一種新的吡啶酮類生物堿及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及從透骨草植物內(nèi)生真菌Trametes trogii發(fā)酵產(chǎn) 物中提取分離得到的一種新的吡啶酮類生物堿和制備方法及其在制備腫瘤細胞抑制劑中 的用途。
【背景技術】
[0002] 吡啶酮類生物堿是微生物特有的次級代謝產(chǎn)物，其主要從真菌中分離得到。本發(fā) 明所涉及的化合物是由聚酮和氨基酸（亮氨酸、甘氨酸）通過乙酸途徑形成的。該類化合 物尚未有文獻報道其抗腫瘤、抗菌等活性。且本發(fā)明所涉及的吡啶酮類生物堿迄今在國內(nèi) 外尚未見有相關專利或文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種從透骨草植物內(nèi)生真菌Trametes trogii (該菌株已保存在沈陽 藥科大學中藥學院-80°C冰箱）發(fā)酵產(chǎn)物中提取分離得到的一種新的吡啶酮類生物堿和制 備方法及其在制備腫瘤細胞抑制劑中的用途。
[0004] 本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
[0005] 本發(fā)明是從植物內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物中尋找具有抗腫瘤活性的物質，對由中國各 地區(qū)采集得到的微生物（細菌、真菌和放線菌）菌株進行篩選，發(fā)現(xiàn)真菌Trametes trogii 發(fā)酵提取物具有較好的腫瘤細胞生長抑制活性，進而對該菌株進行大量培養(yǎng)發(fā)酵和代謝產(chǎn) 物的系統(tǒng)分離，首次從中得到了本發(fā)明的化合物，并通過各種波譜手段鑒定其結構為吡啶 酮類生物堿，如式I所示：
[0007] 本發(fā)明還提供所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0008] 本發(fā)明的制備技術方案包括如下步驟：
[0009] 將分離自長白山透骨草植物內(nèi)生真菌Trametes trogii進行大量發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物 經(jīng)過濾得到發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液經(jīng)濃縮后，用乙酸乙酯萃取；菌絲體用80% -90%丙 酮水溶液超聲提取，濃縮除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取。將發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物和菌絲 體乙酸乙酯萃取物合并后，經(jīng)硅膠柱色譜，用體積配比為100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇 或三氯甲烷-甲醇溶液進行梯度洗脫，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇體積配比為 100:4-100:6的洗脫物再經(jīng)二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇體積配比為100:3-100:4洗 脫，洗脫物再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，用甲醇洗脫，并經(jīng)半制備ODS高效液相色譜進 行純化，以體積配比為60:40-50:50的甲醇-水溶液為流動相洗脫，得式I化合物。
[0010] 其中，生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)為：植物內(nèi)生真菌Trametes trogii經(jīng)復蘇后，從斜面轉 移到裝有培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成：甘露醇1. 5-2. 5% ;葡萄糖1. 5-2. 5% ;酵母膏0. 3-0. 6% ; 蛋白胨 0· 8-1. 5% !KH2PO40.0 5-0. 08% ;MgS04 · 7H20 0· 03-0. 05% ;玉米漿 0· 1-0. 2% ;自來 水配制]的三角瓶中，于25-30°C搖床上160-180rpm振蕩培養(yǎng)2-3天后作為種子培養(yǎng)液。 然后將種子液按5-10%的接種量接種到含有新鮮、滅菌的真菌4號（培養(yǎng)基組成如上）液 體培養(yǎng)基的三角瓶中，在室溫條件下靜置培養(yǎng)，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0011] 式I化合物為黃色油狀物質（甲醇），1〇%硫酸乙醇溶液（v/v)不顯色。 HR-ESI-MS中給出準分子離子峰[M+H]+m/z 373. 1752(calcd 373. 1763)，結合其核磁共 振波譜數(shù)據(jù)，確定式I化合物的分子式為CmH24N 2O5(不飽和度為10)。化合物的UV譜 圖給出苯環(huán)和吡啶酮環(huán)片段的特征吸收峰（223,259和295nm)?；衔锏腎R譜圖顯 示在3408, 1746, 1687, 1638cm 1處有吸收，提示該化合物結構中含有羥基，酰胺羰基 以及苯環(huán)官能團。ECD(MeOH) λ nax[nm] ( Λ ε ) :228(+20. 6) !1H-NMR(400MHz，DMS0-d6) 譜中，31112.94(111， 8，13-順）為-0〇順邙-質子信號；3117.35(311，(1，了 = 7.2Hz，H-2,4,6)，7.41(2H，t，J = 7·2Ηζ，Η-3,5)為單取代苯環(huán)上的質子信號；δ h8.57(1H，S，H-19)，6.53(1H，s，H-9)為兩個烯氫質子信號；S H6.58(lH，d，J = 5. 6Hz，7-OH)，5. 12(lH，t，J = 4. 8Hz，21-OH)為兩個羥基氫信號；此外，還有一個連氧次甲 基氫信號3115.94(1氏(1，1 = 5.6抱，!1-7)，兩組連氧的亞甲基質子信號5113.47(2!14，1 = 4. 8Hz, H-21)，4. 18 (2H, m, H-20)，一組異丁基質子信號5112.61(2氏(1，了 = 7.2抱，!1-15)，2· 08 (lH，m，H-16)，0. 92 (6H，d, J = 6.7Hz, H-17, 18)。13C-NMR(100MHz, DMS0-d6)譜中，給出 20 個碳信號，其中有 3 個羰基碳信號 Sc176.6(C-10)，173.5(C-14)，162.5(C-12) ;10 個 sp2 雜化碳信號 δ c154. 8 (C-8), 149.4(019)，140.3(01)，128.6X2(03,5)，128. 1(04)，126 ? 9X2(C-2,6)，119.7(C-9)，115.6(C-11) ;7 個 sp3雜化碳信號 δ c69.9(C-7)，60.0(C-21), 54. 9 (C-20)，46. 5 (C-15)，24. 5 (C-16)，22. 2 X 2 (C-17, 18)。
[0012] 將式I化合物的1H-NMR、13C-NMR信號通過HSQC、HMBC和 1H-1H COSY譜進行歸 屬。HMBC 譜中，SH7.41(2H，t，J = 7.2Hz，H-3,5)與 δε140·3(Ο1)，126·9Χ2(Ο2,6) 相關，SH7.35(2H，d，J = 7·2Ηζ，Η-2,6)與 Sc128.6X2(C-3,5)，128.1(C-4)，6 9.9(C-7)相關，SH7.35(lH，d，J = 7·2Ηζ，Η-4)與 δε128·6Χ2(03,5)相關， δ η5· 94 (1Η, d, J = 5· 6Ηζ, Η-7)與 δ c140. 3 (C-I)，126. 9 X 2 (C-2, 6)相關，提示存在芐 基片段；δ Η6· 53 (1H, s, H-9)與 δ c154. 8 (C-8)，115. 6 (C-l 1)相關，δ η8· 57 (1H, s, H-19) 與 δ c176. 6 (C-IO)，154. 8 (C-8)相關，提示存在吡啶酮環(huán)片段；δ Η5. 94 (1Η，d，J = 5·6Ηζ，Η-7)與 Sc154.8(C-8)，119.7(C-9)相關，Sh6.53(1H，s，H-9)與 Sc69.9(C-7) 相關，確定芐基連在吡啶酮環(huán)C-8位上。根據(jù)1H- 1H COSY譜，δ H6. 58 (1H，d，J = 5. 6Hz，7-OH)與δ H5. 94(lH，d，J = 5. 6Hz，H-7)相關，可以確定羥基直接連在芐基飽和 碳上；δ η4· 18 (2H，m，H-20)與 δ η3· 47 (2H，q，J = 4. 8Hz，H-21)相關，δ η5· 12 (1H，t，J =4· 8Hz，21-0Η)與 δ η3· 47 (2Η，q，J = 4· 8Hz，Η-21)相關，提示存在羥乙基片段；此 外，HMBC 譜中，Sh8.57(1H，s，H-19)與 Sc54.9(C-20)相關，δΗ4·18(2Η，πι，Η-20) 與δ e154. 8(C-8)，149. 4(C-19)相關，確定羥乙基連接在吡啶酮環(huán)氮原子上。 SH〇.92(6H，d，J = 6.7Hz，H-17, 18)與 δ c46. 5(015)，24.5(016)，22.2(018, 17)相 關；δ η2· 08 (1H, m, H-16)與 δ c46. 5 (C-15)，22. 2 X 2 (C-17, 18)相關；δ η2· 61 (2H, d, J = 7· 2Ηζ, Η-15)與 δ c173. 5 (C-14), 24. 5 (C-16), 22. 2 X 2 (C-17, 18)相關，確定式 I 化合物中 含有異丁基片段，且與14位羰基相連；δ h12.94(1H，s)與δε115.6((Μ1)，46. 5(C-15)相 關，以及3118.57(1氏8，!1-19)與5￡176.6((：-12)相關，確定12位羰基連在吡啶酮環(huán)(：-11 上。由此確定式I化合物的平面結構。式I化合物的絕對構型是通過將實測的ECD譜與計 算得到的E⑶譜對比確定的，即采用Gaussian 03軟件基于B3LYP/6-31G*水平計算出式I 化合物的ECD光譜，由于式I化合物在228nm附近存在正性CD譜帶，將計算ECD光譜與化 合物實測CD譜進行擬合，從而確定了式I化合物C-7位絕對構型為S構型。
[0013] 通過以上