的緩沖液VII后混勻W終止反應(yīng)，在25°C室溫下放置30min后在紫外分光光度計 OJltrospecIlOOpro,AmershamBiosciences)上于 750nm波長下測定反應(yīng)液的吸光值。 同時分別取10mM的KH2P04溶液0,5，10，15,20,30iiL，各自加緩沖液VI(50mMpH6.5的 MES-Tris溶液）至500yL，與上述測定一樣，在30°C水浴中反應(yīng)20min后分別加入1血的 緩沖液VII，在25°C室溫下放置30min后在紫外分光光度計扣ItrospecIlOOpro,Amersham Biosciences)上于750nm波長下分別測定其吸光值，根據(jù)濃度值與吸光值計算回歸方程為 y= 48.912X-0. 557,R2= 0.9963,其中X為750皿下的吸光值，y為無機憐濃度，R2為估計 值與實際值之間擬合程度指標（取值范圍為0~1)，數(shù)值越大，擬合程度越高，數(shù)值越可靠。 加入了質(zhì)膜蛋白的各反應(yīng)將吸光值代入回歸方程即算出生成的無機憐（Pi)的量，從而計 算出AT化Se酶活性（nmolPimin1Jig1蛋白），繼而計算加入酶抑制劑后的AT化Se的相對 活性【（對照組AT化Se酶活性-反應(yīng)組AT化Se酶活性）/對照組AT化Se酶活性X100 %】。 隨著聚合物濃度的增加，細胞質(zhì)膜純度增加，但細胞質(zhì)膜蛋白的產(chǎn)量下降，即由6. 2%的葡 聚糖，6. 2%的聚乙二醇（質(zhì)量百分比），0. 33M的薦糖，3mM的KCl和5mMpH7. 8的憐酸鐘 溶液組成的兩相純化體系可W獲得高純度的質(zhì)膜而且質(zhì)膜蛋白產(chǎn)量也較高（圖2)。
[0010] 上述各步驟中相關(guān)的緩沖液的具體制備方法如下所述：
[0011] ①緩沖液I:〇. 4M薦糖，75mM的3-嗎嘟丙橫酸（MOP巧，5mM的乙二醇雙（2-氨基乙 基酸）四乙酸巧GTA)，5mM的四乙酸二氨基乙燒腳TA)，IOmM的氣化鋼（NaF)，5mM的二硫蘇 糖醇值TT)，5mM抗壞血酸，0. 2% (w/v)水解酪蛋白，1% (w/v)聚乙締化咯燒酬（PVP-40)， 10 % (v/v)甘油，用KOH調(diào)抑至7. 5。
[0012] ②緩沖液II:0. 33M的薦糖，5mMpH7. 8的憐酸鐘緩沖液。 陽01引③緩沖液III:20% (w/w)葡聚糖 11. 16g，40% (w/w)聚乙二醇 5. 58g，0. 2MpH7. 8的憐酸鐘緩沖液675yL薦糖3. 05g，2M的KCl54yL加入超純水至總重量為27g。 [0014] ④緩沖液IV:取20mM的Tris(S徑甲基氨基甲燒）溶液，加入肥1調(diào)節(jié)抑至7. 5。 陽01引 ⑥緩沖液V:0. 25M薦糖，20mMpH7. 5的Tris-Wl。
[0016] ⑧緩沖液VI:取50mM的MES(2- (N-嗎啡嘟）乙橫酸）溶液，加入Tris調(diào)節(jié)抑至 6. 5〇
[0017] ⑦緩沖液VII:1% (w/v)的十二烷基硫酸鋼（SD巧，1% (w/v)的鋼酸錠，0.5% (w/ V)的抗壞血酸和4% (v/v)的硫酸。
[0018] 本發(fā)明的積極效果是：
[0019] (I)本發(fā)明第一次構(gòu)建了適合油菜根系細胞質(zhì)膜純化的兩相分配體系。
[0020] (2)本發(fā)明構(gòu)建的兩相分配體系可從油菜根系中獲得較高純度的細胞質(zhì)膜。
[OOW(3)本發(fā)明優(yōu)化了用AT化Se活性進行油菜根系質(zhì)膜純度鑒定的反應(yīng)體系，并第一 次將質(zhì)膜蛋白的質(zhì)譜鑒定與AWase活性相結(jié)合鑒定所獲根系質(zhì)膜的純度。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :是本發(fā)明的兩相分配體系純化質(zhì)膜的模式工作圖。
[002引圖2 :是聚合物濃度對質(zhì)膜純化及質(zhì)膜蛋白產(chǎn)量的影響。
[0024] 圖3:是6. 2%(w/w)聚合物濃度組成的兩相分配體系所提取的細胞質(zhì)膜在各抑制 劑下的AT化Se活性測定。
[00巧]圖4 :維恩圖示從S個獨立的生物學(xué)重復(fù)中所純化的細胞質(zhì)膜中的質(zhì)膜蛋白檢測 情況。
[0026] 附圖標記說明：圖1中數(shù)字1-12為離屯、管編號，U和L分別代表分層后的上相OJp 地ase)和下相（Xowphase)，M/C表示先充分混勻（Mix)后離屯、（Centrifuge)。
[0027] 圖4中I，II，III分別代表S個獨立的生物學(xué)重復(fù)，分別對應(yīng)S個圓圈；兩個圓圈 重疊區(qū)域的數(shù)字代表只在運兩個重復(fù)中共同檢測到的蛋白個數(shù)，立個圓圈重疊區(qū)的數(shù)值代 表在=次重復(fù)中均檢測到的蛋白個數(shù)，不重疊區(qū)的數(shù)字代表只在該重復(fù)下檢測到的蛋白個 數(shù)。
【具體實施方式】 陽02引實施例1用于油菜根系細胞質(zhì)膜的純化兩相分配體系
[0029]取甘藍型油菜度rassicanapus)品種"鄂油長芙"幼苗的根系（品種"鄂油 長芙"來源請參見文獻：劉定富等，甘藍型油菜特長芙突變體的發(fā)現(xiàn)和鑒定.湖北農(nóng)學(xué) 院學(xué)報，1994，14似：1-5)。用營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，營養(yǎng)液組成為0.24邑/1畑4^3,0.50邑/ LM拆04,0. 15g/LKC1，0. 36g/LCaC12,0. 05mM邸TA-Fe和阿農(nóng)微量元素營養(yǎng)液（阿農(nóng)微 量元素營養(yǎng)，夜來源見Hoa邑landDR,ArnonDI.Thewater-culturemethodfor邑rowing plantswithoutsoil.Circular.CaliforniaAgriculturalExperimentStation 347 (2"dedit)，1950)，剪取培養(yǎng)了 20天的新鮮根系，經(jīng)高速組織勻漿器勻漿后用高速冷凍 離屯、機度eckman,Avanti?J-30IJA30.SOrotor)在 10,OOOg下離屯、15min后，將所得上清 液再經(jīng)超高速冷凍離屯、機度eckman,OptimaLE-80K叫tracentrifuge,Type70Tirotor) 在100,OOOg下離屯、30min，將沉淀重懸于緩沖液II(0. 33M的薦糖，5mMpH7. 8的憐酸鐘緩 沖液）使總重量為9g，然后與27g緩沖液III混勻后構(gòu)成36g的兩相分配體系對質(zhì)膜進行 純化，純化的過程按圖1中所示的模式圖進行。在純化過程中，溫度和兩相分配體系中聚合 物的濃度是影響提取的質(zhì)膜純度的關(guān)鍵因素。因此本實施例的細胞質(zhì)膜純化過程是在低溫 下（4°C及W下環(huán)境）或在冰上進行。分別比較了用5. 8% ,6.0% ,6. 2% ,6. 4% ,6. 6%的葡 聚糖值extranT-500)和聚乙二醇（PEG3350)聚合物濃度（注：體系中Dextran和PEG兩 種聚合物的濃度相等）對油菜根系細胞質(zhì)膜進行純化的試驗，結(jié)果表明：在較低的聚合物 濃度下，純化后的上相溶液較渾濁，蛋白含量較高但細胞質(zhì)膜的純度較低，含線粒體和液泡 等細胞器膜組分較多。相反，在較高濃度的聚合物濃度下，純化后的上相溶液較清澈，蛋白 濃度較低，細胞質(zhì)膜純度高，但聚合物濃度過高導(dǎo)致質(zhì)膜組分被分配到下相中而導(dǎo)致質(zhì)膜 組分的損失（見圖2)。利用不同梯度的聚合物濃度對細胞質(zhì)膜進行純化試驗，結(jié)果表明， 本發(fā)明的兩相體系由6. 2% (w/w)DextranT-500,6. 2%的陽G3350,0. 33M的薦糖，3mM的 KCl和SmM抑7. 8的憐酸鐘緩沖液（先配制SmM憐酸二氨鐘溶液，然后加入憐酸氨二鐘使 得抑達到7. 8)組成的兩相分配體系適合從甘藍型油菜根系中獲取高純度的質(zhì)膜的制備。
[0030] 實施例2利用AWase活性法鑒定甘藍型油菜根系細胞質(zhì)膜純度 [003U 通過檢測質(zhì)膜標志性酶AT化Se的活性抑制率來評價質(zhì)膜的純度，分別W0.ImM 的正饑酸鋼、50mM的硝酸鐘、5mM的疊氮化鋼作為質(zhì)膜、液泡膜和線粒體膜AWase酶特異 的抑制劑，W0.ImM的鋼酸鋼作為非特異憐酸酶的抑制劑，將實施例1中W6. 2% (w/w)的 聚合物濃度構(gòu)成的兩相分配體系純化獲得的細胞質(zhì)膜組分重懸于緩沖液V(0. 25M的薦糖， 20mMpH7. 5的Tris-肥1)中，使溶液中質(zhì)膜蛋白濃度約Iiig/化。取IOiig質(zhì)膜蛋白 的質(zhì)膜組分，于含50mM的抑6. 5MES-化is緩沖液（緩沖液VI)，3mM的S憐酸腺巧（ATP)， SmMM拆04的反應(yīng)體系巧00yL)中于30°C水浴中反應(yīng)20min，W未加任何酶抑制劑作為對 照，分別測定加入正饑酸鋼、硝酸鐘、疊氮化鋼W及鋼酸鋼的各個含抑制劑的反應(yīng)，反應(yīng)結(jié) 束后各個反應(yīng)加入ImL的緩沖液VII終止反應(yīng)，30min后于紫外分光光度計扣Itrospec IlOOpro,AmershamBiosciences)上在750皿波長下進行比色測定，計算每微克蛋白每分 鐘水解ATP釋放的Pi量。若加入某一抑制劑后產(chǎn)生的Pi含量降低，則說明該抑制劑對應(yīng) 的膜組分含量較高，即純度較高。結(jié)果表明只有加入正饑酸鋼（Vanadate)后AWase的活 性才降低，活性降低了 89 %，其他幾種抑制劑的AWase活性與對照相同（見圖3)，說明質(zhì) 膜點純度較高。
[0032] 實施例3利用細胞質(zhì)膜蛋白分析法鑒定甘藍型油菜根系細胞質(zhì)膜純度
[0033]