含有5?氨基酮戊酸和3?羥基吡啶酮的樹形化合物及其制備法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有5?氨基酮戊酸和3?羥基吡啶?4?酮的樹形化合物，其具有如下結構通式：通式中m≥3，n≥1。本發(fā)明還同時公開了上述樹形化合物的制備方法及用途：可用于制備光動力學治療藥物，例如用于制備治療基底細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚癌、肺癌、尖銳濕疣、乳腺癌、口腔表皮樣癌的光動力學治療藥物。
【專利說明】
含有5-氨基酬戊酸和3-哲基P比暗酬的樹形化合物及其制備法 和用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于化學制藥領域，設及一類含有5-氨基酬戊酸(ALA)和3-徑基化晚-4-酬 化P0)二種功能基的樹形化合物及其制備方法和用途----作為光動力學療法藥物。
【背景技術】
[0002] 光動力學療法(PDT)是二十世紀屯十年代末問世的一種針對(血管)增生性病變組 織的選擇性治療新技術，已成為世界腫瘤防治科學中最活躍的研究領域之一。PDT是W光、 光敏劑和氧的相互作用為基礎的一種新的疾病治療手段;將光敏劑(光動力治療藥物)輸入 人體，在一定時間后，W特定波長的光照射腫瘤部位，通過一系列光化學和光生物學反應， 在分子氧的參與下，產(chǎn)生單態(tài)氧和/或自由基，氧化破壞組織和細胞中的各種生物大分子， 使腫瘤細胞發(fā)生不可逆的損傷，最終使細胞死亡，達到治療目的。因此，光敏劑是影響光動 力治療效果的關鍵所在。
[0003] ALA(即：艾拉）已被廣泛用于光動力學療法來治療基底細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚 癌、尖銳濕痛，且獲得了較滿意的治療效果。ALA本身并沒有光活性，它在體內(nèi)通過血紅素的 生物合成循環(huán)途徑代謝，產(chǎn)生有活性的光敏劑原化嘟(縮寫為化IX)。運個過程在快速分裂 的細胞，尤其癌細胞中發(fā)生得更為有效，因此ALA對正常的組織細胞的毒性較小。ALA的主要 缺點來自ALA本身的高親水性，在生理pH條件下，ALA是兩性離子，運嚴重影響了它通過細胞 膜的能力，限制了其被細胞吸收。為了解決運個問題，具有更好的脂溶性的ALA前藥的到了 廣泛的研究，如ALA的醋衍生物、膚衍生物等。ALA-PDT能否取得好的療效，很大程度上取決 于細胞中由ALA產(chǎn)生的光敏劑化IX水平。而化IX在細胞中的積累除了主要與ALA濃度有關 夕h另一個關鍵的因素是亞鐵馨合酶的活性，該酶能催化由ALA產(chǎn)生的化IX馨合亞鐵離子， 使其轉變成沒有光活性的血紅素，導致藥物活性降低。因此降低細胞中亞鐵馨合酶的活性 能夠提高ALA-PDT的療效。由于鐵馨合劑能抑制亞鐵馨合酶的活性，因此，鐵馨合劑與ALA聯(lián) 合使用能減少血紅素的形成，從而有利于光敏劑巧IX在細胞中積累。已經(jīng)證明ALA與鐵馨合 劑(如:去鐵胺、徑基化晚酬二齒配體)配伍作用與單獨使用ALA相比，能使細胞中化IX濃度 顯著增加。
[0004] 樹形大分子是一類由多官能基內(nèi)核出發(fā)，向外重復生長，高度支化的Ξ維大分子。 自從二十世紀八十年代中期問世W來，一直受到化學家們的廣泛關注。樹形大分子作為藥 物載體，不僅載藥量高，而且能明顯改善藥代動力學、降低毒性、增強藥效，因此具有廣闊應 用前景。將ALA引入樹形大分子化合物也已有報道，研究表明，與ALA相比，含有ALA的樹形化 合物能顯著增強細胞中化IX濃度。但關于對于同時含有ALA和鐵馨合劑的樹形大分子化合 物的研究則未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種能顯著提高5-氨基酬戊酸藥效的含有5-氨 基酬戊酸和3-?基化晚酬的樹形化合物及其制備方法和用途。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種含有5-氨基酬戊酸（即ALA)和3-徑基化 晚-4-酬(即HP0)的樹形化合物，其具有如下結構通式：
[0007]
旨式中 m>3，n>l。
[000引備注說明：樹形大分子化合物是由內(nèi)部的核屯、（Initiator core)，內(nèi)部的多個支 化官能團（Interior)和外部的表面基團巧xterior)S部分組成。支化官能團連接在核屯、即 構成樹形分子骨架，ALA和HP0即為表面基團。
[0009] 作為本發(fā)明的含有5-氨基酬戊酸（即ALA)和3-徑基化晚-4-酬（即HP0)的樹形化合 物的改進:5-氨基酬戊酸(即ALA)通過其簇基與樹形分子骨架中的徑基形成醋鍵連接。
[0010] 旨P，樹形化合物含有多個ALA和冊0結構單元，如為：
[0011]
[0012] 作為本發(fā)明的含有5-氨基酬戊酸（即ALA)和3-徑基化晚-4-酬（即HP0)的樹形化合 物的進一步改進，為W下任意一種化合物(即，為化合物1 Oa、20a、25a、29a、30a):
[0013]
[0014]
[0015] 備注說明：上述分子結構中用虛線框起來部分即為核屯、。10a和25a含3個ALA, 1個 HP0; 20a，29a 和 30a 各含 3 個 ALA，3 個HP0。
[0016] 本發(fā)明還同時提供了上述含有5-氨基酬戊酸（即ALA)和3-徑基化晚-4-酬（即HP0) 的樹形化合物的制備方法，依次包括W下步驟：
[0017] 1)、樹形化合物10a的合成：
[0018] W甲硝基Ξ丙醇為起始原料，經(jīng)乙酷化、硝基還原成氨基、與Boc-β-丙氨酸縮合、 脫去乙酷基、與化Z-ALA成醋(得到化合物7)、脫去Boc(得到化合物8)、與含簇基的ΗΡ0縮合、 最后用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物10a;
[0019] 2)、樹形化合物20a的合成：
[0020] 經(jīng)Fmoc-β-丙氨酸與胺12(甲氨基Ξ丙酸Ξ叔下醋)縮合、脫去叔下基、與含徑基的 HP0縮合成醋、脫去Fmoc、與二簇酸18縮合(得到化合物19H)、再與化合物8縮合、最后用催化 氨化脫去保護基得到樹形化合物20a;
[0021] 3)、樹形化合物扣曰的合成：
[0022] WALA甲基醋為起始原料，經(jīng)與化zA-苯丙氨酸縮合、將甲基醋水解、與化合物5縮 合成醋、脫去Boc、與含簇基的HK)縮合、最后用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物25a;
[0023] 4)、樹形化合物29a的合成：
[0024] WALA甲基醋為起始原料，經(jīng)與化zA-甲硫氨酸縮合、將甲基醋水解、與化合物5成 醋縮合、脫去Boc得到化合物28;化合物5與含簇基的HP0(16C)縮合、脫去Boc、與二簇酸18縮 合得到化合物19C;28與19C縮合、再用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物29a;
[0025] 5)、樹形化合物30a的合成：
[0026] 19H與化合物28縮合、再用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物30a。
[0027] 本發(fā)明還同時提供了上述含有5-氨基酬戊酸（即ALA)和3-徑基化晚-4-酬（即HP0) 的樹形化合物的用途:用于制備光動力學治療藥物。特別是用于制備治療基底細胞癌、鱗狀 細胞癌、皮膚癌、肺癌、尖銳濕痛、乳腺癌、口腔表皮樣癌的光動力學治療藥物。
[0028] 3-徑基化晚酬是一類在醫(yī)藥領域有廣泛應用前景的鐵馨合劑，其二齒配體去鐵酬 (Deferiprone)已在治療地中海貧血等與鐵過多相關的疾病中使用多年，本發(fā)明選擇HFO作 為鐵馨合劑。
[0029] 本發(fā)明的含有5-氨基酬戊酸和3-徑基化晚酬的樹形化合物具備如下技術優(yōu)勢：
[0030] 1、與ALA相比，運些樹形化合物在Ξ種癌細胞(MCF-7、MCF-7R和KB細胞）中能產(chǎn)生 更高濃度的光敏劑原化嘟(Ppix)。如樹形大分子化合物25a(濃度為50μΜ)與MCF-7、MCF-7R 和KB細胞培養(yǎng)4小時，產(chǎn)生的化IX濃度分別是ALA(濃度為50μΜ)的13.8、7.3和23.3倍;樹形 大分子化合物30a(濃度為20μΜ)與MCF-7、MCF-7R和邸細胞培養(yǎng)4小時，產(chǎn)生的化IX濃度分別 是ALA(濃度為20μΜ)的56.5、31.4和22.4倍;樹形大分子化合物30a(濃度為30μΜ)與KB細胞 培養(yǎng)4和24小時，產(chǎn)生的巧IX濃度分別是ALA(濃度為300μΜ)的1.3和2.4倍。
[0031] 2、對癌細胞的光毒性也比ALA強得多，如本發(fā)明的樹形化合物與邸細胞培養(yǎng)4小時 后進行光照，其半致死量LDsq為2-15μΜ，而ALA的LDsq為195]iM。
[0032] 本發(fā)明的樹形化合物的用法可參照ALA的使用法和用量，由于本發(fā)明的樹形化合 物的活性高，因此用量亦可略微減少。
【附圖說明】
[0033] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0034] 圖1為樹形化合物和ALA與Ξ種癌細胞培養(yǎng)4小時后產(chǎn)生的光敏劑化IX巧光強度， 由本發(fā)明實施例1-5得到的含ALA和HP0的樹形化合物10a、20a、25a、29a和30a及ALA與KB、 MCF-7和MCF-7RS種癌細胞培養(yǎng)4小時后產(chǎn)生的原化嘟(PpIX)的巧光強度測定結果。
[00巧]圖2是樹形化合物在MCF-7R細胞中產(chǎn)生巧IX的動力學。10a、20a和25a的濃度為50μ mol/L，29a 和 30a 的濃度為 20 皿 ol/L。
[0036] 圖3是樹形化合物29a和30a在低濃度下和MCF-7細胞解育4小時和24后產(chǎn)的生巧IX 巧光強度。
[0037] 圖4是ALA和ALA-HP0樹形化合物和邸細胞在37°C下解化4小時，用藍光照射后細胞 的存活率(實驗結果通過Μ?Τ分析得到）。
[0038] 備注說明：圖4A和4B是在兩次不同時間做的實驗結果。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1、樹形化合物10a的制備
[0040] 其合成路線如Scheme 1所示：
[0041]
[0042] 其具體制備方法，依次進行W下步驟：
[0043] Ξ(3-乙酷氧丙基）硝基甲燒（2):甲硝基Ξ丙醇（l)(10g，42mmol)溶于化晚 (50mL)，加入乙酸酢(25血），混合液在室溫攬拌18h。在反應液中加入50血水，攬拌30min，然 后濃縮至約一半的體積。殘留液中加入二氯甲燒化CM，1 OOmL)，依次用5 %化2〇)3溶液巧OmL) 和水(50mL)洗涂。用無水硫酸鋼干燥后，將溶液濃縮至干，得到油狀產(chǎn)物2(14.2g，95 %產(chǎn) 率）</H NMR(CDCl3,270MHz)S:1.53(m，6H，30l2)，1.97(m，6H，3ai2)，2.02(s，9H，3C〇ai3)， 4.03(m，細，3CH2);ESI-MS:m/z 362([M+H] +)，384([M+Na] +)。
[0044] Ξ(3-乙酷氧丙基)硝基甲燒(3):化合物2(10g，27.7mmol)溶于乙醇（100血），加入 雷尼儀催化劑(2g)，在室溫下催化氨化24小時化2壓力為30psi)。過濾除去催化劑，將濾液 在旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，得到油狀產(chǎn)物3 (8.4g，94 %產(chǎn)率）。iH NMR(CDC13，270MHz) δ : 1.36 (m， 6H，3C出），1.57(m，6H，3C此），2.00(s，9H，3C0C曲），4.04(m，細，3CH2).ESI-MS:m/z 332([M+ 扣+ ),354( [M+化]+ )。
[0045] 化合物4::化合物3(lOg，30.2mmol)溶于四氨巧喃（THF，lOOmL)，加入Boc-β-丙氨 酸（6.8g，36mmol)，N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，6.8g，33mmol)，1-徑基苯并Ξ挫化0化， 4.5,331111]1〇1)，和1-下基-3-甲基咪挫漠鹽（[13111；[1]1化1'，6.6邑，3〇1]11]1〇1)。在氮氣保護下，混合液 室溫攬拌24h。過濾除去沉淀，將濾液濃縮至干，得到油狀殘留物。將其溶于二氯甲燒 (80mL)，依此用5 % (質(zhì)量％ )稀鹽酸（50mL)、飽和碳酸氨鋼溶液(50mL)和水(50mU洗涂。有 機層用無水硫酸鋼干燥，濃縮，殘留物硅膠柱層析分離純化（乙酸乙醋/甲醇9:1(V/V))，收 集尺:為0.4的洗脫液，除去溶劑，得到產(chǎn)物4(12.4旨，82%產(chǎn)率）。1!1醒1?(〔0(：13,2701化）6: 1.29(m，6H，3Ol2)，1.36(s，9H，3ai3)，1.60(m，6H，3ai2)，2.01(s，9H，3C0ai3)，2.19(m，2H， C出），3.07(m，2H，CH2)，4.03(m，細，3CH2);ESI-MS:503([M+扣 + )，5化（[M+化] + )。
[0046] 化合物5:化合物4 (5g，9.96mmo 1)溶于甲醇(50mL)，用冰浴(0-4 °C)冷卻，加入氨氧 化鋼溶液(2M，lOOmL)，攬拌15分鐘。溶液用Ambcrlilci'|IR12〇酸性離子交換樹脂中和至抑7， 濾去樹脂，將溶液濃縮得黃色固體5(3.46g，92 %產(chǎn)率）。iH NMR(CDC13，270MHz) δ : 1.29 (m， 6H，3C出），1.36(s，9H，3CH3)，1.55(m，細，3CH2)，2.21(m，2H，CH2)，3.07(m，2H，CH2)，3.33(m， 6H，3C出）；ESI-MS:377([M+H] + )，399([M+Na] + )。
[0047] 化合物7:將Cbz-ALA (6) (1 Ommo 1)和DCC (6.6mmo 1)溶于DCM (30mL) /N，N ' -二甲基甲 酷胺(DMF，lOmL)，混合液在氮氣保護下于室溫攬拌50分鐘。加入4-二甲胺基化晚（DMAP， 0.6mmol)，然后滴加化合物5(2mmol)的二氯甲燒（lOmL)溶液（1小時加完）?；旌弦涸谑覝乩^ 續(xù)攬拌24小時。過濾除去沉淀，將濾液濃縮至干，得到殘留物溶于二氯甲燒(80mL)，依此用 5 %稀鹽酸(50mL)、飽和碳酸氨鋼溶液(50mL)和水(50mL)洗涂。有機層用無水硫酸鋼干燥， 濃縮，殘留物硅膠柱層析分離純化（乙酸乙醋/甲醇9:1，V/V)，收集Rf為0.38的洗脫液，除去 溶劑，得到黃色固體產(chǎn)物7 (產(chǎn)率36.5 % )。1h NMR(CDCb，270MHz) δ : 1.29 (m，6H，3C此），1.43 (s，9H，3CH3)，1.53(m，細，3CH2)，2.41(m，2H，CH2)，2.56(m，6H，CH2)，2.62(2m，6H，6CH2)，3.25 (m，2H，C出），4.02(2m，細，6CH2)，4.05(s，6H，3NCH2)，5.04(s，細，C出I?)，5.82(br，3H，3NH)， 5.94(br，2H，2NH)，7.28(m，l甜，Ph);ESI-MS:m8([M+扣 + )。
[004引 備注說明：Cbz-ALA可購自英國公司（QiemPharm Research LTD,UK)。
[0049] 化合物8:將化合物7(Ig，0.895mmol)溶于二氯甲燒（50mL)，加入5mL甲酸?；旌弦?在室溫攬拌18小時，濃縮至干，加入5mL甲苯，蒸干W除去殘留甲酸，得到黃色固體SdIhNMR (CDCl3,270MHz)δ:1.28(m，6H，3C出），1.53(m，細，3CH2)，2.41(m，2H，C出），2.56(m，6H，CH2)， 2.62(2m，6H，6C此），3.25(m，2H，CH2)，4.02(2m，6H，6C此），4.05(s，細，3NC此），5.04(s，6H， C 出化），5.82(br，3H，3NH)，5.94(bs，2H，2NH)，7.28(m，l甜，Ph);ESI-MS:1018([M+扣 + )，1040 ([M+Na]")〇
[00加]化合物9:3-節(jié)氧基-2-乙基-佔-化喃-4-酬（5旨，22111111〇1)溶于乙醇（3〇111〇/水 (30mL)，加入8-氨基辛酸（8.5g，54mmo 1)和化ο田容液（2M，2mL)?；旌弦夯亓?8小時，冷卻至 室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至1，然后濃縮至約一半體積，加入50mL水。溶液用乙酸洗涂（2 X 50血），水層用10M NaOH調(diào)節(jié)pH至6,用二氯甲燒萃取(3X50血）。合并有機層，用無水硫酸鋼 干燥，過濾，濾液濃縮至干得到的殘留物用乙酸乙醋重結晶得到黃色晶體9(6. lg，75%產(chǎn) 率）。4 NMR(CDCl3,270MHz)Sl.03(t，J = 7.5Hz，3H，CH3)，1.32(m，6H，CH2)，1.56(m，2H，CH2)， 1.66(m，2H，C出），2.57(q，J = 7.5Hz，2H，C出），3.64(t，J = 6.細z，2H，C出），3.74(t，J = 7.6Hz，2H，CH2)，5.28(s，2H，CH2)，6.43(dJ = 7.5Hz，lH，C5-H in pyridinone)，7.17(dJ = 7.甜z，lH，C6-H in pyridinone)，7.29-7.35(m，3H，Ph)，7.43(m，2H，Ph).ESI-MS:m/z 372 ([M+W + )。
[0051 ] 化合物10:將化合物9(0.50g，1.35mmol)溶于DCM/DMF(50mL，3:1)，在氮氣保護下， 加入 00：(0.28邑，1.35111111〇1)，冊化（0.18邑，1.35111111〇1)和化111山化八0.29邑，1.35111111〇1)，室溫攬 拌50分鐘。滴加化合物8( 1.25g，1.3mmol)的DMF(5mL)溶液，1小時滴完。混合液室溫攬拌24 小時，過濾除去沉淀。濾液濃縮至干后溶于DCM(30mL)，依此用5%稀鹽酸（20mL)、飽和碳酸 氨鋼溶液(20mL)和水(20mL)洗涂。有機層用無水硫酸鋼干燥，濃縮，殘留物用硅膠柱層析分 離純化化酸乙醋/甲醇9:1，V/V)，收集Rf為0.29的洗脫液，除去溶劑，得到產(chǎn)物10(0.86g， 產(chǎn)率 48%)</HNMR(CDCl3,270MHz)S:1.01(m，3H，Ol3)，1.23(m，8H，4ai2)，1.45(m，2H，ai2)， 1.60(m，細，3CH2)，1.82(m，6H，3C此），1.86(m，2H，CH2)，2.27(m，2H，CH2)，2.32(m，2H，CH2)， 2.53(m，2H，C出），2.55(q，J = 7.4Hz，細，3CH2)，3.35(m，2H，CH2)，3.72(m，細，3CH2)，4.00(m， 12H，3CH2and buried 3NC出），5.04(s,細，4C出曲），5.82(br，3H，3NH)，5.94(br，2H，2NH), 6.56((1，1 = 7.2，巧，化晚酬環(huán)中(：5寸），7.28(111，21山20助5自4口}1，1助5自化晚酬環(huán)中〔6寸）； ESI-MS:m/z 1371([M+H+])。
[0052] 樹形化合物1 Oa:將化合物10 (0.5mmo 1)溶于甲醇/乙酸乙醋（50mL，1:4)，加入Pd/C (5 %，0.1 g)和氯化節(jié)(2.2mmol)?；旌弦涸?0psi的氨氣中室溫攬拌10分鐘。過濾除去催化 劑，濾液濃縮至干，得10a粗產(chǎn)物。用Agilent HPLC半制備柱（250mm X 10.0mm i . d.，C18，扣 m)進一步純化。乙臘(含0.05%甲酸)和甲醇(含0.05%甲酸）用作流動相（12分鐘內(nèi)梯度比 0-40 %，流速為5mL/min)。產(chǎn)物的保留時間為4.3分鐘。溶液濃縮后得到油狀產(chǎn)物（純度 95%，產(chǎn)率47%)。l歷MR(DMS0,270MHz)δ:0.93(t，J = 7.4Hz，3H，CH3)，1.17(m，細，4CH2)， 1.29(m，2H，Ol2)，1.46(m，6H，3ai2)，1.69(m，6H，3ai2)，1.79(m，2H，ai2)，2.04(m，2H，ai2)， 2.25(m，2H，CH2)，2.52(m，2H，CH2)，2.58(q，J = 7.4Hz，細，3CH2)，3.32(m，2H，C此），3.72(m， 6H，3Ol2)，3.97(m，12H，3CH2andburied3NCH2)，6.06(br，3H，3NH)，6.17(br，2H，2NH)，6.21 (d,J = 7.2,lH,C-5H in pyridinone), 7.64(br, 9H, SNHs"), 7.86(d J = 7.2,1H,C-6H in pyridinone)，16.73(s，IH，OH); 1化 NMRS:11.6，17.5，20.1，24.7，26.4，27.3，29.4，33.1， 44.6,48.3,53.1,59.1,61.4,108.3,114.2,120.2,134.6,143.1,171.6,172.3,172.7,and 203.1 .ESI-MS:m/z294( [M+3H]3+) ,879( [M+H+]) ,901 ([M+Na] + )。
[0053] 實施例2、樹形化合物20a的制備 [0化4] 其合成路線如Scheme2所示：
[ο化5]
[0056] 其具體制備方法，依次進行W下步驟：
[0057] 化合物13:Fmoc-i3-丙氨酸（2.21g，7.1mmol) ,4-(2-(叔下氧幾基）乙基)-4-氨基庚 二酸二叔下酯（胺 12,3.35邑，8.5111111〇1)，冊化（1.3邑，8.5111111〇1)，00：(1.71邑，8.5111111〇1)溶于無 水DMF(30mL)，混合液在室溫攬拌過夜。過濾，將濾液濃縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化 (乙酸乙醋/環(huán)己燒1:1，V/V)，收集Rf為0.42的洗脫液，除去溶劑，得到白色固體產(chǎn)物13 (4.64g，產(chǎn)率92%)。lHNMR(CDCl3,500MHz)δl.43(s，27H，CH3)，1.98(m，細，C也），2.21(m， 6H，CH2)，2.35(m，2H，CH2)，3.48(m，2H，Ol2)，4.21(m，lH，CH)，4.35(m，2H，CH2)，5.70(br，lH， NH)，6.05(s，lH，NH)，7.31(m，2H，Ar)，7.39(m，2H，Ar)，7.60(d，J=7.5Hz，2H，Ar)，7.75(d，J =7.甜z，2H，Ar) .ESI-MS:m/z 709( [M+扣+ )。
[005引化合物14:將化合物13 (2g)溶于96 %甲酸（1 OmL )，室溫攬拌24小時，將溶液蒸干， 定量地得到產(chǎn)物 15。4 NMR(DMS0-d6,500MHz)Sl.83(m，W，Ol2)，2.11(m，6H，ai2)，2.26(m， 2H，Ol2)，3.17(m，2H，CH2)，4.21(m，lH，CH)，4.25(m，2H，ai2)，7.22(m，lH，NH)，7.33(m，2H， Ar),7.41(m,2H,Ar),7.68(d J = 7.0Hz,2H,Ar),7.88(d J = 7.0Hz,2H,Ar),12.08(br,3H, COOH) .ESI-MS(負離子模式）:m/z 539([M-扣-)。
[0059]化合物15:制備方法與9相似。即，將化合物9的制備方法中的8-氨基辛酸改成6-氨 基已醇;其余同等于化合物9的制備法。1η NMR(CDCl3,400MHz)δl.03(t，J = 7.細z，3H，C出）， 1.30-1.44(m，4H，CH2)，1.56(m，2H，Ol2)，1.67(m，2H，CH2)，2.56(q，J = 7.6Hz，2H，CH2)，3.64 (t，J = 6.4Hz，2H，CH2)，3.75(t，J = 7.細z，2H，C出），5.26(s，2H，CH2)，6.41(d，J = 7.6Hz，lH， 化晚酬中 C5-H)，7.18(d，J = 7.6Hz，lH，化晚酬中C6-H)，7.27-7.35(m，3H，I?)，7.42(m，2H， Ph);ESI-MS:m/z 330([M+扣+ ),352([M+Na] + )。
[0060] 化合物16H:化合物14(Immo 1)氮氣保護下溶于DCM(5mL)/DMF(5mL)，加入DCC (3.6mmo 1)，室溫攬拌40分鐘，然后加入DMAP(0.3mmo 1)，和化合物15 (3.6mmo 1)?；旌弦涸诘?氣保護下室溫攬拌24小時。過濾，將濾液濃縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化（DCM/MeOH (9.5:0.5，V/V)，收集Rf為0.39的洗脫液，除去溶劑，得到無色油狀物16H(產(chǎn)率42 % )。iH NMR (CDCl3,400MHz)Sl.01(t J = 7.4Hz，9H，C曲），1.28(m，12H，CH2)，1.55(m，細，C此），1.64(m， 細，C出），2.02(m,細，C此），2.26(m，6H，CH2)，2.46(m，2H，C此），2.57(q，J = 7.4Hz，細，C此）， 3.43(m，2H，CH2)，3.73(t，J = 7.1Hz，細，C此），3.99(t，J = 6.3Hz，細，C出），4.18(m，lH，CH)， 4.31(d J = 7.0Hz，2H，CH2)，5.26(s，細，C出），5.90(br，lH，NH)，6.40(dJ = 7.甜z，3H，C5-H in pyridinone) ,6.79(br, ΙΗ,ΝΗ), 7.16(d, J = 7.5Hz , 3H,C6-H in pyridinone), 7.28- 7.43(m，19H，Ar)，7.59(d J = 7.4Hz，2H，Ar)，7.74(d J = 7.4Hz，2H，Ar).ESI-MS:m/z 1474 ([M+扣+ ),738( [M+2H]2+) ,492( [M+3H]3+)。
[0061 ] 化合物17H:將化合物16H( 1.8g)溶于無水DMF( lOmL)，加入贓晚（0.25mL)。溶液室 溫攬拌20分鐘，濃縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化(DCM/MeOH 3:1，V/V)，收集Rf為0.45的 洗脫液，除去溶劑，得到無色油狀物17H(l.lg，產(chǎn)率72%)。4 NMR(CD3〇D，270MHz)Sl.〇9(t，J =7.細z，9H，C出），1.37(m，12H，C此），1.63(m，6H，CH2)，1.71(m，細，C出），2.01(m，6H，CH2)， 2.29(m，6H，CH2)，2.35(m，2H，C此），2.66(q，J = 7.細z，細，C此），2.88(m，2H，CH2)，3.98(m， 細，C出），4.06(m，細，C出），5.17(s,細，C出），6.49(dJ = 7.2Hz，3H，C5-H in pyridinone), 7.：M(m，9HJh)，7.41(m，6HJh)，7.70(d，J = 7.2Hz，3H，C6-Hinpyridinone).ESI-MS: 1252([M+扣+)。
[0062] 化合物18:β-丙氨酸乙基醋鹽酸鹽（10邑，65.1111111〇1)溶于冷卻至1化°(：的飽和化肥〇3 溶液（150mL)，滴加對苯二甲酯氯（5g，24.6mmo 1)溶于二氯甲燒（125mL)和DMF( 25mL)的溶 液。在0°C繼續(xù)攬拌化，然后室溫攬拌12h。用二氯甲燒（lOOmL)萃取，有機層用水(50mL)洗 涂，用無水MgSCk干燥。蒸去溶劑的白色化合物(6.38g，71 % y ie 1 d)。取1 g溶于甲醇（25mU， 冷卻至0°C。加入2M化細溶液(9.50mL)。攬拌化，加入水(20mL) W使產(chǎn)生的沉淀溶解。溶液 用Amberlite IR-120(氨型）陽離子交換樹脂中和，調(diào)節(jié)抑至2,過濾，將濾液完全蒸干，得白 色粉末 18(0.82g，97% 產(chǎn)率）.iHNMR(270MHz，DMS0-d6)S2.68(m，4H，CH2)，3.93(m，4H，2CH2), 7.96(s，4H，Ar)，8.99(t，J = 7.Wz，2H，NH);UCMffi(67.5MHz，DMS0-d6)S:38.6,41.35, 129.66，134.57，166.39，172.54.ESI-MS:m/z 309([M+H] + )。
[0063] 化合物 19H:將化合物 17H(2mmol)，DCC(2.2mmol)，H0Bt(2.2mmol)，[Bmim]Br (2.2mmo 1)和化合物18(2mmo 1)溶于無水DMF(1 OmL)，在0°C攬拌化，然后室溫攬拌24小時。過 濾除去沉淀，將濾液濃縮至干，殘留物溶于DCM(40mL)，用水洗涂五次(20mLX5)。將溶液濃 縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化化tOAc/MeOH 4:1)，收集Rf為0.41的洗脫液，除去溶劑， 得到化合物 醒 R(CDCl3,270MHz) S〇.98(t, J = 7.2Hz, 9H，3CH3), 1.23-1.27(m，6H, 3CH2)，1.62-1.97(m，6H，3C出），2.00(m，細，3CH2)，2.22(m，細，3CH2)，2.22(m，2H，CH2)，2.36- 2.58(m，細，3CH2，m，4H，2CH2andq，J = 6.7Hz，細，3CH2)，3.39(m，2H，C出），3.56(m，4H，2CH2)， 3.64(m，4H，2Ol2)，3.79(m，6H，3ai2)，3.95(m，6H，3ai2)，4.10(m，2H，ai2)，5.17(s，6H， 3afeI%)，6.53(dJ = 7.2Hz，3H，C5-Hinpyridinone)，7.25-7.28(m，17H，3Phand2Hin Ar)，7.65(dJ = 7.2Hz，3H，C6-H in pyridinone)，7.77(m，2H，Ar);ESI-MS:m/zl542([M+H ]"),1564([M+Na]")〇
[0064] 化合物20:化合物19H(lmmol)在氮氣保護下溶于四氨巧喃（THF)(6mL)，加入DCC (1. Immo 1)，冊化（1. Immo 1)，[ Bmim] Br (1. Immo 1)和化合物8 (Immo 1)，混合液在0 °C 攬拌化， 然后室溫攬拌24小時。過濾除去沉淀，將濾液濃縮至干，殘留物溶于DCM(30mL)，用水洗涂五 次（20mL X 5)。將溶液濃縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化化tOAc/MeOH 4:1)，收集Rf為 0.46的洗脫液，除去溶劑，得到化合物20，產(chǎn)率45% Mffi(CDCl3，270ΜΗζ)δ〇. 96(t，J = 7.7Hz，9H，3CH3)，1.27(m，12H，6CH2)，1.54-1.61(m，12H，4CH2)，1.97(m，細，3CH2)，2.21(m， 2H，ra2)，2.25(m，6H，3(^2)，2.33(m，4H，2ai2)，2.53(q，J = 7.2Hz，6H，3ai2)，3.61(m，6H， 3CH2)，3.72(m，細，3CH2)，3.94(m，細，3CH2)，5.10(s，細，3C出I?)，6.32(d，J = 7.4Hz，3H，C5- Hinpyridinone)，7.22-7.33(m，l甜，3曲andm，2H，I?)，7.36(d，J = 7.4Hz，J = 8.0Hz， 3H，C6-Hinpyridinone)，7.78(m，4H，Ar);MALDI-T0F:2542([M+H] + )，^64([M+Na] + );ESI- MS:m/z 1271([M+2H]^")〇
[0065] 樹形化合物20a:將化合物20 (0.5mmo 1)溶于甲醇/乙酸乙醋（50mL，1:4)，加入Pd/C (5 %，0.1 g)和氯化節(jié)(3.3mmol)。混合液在40psi的氨氣中室溫攬拌10分鐘。過濾除去催化 劑，濾液濃縮得20a粗產(chǎn)物。用Agilent HPLC半制備柱(250mmX10.0mm i.d.，C18,5皿)進一 步純化。乙臘和水(99:1，含0.05 %甲酸)和甲醇(含0.05%甲酸）用作流動相（15分鐘內(nèi)梯度 比0-30 % )。產(chǎn)物的保留時間為5.6分鐘。溶液濃縮后得到油狀產(chǎn)物(純度95 %，產(chǎn)率34 % )。 1h 醒R(CD30D, 270MHz )δ :1.12( tj = 7.細 z，9H，3CH3)，1.33(m，12H，6C此），1.49-1.72(m, 12H，4afe)，2.01(m，6H，3ai2)，2.32(m，2H，CH2)，2.39(m，6H，3ai2)，2.41(m，4H，2ai2)，2.58 (q，J = 7.2Hz，細，3CH2)，3.61(m，6H，3C出），3.72(m，細，3CH2)，3.94(m，細，3CH2)，6.22(d，J = 7.4Hz,3H,C5-H in pyridinone) ,7.14(d,J = 8.0Hz,3H,C6-H in pyridinone),7.94(m, 4H，Ar); "C NMR(67.5MHz，CD3OD)δ : 11.4，22.7，26.8，30.7，33.4，：M.0，36.0，36.5，45.4， 52.6,57.2,61.4,65.2,66.4,68.2,117.3,126.6,128.6,130.2,137.4,142.4,146.4, 156.9,164.4,173.4,203.0.ESI-MS:m/z 624([M+3H]3+) ,1870( [M+H] + ),1892([M+Na] + ), 1908([M+K]")〇
[0066] 實施例3、樹形化合物扣a的制備
[0067] 其合成路線如Scheme 3所示：
[006引
[0069] 其具體制備方法，依次進行W下步驟：
[0070] 化合物 21:N-Cbz-L-苯丙氨酸（lOmmol)，ALA 甲基醋鹽酸鹽（12mmol)，DCC (lOmmol) ,H0Bt( lOmmol)和[Bmim]B;r( lOmmol)溶于THF( lOOmL)?；旌弦涸诘獨獗Ｗo下室溫 攬拌2小時，然后冷卻至0°C。二異丙基乙基胺(DIPEA)(12mmol溶于10血THF)滴加到上述混 合液，室溫攬拌過夜。加入丙酬（lOOmL)，過濾除去沉淀，將濾液蒸干。殘留物溶于二氯甲燒 (lOOmL)，依次用5%稀鹽酸、飽和碳酸氨鋼和水洗涂。用無水硫酸鋼干燥，過濾，將濾液蒸干 得白色固體產(chǎn)物21。96%產(chǎn)率。lHNMR(CDCl3,270MHz)δ2.58(t，J = 7.0Hz，2H，CH2)，2.74(t， J = 7.0Hz，2H，Ol2)，3.14and3.47(m，2H，ai2)，3.84(s，3H，CH3)，3.98(s，2H，ai2)，4.36(m， lH，CH)，5.08(s，2H，Ol2)，6.71(br，lH，NH)，7.38-7.47(m，10H，Ph)，7.87(br，lH，NH);ESI- MS:m/z 427([M+H]") ο
[0071] 化合物22P:化合物21 (5mmol)溶于甲醇（20mL)，用冰浴冷卻，加入2M Na0H(20mL)。 混合液繼續(xù)攬拌30min，然后用濃鹽酸中和至抑7,產(chǎn)物22P沉淀析出，加入40血水有更多沉 淀析出。過濾，將得到的固體在真空烘箱中烘干，得白色粉末22P。95 %產(chǎn)率。iH醒R(CDC13， 270MHz)S:2.78(m，4H，2CH2)，3.37and 3.49(m，2H，C也），4.07(s，2H，Ol2)，4.53(m，lH，CH)， 5.07(s，2H，Ol2)，6.72(br，lH，NH)，7.39-7.48(m，10H，Ph)，8.02(br，lH，NH)，12.3(br，lH C〇2H);ESI-MS:m/z 413([M+H]+)。
[0072] 化合物23:合成步驟與化合物7相似。即，將"化合物7的合成法"中的饑z-ALA換成 22P;將硅膠柱層析分離純化的條件換成：展開劑為（乙酸乙醋/甲醇10:1，￥八），3:為0.42。 其余等同于化合物7的合成法。
[0073] 產(chǎn)率46.2%，1h NMR(CDCl3,270MHz)0.96(s，9H，3CH3)，1.32(m，細，3C也），1.54(m， 細，3CH2)，2.45(m，2H，CH2)，2.78(m，12H，6CH2)，3.37(m，細，3CH2)，3.49(m，2H，CH2)，3.98(S， 6H，3Ol2)，4.08(m，6H，3ai2)，4.45(m，3H，3CH)，5.09(s，6H，3ai2)，6.72(br，5H，5NH)，7.39- 7.48(m，30H，I%)，8.02(br,3H，3NH);ESI-MS: 1559([M+扣+ ),1581 ([M+Na] + )。
[0074] 化合物24:將化合物23(lg)溶于二氯甲燒(50mL)，加入5mL甲酸?；旌弦涸谑覝財?拌18小時，濃縮至干，加入5mL甲苯，蒸干W除去殘留甲酸，得到黃色固體24。iH NMR(CDC13， 270MHz)Sl.43(m，6H，3Ol2)，1.69(m，6H，3ai2)，2.61(m，2H，CH2)，2.72(m，12H，4ai2)，2.93 (m，2H，CH2)，3.37(m，3H，3CH)，3.49(m，3H，3CH)，4.27(s，細，3CH2)，4.53(m，3H，3CH)，5.09 (s,細，3CH2Ph)，6.72(br，5H，5NH) ,7.39-7.48(m，30H，C出曲 and Ph)，8.02(br，3H，3NH) .ESI-MS:m/z 1459([M+扣+)。
[0075] 化合物25:在氮氣保護下，化合物9(0.5g，1.4mmol)，化合物24(1.61g，1. Immol)， DCC(0.22g，1. Immol)，冊化（0.15g，1. Immol)和bmim(0.24g，1. Immol)中加入THF(50血），用 冰浴冷卻。滴加 DI PEA (0.20mL，1. Immo 1溶于5mL THF)，混合液室溫攬拌過夜。加入丙酬 (lOOmL)，過濾除去沉淀，濾液在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮。將殘留物溶于二氯甲燒(40mL)，依次用 5 %稀鹽酸(3 X 30mL)、飽和碳酸氨鋼(30mL)和水(30mL)洗涂。有機層用無水硫酸鋼干燥，濃 縮，殘留物用硅膠柱層析分離純化（乙酸乙醋/甲醇9:1V/V)，收集Rf為0.45的洗脫液，除去 溶劑，得到產(chǎn)物25 (0.94g，產(chǎn)率47 % )。1h NMR(CDC13，270MHz): δ 1.05(t，J = 7.2Hz，3H，C出）， I. 36(m，6H，3C出），1.54-1.62(m，4H，2C此），1.78(m, 12H，6C此），2.12,（m，2H，Ol2)，2.57- 2.78(m，12H，6CH2and m，2H，CH2) ,2.84,（q，J = 7.4,2H，C出），3.21-3.39(m,細，3CH2) ,3.51- 3.69(m，4H，2C此），3.92，（m，細，3CH2)，4.01(s，細，3CH2)，4.16，（m，3H，3CH)，5.02，（m，6H， 3CH2),5.06,(s,2H,CH2),6.32,(d J = 7.4,1H,C5-H in pyridinone) ,6.68(br,3H,3NH), 7.26-7.89(m，36H，35hom7PhandlfromC6-Hinpyridinon)，7.86(br，5H，5NH);ESI- MS:1812([M+扣+)。
[0076] 化合物25a:合成步驟與化合物20a相似。即，將"化合物20a的合成法"中的20換成 25;即得25a粗產(chǎn)物。用Agilent HPLC半制備柱（250mm X 10.0mm i . d.，C18，5皿)進一步純 化。乙臘和水(99:1，含0.05 %甲酸)和甲醇(含0.05 %甲酸)用作流動相（15分鐘內(nèi)梯度比0- 45 % )。產(chǎn)物的保留時間為6.7分鐘。溶液濃縮后得到油狀產(chǎn)物(純度96 %，產(chǎn)率36 % )。2〇iH 醒R(CD30D, 270MHz )δ :1.07,（t，J = 7.2Hz，3H，C曲），1.37(m，6H，3C此），1.53-1.68(m，4H, 2C出），1.81 (m，12H，6C出），2.13,（m，2H，CH2) ,2.55-2.82(m，12H，6CH2and m，2H,CH2) ,2.87， (q, J = 7.4,2H，C出），3.22-3.41 (m,細，3CH2) ,3.52-3.71 (m，4H，2C此），4.02,（m，6H，3C此）， 4.11(s，6H，30l2)，4.18，（m，3H，3CH)，6.43(br，3H，3NH)，6.95，（d，J = 7.4，lH，C5-Hin pyridinon)，7.75(br，9H，3NH3+)，7.89(lH，C6-H in pyridinon);i3c NMR(67.5MHz CD30D)S II. 3,15.2,21.8,24.2,28.7,28.6,30.1,31.5,33.5,35.8,35.6,37.2,46.4,50.3,52.6, 53.4,62.4,65.6,68.6,71.7,115.2,116.9,122.8,126.9,127.5,128.6,128.9,145.3, 155.6，165.0，172.1，173.5，173.7，173.9,204.7.ESI-MS:1320([]\Wl] + )，l：M2([M+Na] + )。
[0077] 實施例4、樹形化合物29a的制備
[007引首先合成含Ξ個ALA基團的化合物28和含Ξ個ΗΡΟ基團的化合物19C，然后將28與 化合物19C偶聯(lián)，最后經(jīng)催化氨化得樹形化合物29a(Scheme 4)。
[0079]
[0080] 其具體制備方法，依次進行W下步驟：
[0081 ]化合物 26:N-Cbz-L-甲硫氨酸（lOmmol)，ALA 甲基醋鹽酸鹽（12mmol)，DCC (lOmmol)，冊E5t( lOmmol)和[Bmim]B;r( lOmmol)溶于THF( lOOmL)。混合液在氮氣保護下室溫2 小時，然后冷卻至0°C。DIPEA(12mmo 1溶于1 OmL THF)滴加到上述混合液，室溫攬拌過夜。加 入丙酬(lOOmL)，過濾除去沉淀，將濾液蒸干。殘留物溶于二氯甲燒(lOOmL)，依次用5%稀鹽 酸、飽和碳酸氨鋼和水洗涂。用無水硫酸鋼干燥，過濾，將濾液蒸干得白色固體產(chǎn)物26。產(chǎn)率 93%，1h NMR(CDCl3,270MHz)S:2.06(m，2H，Ol2)，2.14(s，3H，CH3S)，2.60(m，2H，CH2)，2.74 (m，2H，CH2)，2.84(m，2H，Ol2)，3.68(s，3H，CH3)，4.36(m，2H，ai2)，4.45(m，lH，CH)，5.09(s， 2H,CH2Ph),6.71(br,lH,NH),7.38-7.47(m,5H,Ph),8.03(s,lH,NH)；ESI-MS:m/z411([M+H r)。
[0082] 化合物22M:化合物26(5mmol)溶于甲醇（20mL)，用冰浴冷卻，加入2M Na0H(20血）。 混合液繼續(xù)攬拌30min，然后用濃鹽酸中和至抑7,產(chǎn)物22M沉淀析出，加入40血水有更多沉 淀析出。過濾，將得到的固體在真空烘箱中烘干，得白色粉末22M。產(chǎn)率93 %。iH醒R(CDC13， 270MHz)S:2.01(m，2H，CH2)，2.04(s，3H，Ol3S)，2.58(m，4H，2CH2)，2.73(m，2H，CH2)，4.09(m， 2H，CH2)，4.35(m，lH，CH)，5.06(s，2H，CH2)，6.68(br，lH，NH)，7.35-7.56(m，5HJh)，7.62(s, 1H，NH);ESI-MS 397([M+扣+)。
[0083] 化合物27:合成方法與化合物7相似。即，將"化合物7的合成法"中的Cbz-AA換成 22M;將硅膠柱層析分離純化的條件換成：展開劑為（乙酸乙醋/甲醇10:1，￥八），3:為0.45。 其余等同于化合物7的合成法。
[0084] 產(chǎn)率32.5%}deld，iH NMR(CDCl3,270MHz)S:1.09(s，9H，3Ol3)，1.44(m，W，3CH2)， 1.58(m，細，3CH2)，1.87(m，細，3CH2)，1.98(s，9H，3SCHs)，2.25(m，2H，CH2)，2.47(m，12H， 6CH2)，2.62(m，細，3CH2)，3.23(m，2H，CH2)，3.96(m，細，3CH2)，4.02(s，細，3CH2)，4.38(m，3H， 3CH)，5.09(s，細，3CH2)，6.19(br，3H，3NH)，7.28(m，l甜，3曲），7.48(br，3H，3NH);ESI-MS: 1511([M+扣+)。
[0085] 化合物28:將化合物27( Ig，0.66mmol)溶于二氯甲燒(50mL)，加入Ξ氣乙酸（ImL)。 混合液室溫攬拌化，真空濃縮至干，得到黃色固體28。1h醒R(CDC13，270MHz) δ: 1.37(m，6H， 3C此），1.59(m，6H，3Ol2)，1.96(m，6H，3ai2)，2.01(s，9H，3Sais)，2.26(m，2H，CH2)，2.57(m， 12H，6C此），2.62(m，2H，CH2)，2.76(m，細，3CH2)，3.96(m，6H，3C此），4.02(m，6H，3C此），4.38 (m，3H，3CH)，5.09(s，6H，3Ol2)，6.09(br，3H，3NH)，6.41(d，lH，NH)，7.28(m，5H，Ph);ESI- MS:m/z 1411([M+扣+ )，1433([M+Na] + )。
[0086] 化合物16C:合成方法與化合物9相似。即，將"化合物9的合成法"中的8-氨基辛酸 換成6-氨基已酸。其余等同于化合物9的合成法。
[0087] 產(chǎn)率88% ;1h NMR(CDCl3,270MHz)Sl.03(t，J = 7.2Hz，3H，C曲），1.36(m，2H，CH2), 1.62-1.72(m，4H，20l2)，2.：M(t，J = 6.8Hz，2H，CH2)，2.58(q，J = 7.2Hz，2H，CH2)3.82(t，J = 7.細z，2H，C出），5.23(s，2H，CH2)，6.67(dJ = 7.6Hz，lH，C5-Hinpyridinone)，7.27-7.42 (m，6H;5H from Ph and IH from C6-H in pyridinone);ESI-MS: :344([M+H] + ) ,366( [M+ Na]")〇
[0088] 化合物17C:合成方法與化合物7相似。即，將"化合物7的合成法"中的饑z-ALA(6) 換成16C;后處理時不用5%稀鹽酸洗涂。將硅膠柱層析分離純化的條件換成:展開劑為(二 氯甲燒/甲醇9:1，V/V)，Rf為0.37。其余等同于化合物7的合成法。
[0089] 咕 NMR(CDC!3)S: 1.02( t，J = 7.5Hz, 9H，3CH3)，1.34(m，6H，3C 出），1.42(8，9H, 3CH3) ,1.47-1.55(m，6H，3C出），1.61 (t，J = 7.6Hz，6H，3C出），1.65-1.72(m，12H，6CH2) ,2.28 (t J = 7.2Hz,細，3CH2)，2.43(tJ = 6.2Hz，2H，CH2)，2.58(qJ = 7.甜z，細，3CH2)，3.33(q，J = 6.0Hz，2H，afe)，3.80(t，J = 7.2Hz，6H，3ai2)，4.02(t，J = 6.5Hz，6H，3ai2)，5.25(s，6H， CH2)，6.42(d，J=7.5Hz，3H，C5-H in pyridinone)，7.23-7.43(m，18H，3C6-H in pyridinone and 3Ph);MSI-MS:m/z 1352.60([M+W + )。
[0090] 化合物18C:將17C(1.6g)溶于二氯甲燒（15mL)，加入5mL甲酸。混合液室溫攬拌 24h，真空濃縮，定量地得到產(chǎn)物 18C。1h NMR(CDCb，400MHz) δ 1.00 (t，J = 7.5Hz，9H，3CH3)， 1.22-1.32(m,細，3邸2)，1.49-1.58(m，6H，3C此），1.60(t，J = 7.細z,細，3邸2)，1.61-1.71 (m，12H，6CH2)，2.25(t，J = 7.2Hz，細，3CH2)，2.39(t，J = 6.2Hz，2H，CH2)，2.56(q，J = 7.甜z， 6H，3Ol2)，3.30(q，J = 6.0Hz，2H，ai2)，3.77(t，J = 7.2Hz，6H，3ai2)，4.03(t，J = 6.5Hz，6H， 3CH2)，5.27(s，細，3CH2Ph)，6.40(d，J = 7.5Hz，3H，3C5-Hinpyridinone)，7.20-7.35(m， 1細，3C6-H in pyridinone and 3Ph).MSI-ES;m/z 1252[M+H+]。
[OOW]化合物 19C:氮氣保護下將化合物 18C(lmmol)，DCC(l.lmmol)，H(Bt(l.lmmol)， Bmim( 1. Immol)和化合物18(2mmol)溶于無水THF，在0°C攬拌化，然后室溫攬拌24小時。過濾 除去沉淀，將濾液濃縮，殘留物溶于DCM，用水(lOOmL)洗涂五次。將溶液濃縮，殘留物用硅膠 柱層析分離純化化tOAc/MeOH 4:1)，收集Rf為0.41的洗脫液，除去溶劑，得到化合物19C。產(chǎn) 率65%，1h 醒R(CDCl3,270MHz)δ0.96(t，J = 6.7Hz，9H，3CH3)，1.25(m，12H，6C出），1.54- l.60(m，12H，6CH2)，1.97(m，細，3CH2)，2.21(m，2H，CH2)，2.35(m，細，3CH2)，2.50(m，2H，CH2)， 2.53(m，q，J = 7.2Hz，6H，30l2)，3.37(m，2H，CH2)，3.55(m，4H，2CH2)，3.68(m，4H，2CH2)，3.72 (6H，3CH2) ,3.94( s，6H，3CH2) ,4.83( s，6H，3CH2化），6.32(d，J = 6.7Hz, 3H，C5-H in pyridinone)，7.22-7.36(m，15H，3Ph，m，2H，Ar and d，J = 7.4Hz，J = 8.0Hz，3H，C6-H in pyridinone)，7.78(m，2H，Ar);ESI-MS:m/z 1542([M+扣+ )，1564([M+化])。
[0092] 化合物29 :合成步驟與化合物20相似。即，將"化合物20的合成法"中的19H換成 19C，8換成28;將硅膠柱層析分離純化的條件換成：展開劑為（乙酸乙醋/甲醇9:l，V/V)，Rf 為0.42。其余等同于化合物20的合成法。產(chǎn)率43%，4MlR(CDCl3,270MHz)Sl.02(t，J = 6.2Hz，9H，3C出），1.26(m，6H，3C出）1.36(m，細，3CH2)，1.37(m，細，3CH2)，1.52-1.62(m，12H， 6Ol2)，1.96(m，6H，3ai2)，1.97(s，9H，3ai2)，2.00(m，6H，3ai2)，2.21(m，8H，4ai2andm，6H， 3CH2)，2.51(m，12H，6CH2)，2.64(m，6H，30l2andm，6H，3ai2)，3.26(m，8H，4ai2)，3.38-3.41 (m，12H，6Ol2)，3.51-3.63(m，6H，3ai2)，3.95(m，6H，3ai2)，4.06(s，6H，2ai2)，4.41(m，3H， 3CH)，5.03(s，細，3CH2)，5.27(s，細，3CH2)，6.32(d，J = 7.4Hz，3H，C-5Hinpyridinone)， 6.49(br，3H，NH)，7.28(m，30H，6I%)，7.33(d，J = 7.4Hz，3H，C-6H in pyridinone)，7.78(m, 4H，Ar)，8.09(br，甜，5NH).MALDI-T0F-MS:m/z 2935([M+扣 + )，2957([M+Na] + )。
[0093] 樹形化合物29a:在干冰-丙酬冷卻下，將化合物29(0.5g)溶于7N氨的甲醇溶液 (lOmL);在氮氣保護下加入鈕黑(0.2g)。常壓下將氨氣通入反應液，20分鐘后，把溶液蒸干， 加入甲酸（〇.5mL溶于lOmL甲苯）。過濾除去催化劑，蒸干濾液得到油狀物，用HPLC純化。 Agilent HPLC 半制備柱(250mmX10.0mm i.d.，RP C18,5ym)，乙臘 / 水 99:1(含 0.05% 甲酸） 和甲醇（含0.05 %甲酸）用作流動相，12分鐘內(nèi)梯度比0-40 %。產(chǎn)物6.1分鐘后流出。純度 93%，產(chǎn)率：34%，1 歷MR(CDCl3,270MHz)Sl.l3(t，J = 6.2Hz，9H，3Ol3)，1.27(m，W，3CH2)， 1.38(m，細，3CH2)，1.37(m，細，3CH2)，1.57-1.68(m，12H，6CH2)，2.01(m，細，3CH2)，2.07(s， 9H，3C出），2.11(m，細，3CH2)，2.25(m，8H，4C出andm，6H，3CH2)，2.58(m，12H，6CH2)，2.69(m， 細，3CH2and m，6H，3C此），3.28(m，細，4C此），3.36-3.47(m，12H，6C此），3.58-3.69(m，細， 3CH2)，4.01(m，6H，3Ol2)，4.10(s，6H，2ai2)，4.47(m，3H，3CH)，6.31(br，3H，NH)，7.05(d，J = 7.4Hz，3H，C-5H in pyridinone)，7.62(d，J=7.4Hz，3H，C-6H in pyridinone)，7.78(m, 4H,Ar),8.09(br,甜，5NH);UCNMRS :13.2,16.3,17.4,19.4,22.5 25.6,27.4,27.8,30.1, 32.0,32.5,34.4,36.7,45.9,49.0,54.1,58.5,64.8,67.2,114.5,118.7,128.0,128.3, 128.6,136.2,156.5,161.5,161.8,170.2,172.4,172.7,204.5.MALDI-T0F-MS:m/z found 2263([M+扣+),2285([M+Na]+).ESI-MS:m/z 755([M+3H]3+)。
[0094]實施例5、樹形化合物30a的制備
[00M]將19H與化合物28偶聯(lián)，最后經(jīng)催化氨化得樹形化合物30a(Scheme 5)。
[0096]
[0097] 其具體制備方法，依次進行W下步驟：
[009引化合物30:合成方法與化合物20相似。即，將"化合物20的合成法"中的8換成28;將 硅膠柱層析分離純化的條件換成:展開劑為（乙酸乙醋/甲醇9:1，V/V)，Rf為0.42。其余等同 于化合物20的合成法。
[0099] 產(chǎn)率:34.5%，iHNMR(CDCl3,270MHz)0.99(t，J = 7.4Hz，9H，3CH3)，1.24(m，6H，3CH2) 1.28(m,細，3CH2)，1.52(m,細，3邸2)，1.61 (m，12H，6CH2) ,1.66-1.78(m，12H，6CH2)，1.98(m， 細，3CH2)，2.06(s，9H，3CH2)，2.12(m，細，3CH2)，2.20-2.28(m，細，4CH2)，2.54-2.67(m，12H， 6C也），2.73(m，細，3CH2)，2.77(m，6H，3C也），3.40(m，6H，CH2)，3.62-3.74(m，細，3CH2)，3.76 (m，6H，30l2)，3.93(m，6H，3ai2)，3.95(m，6H，3ai2)，4.21(m，3H，ai2)，4.96(s，6H，3ai2l%)， 5.17(s，6H，3CH2Ph)，6.40(br，3H，NH)，6.45(br，3H，3NH)，7.05(d，J=7.4Hz，3H，C5-H in pyridinone) ,7.25(m,30H,6F*h) ,7.33(d, J = 7.4Hz ,3H,C6-H in pyridinone) ,7.79(m,4H, Ar)，7.91(br，2H，2NH).MALDI-T0F-MS:m/z 2935([M+H] + )，2957([M+化]+ )，2973([M+K] + ) .ESI-MS:m/z 1468([M+2HF) ,979([M+3HF).
[0100] 樹形化合物30a:合成方法與化合物29a相似，即，將"化合物29a的合成法"中的29 換成30;其余等同于化合物29a的合成法。
[0101] 產(chǎn)物6.5分鐘后流出。純度95%，產(chǎn)率29%，1歷]\?(〔0(：13,27(^化）51.04(1，1 = 7.4Hz，9H，3CH3)，1.27(m，細，3CH2)1.29(m，細，3CH2)，1.55(m，細，3CH2)，1.66(m，12H，6CH2)， 1.71-1.82(m，6H，3Ol2andm，6H，3ai2)，2.02(m，6H，3ai2)，2.13(s，9H，3ai2)，2.15(m，6H， 3CH2)，2.27-2.：M(m，8H，4ai2)，2.56-2.69(m，12H，6ai2)，2.77(m，6H，3CH2)，2.82(m，6H， 3C也），3.45(m,細，C也），3.63-3.76(111，細，3(：也），3.79(111，細，3(：也），3.98(111，細，3(：也），4.02 (m，6H，3C也），4.25(m，3H，C也），6.40(br，2H，NH)，7.13(d，J = 7.4Hz，3H，C5-Hin化晚酬）， 7.41(br，2H，2NH).7.79(m，4H，Ar)，7.82(d，J = 7.4Hz，3H，C6-H in化晚酬）.i3cNMRS:13.2, 16.3,17.4,19.4,22.5 25.6,27.4,27.8,30.1,32.0,32.8,34.6,36.7,45.9,49.2,54.7, 57.9,65.9,67.8,113.9,117.8,128.1,128.3,128.7,136.4,156.4,161.3,161.8,170.5， 172.7,172.9,204.3.MALDI-T0F MS:m/z 2263( [M+H]"),2285([M+Na]"),2301 ([M+K]") .ES- MS:m/z 1132([M+2H]2+) ,755([M+3H]3+)0
[0102] 實驗1:細胞中的原化嘟(Ppix)產(chǎn)生的藥代動力學研究
[0103] 方法:ALA在細胞內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生光敏劑化IX，由于化IX是巧光化合物，因此用禪合 自動酶標儀的巧光光譜儀進行測定。激發(fā)波長405nm，發(fā)射波長635nm。
[0104] 細胞培養(yǎng):人乳腺癌細胞(MCF-7和MCF-7R)在無菌條件下在DEME-F12培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有2〇41的心谷氨酷胺和酪紅，W及10 %小牛血清(鐵濃度450-60化g/lOOg 之間）和慶大霉素(500U/mL)。人類癌KB細胞在EMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10 %小 牛血清(鐵濃度450-600yg/100g之間），2%心谷氨酷胺(200皿ol/L)，2 %鏈霉素(200U/mL)。 細胞均在37°C，潮濕的5%二氧化碳培養(yǎng)箱生長。
[0105] 藥代動力學研究:細胞接種到經(jīng)滅菌的96孔板培養(yǎng)48小時(細胞密度大約為每孔5 X 1〇4)，除去培養(yǎng)液后，細胞用憐酸緩沖液洗涂。接著細胞與新配制的ALA和樹形化合物溶 液一起培養(yǎng):將含一定濃度ALA或樹形化合物的1(Κ)化培養(yǎng)基(不含血清）添加到指定的孔 中?？瞻讓φ眨醇毎囵B(yǎng)時加入不含藥物的培養(yǎng)基)和各種不同濃度的藥物各進行6次平 行試驗。細胞培養(yǎng)4、24小時后，每個孔的巧光信號用禪合自動酶標儀的巧光光譜儀測定。減 去空白對照值后計算平均巧光。
[0106] 本發(fā)明制備的5個樹形化合物和ALA與邸、MCF和MCF-7RS種癌細胞培養(yǎng)4小時后產(chǎn) 生的光敏劑化IX的結果見圖1。由圖1A可見，在濃度為50皿ol/L時，樹形化合物10a，20a，25a 與ALA相比，在Ξ種癌細胞培養(yǎng)4小時后，產(chǎn)生的光敏劑化IX的濃度顯著增加，20a活性略強 于25曰，強于10曰。由圖1B可見，在濃度為20ymol/L時，樹形化合物29a和30a在Ξ種癌細胞中 產(chǎn)生的光敏劑化IX的濃度分別是ALA的15倍和10倍W上。在Ξ種癌細胞中產(chǎn)生的光敏劑 巧IX的活性強弱順序：30a〉29a〉20a〉25a〉10a。
[0107] 樹形化合物和ALA與MCF-7R細胞解育不同時間后產(chǎn)生巧IX巧光強度見圖2。隨著解 育時間的增加，PpIX巧光強度也增強。24小時后10a、20a和25a(濃度都為50ymol/L)產(chǎn)生的 化IX濃度分別是ALA的7.2、9.2和8.8倍;29a和30a(濃度為20ymol/L)產(chǎn)生的化IX濃度分別 是ALA的22和24倍。
[010引由圖3可見，ALA在低濃度時（2-10ymol/L)與MCF-7細胞解育4小時和24小時后產(chǎn)生 巧IX巧光強度非常弱，樹形大分子29a和30a在同樣的條件下，則能產(chǎn)生較強的巧光。
[0109] 實驗2:光毒性試驗
[0110] 將細胞W約10X104/孔的密度接種于96孔板，解育48小時后，用憐酸緩沖液洗涂 細胞，100化含不同濃度(2-10μΜ)的化合物溶液加入指定的孔中，解育4小時?？瞻讓φ眨?不加化合物)和五種不同濃度的化合物各進行6次平行試驗。用能量密度為2.5J/cm2的低功 率藍光(420皿)福照（照射區(qū)域為14cm X 32畑1)。照射后，立即更換培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)解育18 小時。細胞毒性采用嚷挫藍(MTT)分析法測定：細胞用含有Img/mL MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小 時。小屯、吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，每孔加入1(Κ)化的二甲亞諷(DMS0)，使紫色結晶物充分溶 解，酶標儀上490nm波長處測定各孔0D值。平均細胞存活率用W下公式計算：
[0111]
[0112]不同濃度的樹形化合物和KB細胞在37°C下解化4小時，用藍光照射后細胞的存活 率(實驗結果通過Μ?Τ分析得到），結果如圖4(A和B)所示。由圖可知，與ALA相比，經(jīng)不同濃度 的樹形化合物處理后，癌細胞的存活率大大降低，表明運些化合物具有比ALA更強的藥效。 五個樹形大分子化合物對邸，MCF-7和MCF-7RS種癌細胞的半致死濃度LDs廟2-15ymol/L之 間，而ALA對運Ξ種癌細胞的半致死濃度大于100皿ol/L。五個樹形大分子化合物的細胞毒 性大小順序與產(chǎn)生光敏劑巧IX的活性順序基本一致。
[0113]最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 含有5-氨基酬戊酸和3-?基化晚-4-酬的樹形化合物，其特征是具有如下結構通式：通式中m>3，n>l。2. 根據(jù)權利要求1所述的含有5-氨基酬戊酸和3-徑基化晚-4-酬的樹形化合物，其特征 是:5-氨基酬戊酸通過其簇基與樹形分子骨架中的徑基形成醋鍵連接。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的含有5-氨基酬戊酸和3-徑基化晚-4-酬的樹形化合物，其 特征是為W下任意一種化合物：4. 如權利要求1~3任一所述的含有5-氨基酬戊酸和3-?基化晚-4-酬的樹形化合物的 制備方法，其特征是包括如下步驟： 1) 、樹形化合物10a的合成： W甲硝基Ξ丙醇為起始原料，經(jīng)乙酷化、硝基還原成氨基、與Boc-β-丙氨酸縮合、脫去 乙酷基、與化Z-ALA成醋、脫去Boc、與含簇基的HPO縮合、最后用催化氨化脫去保護基得到樹 形化合物10a; 2) 、樹形化合物20a的合成： 經(jīng)化oc-β-丙氨酸與胺12(甲氨基Ξ丙酸Ξ叔下醋）縮合、脫去叔下基、與含徑基的HP0 縮合成醋、脫去Fmoc、與二簇酸18縮合、再與化合物8縮合、最后用催化氨化脫去保護基得到 樹形化合物20a; 3) 、樹形化合物25a的合成： WALA甲基醋為起始原料，經(jīng)與化zA-苯丙氨酸縮合、將甲基醋水解、與化合物5縮合成 醋、脫去Boc、與含簇基的冊0縮合、最后用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物25a; 4) 、樹形化合物29a的合成： WALA甲基醋為起始原料，經(jīng)與化zA-甲硫氨酸縮合、將甲基醋水解、與化合物5成醋縮 合、脫去Boc得到化合物28;化合物5與含簇基的HP0縮合、脫去Boc、與二簇酸18縮合得到化 合物19C;28與19C縮合、再用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物29a; 5) 、樹形化合物30a的合成： 19H與化合物28縮合、再用催化氨化脫去保護基得到樹形化合物30a。5. 如權利要求1、2或3所述的含有5-氨基酬戊酸和3-徑基化晚-4-酬的樹形化合物的用 途，其特征是:用于制備光動力學治療藥物。6. 根據(jù)權利要求5所述的含有5-氨基酬戊酸和3-徑基化晚-4-酬的樹形化合物的用途， 其特征是：用于制備治療基底細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚癌、肺癌、尖銳濕痛、乳腺癌、口腔表 皮樣癌的光動力學治療藥物。
【文檔編號】A61K31/444GK106083706SQ201610388878
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610388878.6, CN 106083706 A, CN 106083706A, CN 201610388878, CN-A-106083706, CN106083706 A, CN106083706A, CN201610388878, CN201610388878.6
【發(fā)明人】周濤, 思南·貝托, 羅伯特·海德, 亞力山大·麥克羅伯特
【申請人】浙江工商大學