酸甲酯的合成
[0057] 方案2步驟B :在22°C以滴加方式向攪拌的硅膠（200g，3. 33mol)和二氯甲烷 (IlOOmL)的混合物中加入高碘酸鈉（56. 2g，260mmol)在水（352mL)中的溶液。在添加結(jié) 束后，將該混合物再攪拌30分鐘，然后加入3-苯氧基-1，2-丙二醇（34. 5g, 195mmol)，導(dǎo) 致適度放熱。將該混合物再攪拌30分鐘，然后過濾以除去固體，棄去水層，用MgSO4干燥 有機(jī)層，過濾以除去固體，用4-[(1幻-1-[[(31?)-1，2,3,4-四氫異喹啉-3-羰基]氨基] 乙基]苯甲酸甲酯（44g，130mmol)處理濾液。然后分小部分加入三乙酰氧基硼氫化鈉 (57. 4g，260mmol)。在添加完成時(shí)，將該混合物再攪拌1小時(shí)，然后加入水（200mL)。加入 32%氨水溶液，直到水層的pH達(dá)到10。分離各層，用MgSO4干燥有機(jī)層，過濾以除去固體， 減壓濃縮濾液。將得到的粗油狀物溶于TBME (300mL)，然后加入水（250mL)和IM鹽酸水溶 液（200mL)。將得到的淤漿攪拌30分鐘，減壓濃縮以除去TBME，通過過濾分離得到的白色 沉淀。將該沉淀傾入攪拌的水（400mL)和TBME(400mL)的混合物中，加入32%氨水溶液，直 到水層的pH達(dá)到10。除去水層，用飽和氯化鈉水溶液（200mL)洗滌有機(jī)層。分離有機(jī)層， 用MgSO4干燥，過濾以除去固體，減壓濃縮。使得到的粗物質(zhì)進(jìn)行使用30% - 70% EtOAc/ 己烷梯度的硅膠快速色譜。合并包含產(chǎn)物的級(jí)分，減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物，為白色固體 (44g，74%收率）。質(zhì)譜（m/z) :459([M+H]+)。
[0058] 制備 4
[0059] 4-[(lS)-1-[[(3R)-l，2,3,4-四氫異喹啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯鹽 酸鹽的合成
[0061] 方案2步驟A:將（3R)-3-「「（lS)-1-(4-甲氣基羰基苯基）乙基]氨基甲酰 基]-3, 4-二氫-IH-異喹啉-2-甲酸叔丁酯（5. 5g，12. 5mmol)溶于4M氯化氫的1，4-二噁 烷溶液（30mL，120_〇1)。將該混合物在室溫?cái)嚢柽^夜，然后減壓濃縮該混合物，得到標(biāo)題化 合物，為白色固體（4.70g，100% 收率）。質(zhì)譜（m/z) :339([M+H]+)，677([2M+H]+)，699([2M+ Na]+)。
[0062] 制備 5
[0063] 4- [ (IS) -I- [[ (3R) -2- (2- (4-氟苯氧基）乙基）-3, 4-二氫-IH-異喹啉-3-羰基] 氨基]乙基]苯甲酸甲酯的合成
[0065] 方塞向 4-[(IS)-I-[[(3R) _1，2, 3, 4-四氫異喹啉-3-羰基]氨基]乙 基]苯甲酸甲酯鹽酸鹽（800mg, 2. 13mmol)和2-(4-氟苯氧基）乙醛（493mg, 3. 2mmol)在 1，2-二氯乙烷（10.7mL)中的混合物中加入三乙酰氧基硼氫化鈉（633mg，2.99mm〇l)，將該 混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。加入飽和NaHCO3水溶液（25mL)，用乙酸乙酯（2 X 25mL)萃取水層。 用飽和NaCl水溶液洗滌合并的有機(jī)層（25mL)，用MgSO4干燥有機(jī)相，過濾，減壓濃縮。使得 到的粗物質(zhì)進(jìn)行使用〇% - 60% EtOAc/己烷梯度的硅膠色譜。合并包含產(chǎn)物的級(jí)分，然后 減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物，為無色泡沫（550mg，54%收率）。質(zhì)譜（m/z) :477([M+H]+)。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 4- [ (IS) [ [ (3R) (2-苯氧基乙基）-3, 4- 一氛 _1H-異卩奎琳幾基]氣基] 乙基]苯甲酸的合成
[0069] 萬案 3 步驟 A :將 4-[(lS)-l-[[ (3R) (2-苯氧基乙基）-3, 4- 一氛 _1H-異陸 啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯（41. 5g，90. 5mmol)、THF(291mL)和2M氫氧化鈉水 溶液（181mL，360mm〇l)的混合物在40°C攪拌過夜。減壓濃縮以除去THF。加入水（200mL)， 然后用TBME (2 X 200mL)洗滌水層。將水層冷卻至5°C，在攪拌下加入濃鹽酸水溶液，直到pH 達(dá)到2 (正如通過pH試紙分析評(píng)估）。在攪拌下，將該混合物在30分鐘內(nèi)溫?zé)嶂潦覝?，然?過濾分離固體。將該固體加入到水（500mL)中，加熱至80°C達(dá)1小時(shí)。將該混合物冷卻至 室溫，過濾分離固體，在45°C真空烘箱干燥固體過夜。將該固體加入到乙酸異丙酯（300mL) 中，劇烈攪拌5h。過濾分離固體，減壓干燥固體，得到標(biāo)題化合物，為白色固體（26g，60%收 率）。質(zhì)譜（m/z) :445([M+H]+)。
[0070] 實(shí)施例2
[0071 ] 4- [ (IS) -I- [[ (3R) -2- (2- (4-氟苯氧基）乙基）-3, 4-二氫-IH-異喹啉-3-羰基] 氨基]乙基]苯甲酸鹽酸鹽的合成 [0072]
[0073] 萬案 3 步驟 A :將 4_ [ (IS) -1- [[ (3R) _2_ (2_ (4_ 氣苯氧基）乙基）_3, 4_ 二 氫-IH-異喹啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯（550mg, I. 15mmol)溶于甲醇（IOmL) 和四氫呋喃（IOmL)的混合物，加入5N氫氧化鈉水溶液（0.462mL，2.31mmol)，然后在室 溫?cái)嚢柽^夜。減壓濃縮該混合物，得到白色固體。加入4M氯化氫的1，4-二噁烷溶液 (10mL，40mmol)，將該混合物在室溫?cái)嚢鑜Omin。過濾除去混懸的固體，用THF(5mL)沖洗該 固體。減壓濃縮合并的濾液，得到白色固體。將該物質(zhì)在熱乙醚（IOmL)中研磨，過濾，得到 標(biāo)題化合物，為白色固體（535mg，93%收率）。質(zhì)譜（m/z) :463([M+H]+)，485([M+Na]+)。
[0074] 體外與人EP1、EP2、EP3和EP4的結(jié)合
[0075] 由穩(wěn)定表達(dá)人 EPl (Genbank 登記號(hào) AY275470)或 EP4 (Genbank 登記號(hào) AY429109) 受體的重組HEK293細(xì)胞制備hEPl和hEP4膜。由用EP2(Genbank登記號(hào)AY275471)或 EP3 (同種型VI :Genbank登記號(hào)AY429108)受體質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞制備hEP2和 hEP3膜。使用Teflon/玻璃勻化器在勻化緩沖液中勻化冷凍的細(xì)胞沉淀。等分膜蛋白，用 干冰速凍，然后儲(chǔ)存在-80°C。勻化緩沖液（參見例如Mauback，K.A.，British Journal of Pharmacology. 156:316-327(2009))包含 IOmM Tris-HCl，pH 7. 4、250mM 蔗糖、ImM EDTA、0.3mM 吲噪美辛+Complete?和 EDTA，得自 Roche Molecular Biochemicals(目錄號(hào) 1697498)〇
[0076] 通過飽和結(jié)合研究或同源性競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定[3H] -PGE^合每種受體的K ,值。在96-孔 格中使用3-倍稀釋系列測(cè)試化合物，以生成10-點(diǎn)曲線。將稀釋的化合物與20 μ g/孔EP1、 10 μ g/ 孔 ΕΡ2、1 μ g/ 孔 EP3 或 10 - 20 μ g/ 孔 EP4 膜一起在 25°C、在 0· 3 - 0· 5nM[3H]-P GE2(PerkinElmer, 118 - 180Ci/mmol)存在下溫育90分鐘。結(jié)合反應(yīng)使用0. 5mL聚苯乙稀 96-孔深孔板、在 200 μ L MES 緩沖液（IOmM MES pH 6.0,與 KOHUOmM MgCljP ImM EDTA) 中進(jìn)行。通過比較在2 μΜ PGE2存在下和不存在下的結(jié)合，計(jì)算非特異性結(jié)合率。通過過 濾（TomTek harvester)收集膜，用冷緩沖液（IOmM MES pH 6.0 與 KOHUOmM MgCl2)洗滌 4次，6〇°C烘箱干燥，使用TopCount?檢測(cè)器將放射性定量為計(jì)數(shù)/分鐘（CPM)。將特 異性結(jié)合百分比計(jì)算為沒有任何抑制劑存在下的結(jié)合的百分比，對(duì)2 μΜ PGE2存在下的非 特異性結(jié)合校準(zhǔn)。使用所示的4-參數(shù)非線性邏輯方程（Abase方程205)分析數(shù)據(jù)：y = (A+((B-A)/(l+((C/x) ~D))))，其中y = %特異性抑制，A =曲線基礎(chǔ)值；B =曲線峰值；C = 相對(duì)IC5。=基于從峰值至基礎(chǔ)值的數(shù)據(jù)范圍導(dǎo)致50%抑制的濃度；D =希爾斜率=曲線的 斜率。來自IC5。值的K1轉(zhuǎn)化率（K1= IC5(/(l+[L]/Kd)，其中[L]是配體濃度）。
[0077] 表1 :實(shí)施例1和2與人EP1、EP2、EP3和EP4的體外結(jié)合
[0078]
[0079] 按照基本上如上所述的方法測(cè)試化合物。表1中的數(shù)據(jù)表明：實(shí)施例1和實(shí)施例 2的化合物以亞納摩爾濃度結(jié)合hEP4。表1中的數(shù)據(jù)還表明：實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合 物對(duì)hEP4的結(jié)合強(qiáng)度超過對(duì)hEPl、hEP2和hEP3的結(jié)合強(qiáng)度，顯示了對(duì)于hEP4受體的選擇 性。
[0080] 體外人EP4功能件桔抗劑活件
[0081] 在穩(wěn)定表達(dá)人EP4受體的重組HEK293細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)定。通過在補(bǔ)充了 10%胎牛 血清（FBS)、ImM丙酮酸鈉、IOmM HEPES、500 μ g/mL遺傳霉素和2mM