅菌、儲存、水化、再脫水和轉(zhuǎn)化參數(shù)的操作允許開發(fā)有效的自動化高通 量植物轉(zhuǎn)化方案。
[0125] 獲取和處理外植體的許多參數(shù)可W變化。在一個實施方案中，切除方法可W是手 工的；在一個替代實施方案中，通過自動化方法進行切除。在其它實施方案中，可W通過將 種子或外植體與液體殺菌劑接觸進行滅菌。在一個替代實施方案中，種子或外植體可W與 氣體殺菌劑接觸。在一個替代實施方案中，種子或外植體可W與如紫外線的照射殺菌劑接 觸。圖7-9顯示用于運些滅菌方法的設備。在一個替代實施方案中，可W通過將種子或外 植體進行短時間高溫處理來對種子或外植體滅菌，從而降低種子或外植體表面上如外來細 菌和真菌的生物污染物的活力，而不降低種子或外植體的活力。運可W在高于40°C的溫度 下實現(xiàn)；優(yōu)選溫度是40°C-9(rC。溫度可W通過例如壓力加熱空氣或水蒸汽提高。運些溫 度可W由化y-AirInc. (Sunbury，化io,USA)生產(chǎn)的干燥機提供。在另一個實施方案中， 切除時種子的含水量可W變化。在另一個實施方案中，切除時種子的溫度可W變化。在其 它實施方案中，切除后的儲存參數(shù)可W變化。例如，在一個實施方案中，外植體儲存的相對 濕度可W變化。在另一個實施方案中，外植體儲存的溫度可W變化。在其它的實施方案中， 儲存外植體的培養(yǎng)基的組成可W變化?？蒞控制的其它參數(shù)包括水化和再水化培養(yǎng)基的組 成、解育溫度、時間長度和轉(zhuǎn)化方法等。
[0126] 已開發(fā)了各種方法來將基因轉(zhuǎn)移到植物組織中，包括高速微粒轟擊、顯微注 射、電穿孔、DNA直接攝取和細菌介導的轉(zhuǎn)化。已知介導植物細胞轉(zhuǎn)化的細菌包括根瘤 菌科（Miizobiaceae)的許多種，包括但不限于：上壤桿菌（Agrobacteriumsp.)、中 華根瘤菌（Sinorhizobiumsp.)、中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumsp.)和慢生根瘤菌 度radyrhizobiumsp.)(例如，Broothaerts等人，2005 ;美國專利申請公開 20070271627)。 盡管分化的組織也可W用來進行瞬時和穩(wěn)定的植物轉(zhuǎn)化，但是運些轉(zhuǎn)化的祀標通常是未分 化的愈傷組織。
[0127] 細菌介導的基因遞送（例如，±壤桿菌介導的，美國專利5, 563, 055、5, 591，616、 5, 693, 512、5, 824, 877、5, 981，840)可W向從種子上切下的活分生組織中的細胞內(nèi)進行，諸 如大豆（例如，美國專利6, 384, 301)。該分生組織區(qū)域可W在如除草劑草甘麟的選擇劑存 在下進行培養(yǎng)。運一步驟的結果是尚未導入外源遺傳結構的大部分細胞的終止或至少生長 延遲，W及由包括轉(zhuǎn)化的分生細胞在內(nèi)的一小簇細胞引起的芽生成的同時誘導。分生組織 也可W在單獨的或組合的其它選擇劑的存在下培養(yǎng)，包括但不限于植物生長素樣除草劑， 如麥草畏或2,4-D、MCPA、草下麟、乙酷乳酸合酶抑制劑、原化嘟原氧化酶抑制劑、和徑基苯 基丙酬酸雙加氧酶抑制劑、新霉素、卡那霉素、己龍霉素、G418、氨基糖巧類、壯觀霉素、鏈霉 素、潮霉素B、博萊霉素、腐草霉素、橫胺、鏈絲霉素、氯霉素、甲氨蝶嶺、2-去氧葡萄糖、甜菜 醒、S-氨乙基k半脫氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、芐基腺嚷嶺-N-3-葡糖醒 酸酶。Miki和M地U曲，2004已公開了各種選擇性標記和提供對其抗性的基因的例子。在本 發(fā)明的一個實施方案中，使用賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的選擇性標記氨基糖巧腺巧酷轉(zhuǎn) 移酶（aadA)的編碼區(qū)（例如，美國專利5, 217, 902 ;或Sandvang, 1999)。
[0128] 本領域中公知，可W使用其它植物轉(zhuǎn)化方法，如Miki等人，（1993)所述，包括 使用微粒轟擊（例如，美國專利5, 914, 451 ;McC油e等人，1991 ;美國專利號5, 015, 580、 5, 550, 318、5, 538, 880)。
[0129] 提供對一種或多種運些除草劑的耐受性的未修飾的和修飾的蛋白質(zhì)分子及其相 應的核酸分子在本領域中是公知的。下面舉例說明，并在本文中引入作為參考：
[0130] a)編碼草甘麟耐受性的序列包括提供草甘麟耐受性的5-締醇丙酬酷莽草酸 (enolpy;ruvylshikimate)-3-憐酸合酶巧PSPS;美國專利5, 627, 061、美國專利RE39, 247、 美國專利6, 040, 497、美國專利5, 094, 945、W004074443和W004009761)、草甘麟氧化還原酶 (G0X;美國專利5, 463, 175)、草甘麟脫簇酶（W005003362和美國專利申請20040177399)和 草甘麟-N-乙酷基轉(zhuǎn)移酶（GAT;美國專利申請20030083480);
[0131]b)麥草畏單加氧酶值MO,由(MmC編碼），其提供對植物生長素樣除草劑如麥草 畏的耐受性（美國專利申請20030115626、20030135879 ;Wang等人，1996 !Herman等人， 2005)；
[0132]C)麟絲菌素乙酷轉(zhuǎn)移酶（phosphinot虹icinacet}dtransferase)O^ar)，其 提供對麟絲菌素或草下麟的耐受性化S. 5, 646, 024、U.S. 5, 561，236、EP275, 957、 U.S. 5, 276, 268、U.S. 5, 637, 489、U.S. 5, 273, 894);
[0133]d) 2, 2-二氯丙酸脫面素酶，其提供對2, 2-二氯丙酸（茅草枯值alapon))的耐受 性（W09927116);
[0134]e)乙酷徑酸合酶或乙酸乳酸合酶，其提供對如橫酷脈、咪挫嘟酬、S挫喀晚、喀 晚氧苯甲酸醋和2-苯并[C]巧喃酬的乙酷乳酸合酶抑制劑的耐受性化S. 6, 225, 105、 U.S. 5, 767, 366、U.S. 4, 761，373、U.S. 5, 633, 437、U.S. 6, 613, 963、U.S. 5, 013, 659、 U.S. 5, 141，870、U.S. 5, 378, 824、U.S. 5, 605,oil);
[0135]f)面代芳基臘水解酶度xn)，其提供對漠苯臘的耐受（W08704181A1、 U. S. 4,810,648、W08900193A);
[0136]g)修飾的乙酷輔酶A簇化酶，其提供對環(huán)己締二酬（稀禾定（sethoxydim))和芳 氧基苯氧基丙酸醋（化氣氯禾靈化aloxyfop))的耐受性化S. 6, 414, 222);
[0137]h)二氨蝶酸合酶（dihy化opteroatesynthase) (sull)，其提供對橫胺除草劑的耐 受性化S. 5, 597, 717、U. S. 5, 633, 444、U. S. 5, 719, 046);
[013引i) 32kD光系統(tǒng)II多膚（PSbA)，其提供對S嗦除草劑的耐受性化irs油berg等人，1983)；
[0139]j)鄰氨基苯甲酸合酶，其提供對5-甲基色氨酸的耐受性化S. 4, 581，847);
[0140]k)二氨化晚二簇酸合酶（dapA)，其提供對氨乙基半脫氨酸的耐受性 (W08911789)；
[0141]1)八氨番茄紅素去飽和酶（CTtI)，其提供對如氣草敏（norflurazon)的化嗦酬除 草劑的耐受性（JP06343473);
[0142]m)徑基-苯基丙酬酸雙加氧酶，其提供對如異嗯挫草酬的環(huán)丙基異嗯挫類 (cycloprop}disoxazole)除草劑的耐受性（WO9638567;U.S.6,268,549);
[0143]n)修飾的原化嘟原氧化酶I(protox)，其提供對原化嘟原氧化酶抑制劑的耐受性 扣.S. 5, 939, 602);和
[0144]0)芳氧基鏈燒酸雙加氧酶（AAD-I)，其提供對含有芳氧基鏈燒酸部分的除草劑 的耐受性（W005107437)。運樣的除草劑的例子包括苯氧基植物生長素（如2,4-D和2， 4-滴丙酸（dichlcxrprop))、化晚氧基植物生長素（如氣草煙（fluroxypyr)和綠草定 (triclopyr))、芳氧基苯氧基丙酸（A0P巧乙酷輔酶A簇化酶（ACCase)抑制劑（如化氣氯 禾靈化aloxyfop)、哇禾靈（quizalofop)和禾草靈（diclo化P))和5-取代的苯氧基乙酸原 化口林原氧化酶IX抑制劑（如[I比草酸（pyrafIufen)和氣締草酸（fIumiclorac))。
[0145] 已知多種組織培養(yǎng)基，當適當補充時，支持植物組織增長和發(fā)育，包括從切下的 分生組織或胚形成成熟植物。運些組織培養(yǎng)基可W作為商業(yè)制劑購買，或者可W由本領 域的技術人員定制和修改。運樣的培養(yǎng)基的例子包括但不限于下面文獻中所述的那些： Murashige和Skoog, (1962);化11等人，（1975) !Linsmaier和Skoog, (1965) ;Uchimiya和 Murashige, (1962) ;Gamborg等人，（1968) ;Duncan等人，（1985) ;McCown和Lloyd, (1981); Nitsch和Nitsch，（1969)及Schenk和Hildebramlt，（1972)，或者相應補充的運些培 養(yǎng)基的衍生產(chǎn)品。本領域的技術人員知道培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補充物，如用于轉(zhuǎn)化和再生的營 養(yǎng)物和生長調(diào)節(jié)劑，通常為了特定的目標農(nóng)作物或感興趣的品種而進行優(yōu)化。試劑可W 商業(yè)獲得，且可W從多個供應商購買（參見，例如，Sigma化emical Co.，St. Louis, Mo和 Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)。
[0146] 共培養(yǎng)和后續(xù)步驟可在黑暗條件下或在光照化rcival培養(yǎng)箱中進行，例如16 小時光照、8小時黑暗的光周期，2-5天。在一個實施方案中，光強度可W是，例如，至少大 約SiiE，包括至少大約IOiiE或25yE，包括大約SiiE-大約200yE之間，或允許在大約 23-25°C的溫度下正常質(zhì)體發(fā)育的其它光照條件，并且可W在最高大約35°C下進行。 實施例
[0147] 本領域的技術人員可W理解本發(fā)明提供的方法和組合物的許多優(yōu)點。本文包括下 面的實施例來證明本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。本領域的技術人員應該理解，下面的實施例 中公開的技術代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實施本發(fā)明中運用良好的技術，因此可W被認為構 成了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領域的技術人員根據(jù)本公開內(nèi)容應該理解，在不背離 本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可W對公開的具體實施方案進行許多改變，而且仍然獲得 相同或類似的結果。本文引入在此引用的全部參考文獻作為參考，W補充、解釋、提供背景 或教導在此使用的方法、技術或組合物。
[014引實施例1
[0149] 外植體材料的分離
[0150] 手工處理種子，或者經(jīng)水稻脫殼機自動切除（例如，G巧inman麼Uboratory Paddy I^ice Sieller,例如，型號#64-115-6〇-WDC;Grain Machinery Manufac1:u;ring Co巧.，Miami,化)，或者例如，如美國專利公開20050005321所述處理。為了獲得分生外植 體材料，處理大豆種子（趴.43525;43邑1'〇*566(1(：〇111口曰]17)，^從種皮和子葉中分離包含分 生組織的胚。起始種子在切除時的內(nèi)部含水量對該方法的外植體產(chǎn)量的影響如表1所示。
[0151] 表1 :內(nèi)部含水量對外植體產(chǎn)量的影響
[0152]
[0153] 在制備外植體材料前種子的溫度也影響外植體的產(chǎn)量。表2顯示可W在包括 從-20°C到室溫的不同溫度下切下外植體。
[0154] 表2 :種子儲存溫度對外植體產(chǎn)量的影響
[0155]
[0156] 實施例2
[0157] 外植體材料的回收
[0158] 表3顯示切除過程開始時不同種子含水量的可用外植體組織的產(chǎn)量。較低的種 子含水量（大約6. 2% )允許按處理的種子重量計較高的外植體材料的產(chǎn)量。運是值得注 意的，因為從田地新收獲時干燥的大豆種子的內(nèi)部含水量是大約9-14%，而且理想地保持 在大約11 %長期儲存（1-20年）。較高的含水量讓種子在處理時不會破裂和喪失胚的活 力。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，較高含水量的干燥種子比干燥至較低內(nèi)部含水量（3-7%)的種子更不 易碎。運一發(fā)現(xiàn)使種子在對于活力理想的內(nèi)部含水量（大約9-12%)下處理和儲存，而對 于干外植體（人造種子）的理想提取，通過將種子干燥至大約3%-7%W達到脆性來處理。 運種脆性狀態(tài)保持胚的活力，而可使種子在子葉之間完全裂開，因此允許高質(zhì)量和高產(chǎn)量。
[0159] 實現(xiàn)脆性狀態(tài)因而允許高的加工產(chǎn)量和高轉(zhuǎn)化質(zhì)量的外植體的最優(yōu)含水量可隨 大豆基因型和農(nóng)作物類型而變化。本實施例說明為給定的種質(zhì)來源或植物種子類型優(yōu)化條 件所需要的方法。
[0160]
[0161] 實施例3
[0162] 種子和/或外植體材料的消毒
[0163] 測試了許多在切除前對種子消毒W(wǎng)及從種子切除后對外植體消毒的技術。W15 分鐘到16小時的時間間隔，測試在真空干燥室中使用氯氣對干外植體的切除后消毒。污染 控制隨著較長時間暴露于氯氣而增加，盡管真菌污染在對氯氣的暴露已超過外植體的生存 極限的處理中增加。
[0164] 也測試了