含氨基抗生素納米分子印跡聚合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微量物質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含氨基抗生素納米分子印跡聚合物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素是一種由微生物自身產(chǎn)生或人工合成、低濃度下能抑制微生物生產(chǎn)或殺滅其他微生物的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了用于人類和動(dòng)物細(xì)菌性感染疾病的治療，抗生素也被作為促長劑和飼料添加劑在集約化畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中大量應(yīng)用，隨著大量抗生素的使用，越來越多不能被充分吸收利用的抗生素通過人畜糞便直接排出，這些含抗生素的糞便可通過有機(jī)肥料的施用進(jìn)入農(nóng)田與植物之間發(fā)生迀移，此外這些抗生素有可能通過滲透、徑流、淋溶等方式迀移到地表水和地下水中，重新流入環(huán)境。
[0003]目前監(jiān)測抗生素殘留檢測方法主要有微生物法、免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。微生物法簡單快速，但檢測限高，特異性差；色譜檢測法耗時(shí)長、在殘留分離檢測中，樣品前處理過程復(fù)雜，并影響分析的準(zhǔn)確度；免疫檢測法簡單、快速，檢出限低，可進(jìn)行大規(guī)模篩選，但是其相應(yīng)抗體的制備需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且抗體在惡劣環(huán)境下易于失活，影響檢測結(jié)果。
[0004]此外也有采用分子印跡技術(shù)萃取抗生素，然后聯(lián)用色譜質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測，比如用分子印跡固相萃取蜂蜜中的鏈霉素，親水相互作用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測鏈霉素，此分子印跡方法采用沉淀聚合法合成分子印跡聚合物，需在有機(jī)相中合成，反應(yīng)時(shí)間過長，而且合成的聚合物成塊狀，需要經(jīng)過長時(shí)間的打磨、篩分才能用于固相萃取，分子印跡聚合物利用率不高，此外還需聯(lián)用色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)，所需儀器貴重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種含氨基抗生素納米分子印跡聚合物及其制備方法與檢測應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有含氨基抗生素檢測技術(shù)易于失活、檢測結(jié)果不佳等問題。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種含氨基抗生素納米分子印跡聚合物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)固相載體玻璃珠上引入抗生素
[0008]將250?300g玻璃珠加入到120?160mL、I?4mol/L的NaOH水溶液中，加熱沸騰10?15min，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH = 8?9，烘干得到羥基化玻璃珠；
[0009]將羥基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3.3mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，劇烈搖動(dòng)后，室溫下放置過夜，過濾、丙酮沖洗，得到硅烷化玻璃珠；
[0010]將10g硅烷化玻璃珠加入到50mL、pH7.4的PBS中，再加入3.5mL戊二醛，室溫下反應(yīng)2?3h，抽濾，水洗，收集半成品玻璃珠；
[0011]將50mL、pH 7.4的PBS以及25mg含氨基抗生素與半成品玻璃珠混合，劇烈搖動(dòng)后，室溫下放置過夜，過濾、水洗，得到含氨基抗生素衍生的玻璃珠。
[0012](2)合成抗生素印跡的納米印跡聚合物
[0013]將Immol N，N’- 二亞甲基雙丙烯酰胺、25?30mmol N-異丙基丙烯酰胺、18?20mmol N-叔丁基丙烯酰胺和0.0025?0.003mmol丙烯酸按混合并溶于10mL超純水中，通氮?dú)?0?30分鐘，將混合物倒入所述含氨基抗生素衍生的玻璃珠中，然后加入40?60mg過二硫酸銨和13?26 μ L四甲基乙二胺的水溶液，劇烈搖動(dòng)后，室溫下反應(yīng)I?1.5h，反應(yīng)混合物倒入至固相萃取管中，用6?8床的室溫水洗滌玻璃珠，再用80?100mL、60?70熱。C水淋洗，自然冷卻至室溫，用微孔超離心過濾裝置離心分離得到含氨基抗生素納米分子印跡聚合物溶液。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述含氨基抗生素納米分子印跡聚合物在檢測含氨基抗生素方面的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選地，所述含氨基抗生素的檢測包括以下步驟:
[0016](I)酶標(biāo)物辣根過氧化物酶-模板分子HRP-T的合成
[0017]將5?1mg辣根過氧化物酶溶于0.7?1.0mL, pH6.0的MES緩沖液中，再加入
0.2?0.4mgEDC和0.3?0.6mg NHS，室溫下反應(yīng)15min，用微孔超離心過濾裝置3500rpm轉(zhuǎn)速下分離除去緩沖液，用3?5mL、pH 7.40的PBS洗滌，收集活化后的辣根過氧化物酶，立即與1mL含8?1mg氨基抗生素的PBS液孵化2?3h，然后用4.0?5.0mL PBS緩沖液洗去未聯(lián)接的抗生素，用微孔超離心過濾裝置在轉(zhuǎn)速3500rpm下分離得到酶標(biāo)物HRP-T溶液；
[0018](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖制作
[0019]通過酶聯(lián)免疫競爭吸附法測定不同濃度含氨基抗生素的吸光度，建立抗生素濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0020](3)含氨基抗生素的檢測
[0021]將預(yù)處理后的待檢測物通過酶聯(lián)免疫競爭吸附法測定含氨基抗生素的吸光度，根據(jù)該吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線圖比對，獲取待檢測物中含氨基抗生素的類型和濃度；
[0022]在步驟(2)和(3)中，所述酶聯(lián)免疫競爭吸附法具體為:將40 μ L、濃度為0.04?
0.06mg/ml的權(quán)利要求書I所述含氨基抗生素納米分子印跡聚合物溶液包被在96孔酶標(biāo)板中；在室溫下?lián)]發(fā)至干，用PBS溶液洗滌，加入含有200?300 μ L含質(zhì)量濃度為I %的表面活性劑Tween 20和質(zhì)量濃度為0.1 %的牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，孵化Ih，用PBS溶液洗滌，然后每個(gè)孔中加入60?100 μ L的酶標(biāo)物HRP-T溶液和含氨基抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液室溫下孵化Ih，用含有質(zhì)量濃度為I %的Tween 20和質(zhì)量濃度為0.1 %的BSA的PBS溶液洗滌，加入60?100 μ LTMB試劑反應(yīng)2?1min,加入0.5mol/L、60 -1OOyL H2SO4溶液終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀讀取器讀取450nm處每個(gè)微孔溶液的吸光度。
[0023]4、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(2)之前，還包括酶聯(lián)免疫競爭吸附法的條件優(yōu)化步驟，所述酶聯(lián)免疫競爭吸附法的條件優(yōu)化步驟具體過程為:
[0024]包被:取30?50 μ L、濃度為0.04?0.06mg/ml權(quán)利書要求書I中所述氨基抗生素印跡的納米聚合物溶液至96孔酶標(biāo)板中；在室溫下?lián)]發(fā)至干，用PBS溶液洗滌；
[0025]封閉:加入含有300 μ L含表面活性劑Tween 20質(zhì)量濃度為0.5?3%和牛血清白蛋白BSA質(zhì)量濃度為0.05?0.3%的PBS溶液，孵化I?2h ;然后再用300 μ L PBS溶液洗滌3次；
[0026]加樣:加入100 μ L酶標(biāo)物HRP-T溶液，孵化2h ；
[0027]顯色與測定:用含有質(zhì)量濃度為0.5?3%的Tween 20和質(zhì)量濃度為0.05?
0.3%的BSA的PBS溶液洗滌，甩干，加入100 μ LHRP底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)試劑，孵化1min后，加入0.5mol/L H2SO410 μ L溶液終止顯色反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定其在450nm處的吸光度，確定最優(yōu)檢測參數(shù)。
[0028]5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(3)中，所述待檢測物為肉類，所述肉類包括魚類、雞肉；該肉類的預(yù)處理包括:魚類樣品去鱗、去皮，沿背脊取肌肉；雞肉類樣品去皮去骨，取肌肉部分。樣品均質(zhì)處理成肉糜狀的待測試樣。準(zhǔn)確稱取試樣，置于聚苯乙稀離心管中，加入酸化乙腈，均質(zhì)處理，漩禍混合，超聲波提取，以4000r/min離心5?1min,上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中；減壓蒸發(fā)溶劑，用PBS緩沖液復(fù)溶，得到含氨基抗生素的PBS緩沖液。
[0029]優(yōu)選地，在步驟(3)中，所述待檢測物為牛奶，所述牛奶的預(yù)處理為:取牛奶進(jìn)行離心分離，收集上層清液，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中；減壓蒸發(fā)溶劑，用PBS緩沖液復(fù)溶，得到含氨基抗生素的PBS緩沖液。
[0030]優(yōu)選地，在步驟(3)中，所述待檢測物為水，所述水的預(yù)處理為:0.45um濾膜除去懸浮物，收集上層清液，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中；減壓蒸發(fā)溶劑，用PBS緩沖液復(fù)溶，得到含氨基抗生素的PBS緩沖液。
[0031]優(yōu)選地，所述含氨基抗生素包括鏈霉素、慶大霉素以及新諾明。
[0032]相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明所采用的固相法合成抗生素印跡的納米分子印跡聚合物可直接代替抗體，用仿生酶聯(lián)免疫吸附法測定水中和食物(牛奶，雞肉、豬肉、魚肉、雞蛋等)中的磺胺類、氨基糖苷類、頭孢菌素等含有氨基的抗生素，不僅可以避免以上方法的缺陷，而且此方法樣品的前處理簡單，不需要進(jìn)行分離，簡單快速、檢測特異性高，檢出限低，此外，含氨基類抗生素印跡的納米聚合物作為仿生抗體，一個(gè)月內(nèi)其檢測效果不變。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034]實(shí)施例1含氨基抗生素納米分子印跡聚合物溶液的制備
[0035](I)固相載體玻璃珠上引入抗生素
[0036]將250g玻璃珠加入到120mL、lmol/L的NaOH水溶液中，加熱沸騰15min，取出玻璃珠用水洗至洗液的PH = 8，烘干得到羥基化玻璃珠；
[0037]將羥基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3.3mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，劇烈搖動(dòng)后，室溫下